微生物的生长繁殖及其控制
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第六章
微生物的生长繁殖
及其控制
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第一节细菌的生长
一、相关概念及特点
生物个体细胞物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长：
繁殖：
生物个体生长到一定阶段，通过
特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。
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生长是一个逐步发生的量变过程，
繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。
在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单
细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划
分的过程。
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一个微生物细胞
合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。
如果同化作用的速度超过了异化作用
个体的生长
原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加
如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就
会发生繁殖，引起个体数目的增加。
群体内各个个体的进一步生长
群体的生长
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微生物生长:
在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）
在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与
研究大生物时有所不同。
个体生长→个体繁殖→群体生长
群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
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微生物生长：
单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化
个体计数
群体重量测定
群体生理指标测定
微生物生长的测定：
评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；
评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；
客观地反映微生物生长的规律；
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二、以数量变化对微生物生长情况进行测定（P151）
1、培养平板计数法
通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况
或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）
2、膜过滤培养法
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样
品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形
成的菌落进行统计。
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3、液体稀释法（ The most probable number method ）
主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。
对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度
平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统
计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算
出样品中的微生物数目。
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4、显微镜直接计数法
1）常规方法：
采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。
缺点：
不能区分死菌与活菌；
不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；
个体小的细菌在显微镜下难以观察；
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显微镜测数法
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4、显微镜直接计数法
2）其它方法：
比例计数：
将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细菌细胞浓度的样品混匀
后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。
过滤计数：
当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品
通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显
微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；
活菌计数：
采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数
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三、以生物量为指标测定微生物的生长
1、比浊法
在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。
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2、重量法
以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；
通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算
微生物群体的生物量；
测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法
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3、生理指标法
微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、
生物热等与其群体的规模成正相关。
样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，
因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量
热计等设备来测定相应的指标。
常用于对微生物的快速鉴定与检测
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第二节
细菌的群体生长繁殖
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微生物的特点：
个体微小
肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个
单个的微生物组成的群体。
微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。
对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础
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一、分批培养
1 、分批培养的概念
采用完全封闭的容器，一次接种，静置培养。（不更换培养基的培养方法）
特点：固定的营养物质
结果：细菌在一个容积有限的环境中不可能无限制地高速生长。分批培养中细菌的生长在短期内表现明显的规律性-------细菌的生长曲线。
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2、分批培养中细菌群体的生长
——生长曲线在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。
生长曲线(Growth Curve)：
细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。
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生长曲线的制作
（P136图6-2）
将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。
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典型的生长曲线（Growth curve）
稳定期
衰亡期
对数期
延滞期
时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同
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根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：
缓慢期对数期稳定期衰亡期
各时期的特点
1.延缓期
2.对数期
3.稳定期 4 衰亡期
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分析：造成细胞死亡的原因有哪些？
分批培养有什么缺点？
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迟缓期的特点：
分裂迟缓、代谢活跃
●细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞
●的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞
●体积最大
●细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、
●酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。
对外界不良条件反应敏感。
细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓
在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。
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延滞期(滞留适应期）
●特点
●生长速率常数R = 0
●细胞形态变大或增长
●细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈碱性。
●合成代谢活跃，易产生诱导酶。
●对外界不良条件反应敏感
思考:研究滞留适应期长短的意义
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★影响延迟期长短的因素
◆菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短；
◆接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期；
◆接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10
的接种量）；
◆培养基成分：◇在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生
长时短；◇接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。
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调整代谢
迟缓期出现的原因：
微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。
迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。
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认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义
◆在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期
采取的缩短lag phase 的措施有：
①增加接种量；（群体优势----适应性增强）
②采用对数生长期的健壮菌种；
③调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。
④选用繁殖快的菌种
◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌
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对数期(指数生长期)(Log phase)：
●特点
●R最大，增代时间（代时G）或倍增时间最短。
●细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀。
●酶系活跃，代谢旺盛。
●对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、
代时稳定，是研究微生物基本代谢的良好材料。
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影响微生物增代时间（代时）的因素：
1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；
2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短
3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，
4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。
凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成
分，就称为生长限制因子。
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（P137）
例: 某菌正处于对数期，在60分钟时取样，测菌数为100/ml，在160分钟时取样，测菌数为10000/ml，求它的世代时间。
在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time)，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time)。
代时通常以G表示。
t1 – t0
G = ——————
n
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大肠杆菌在37℃的牛奶中每12.5分钟繁殖一代，假设牛奶消毒后，大肠杆菌的含量为1个/100ml，请问按国家标准（30000个／ml），该消毒牛奶在37℃下最多可存放多少时间？
（lg3=0.477,lg2=0.301）
(1)先求出达到30000个/ml的繁殖世代数（n）
lgNt-lgN0
6.477-0
lg(3×106)-lg1
n=
=
21.25
=
=
lg2
lg2
0.301
(2)求出时间（t）
t =nG=21.25×12.5=269分钟=4.48（h）
一块馒头上有一个细菌，细菌的繁殖速度按每30分钟繁殖一代计算，
试计算一下48小时后细菌的数目？
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应用意义
①由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；
②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度；
③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期；
④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。
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一些细菌的代时
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稳定期(最高生长量期)
细胞重要的分化调节阶段；
储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然
感受态等。也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗
生素的大量形成也在此时期。
生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、
调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长
期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。
稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数
最高并维持稳定。菌体产量达到了最高值。
稳定生长期(Stationary phase)：
由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜
于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等
于细菌死亡数)。
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稳定期(最高生长量期)
●特点
●R = 0，菌体产量达到最高点。
●细胞开始储存糖原、异染颗粒和脂肪等储藏物。
●以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期。
●稳定期到来的原因
●营养物尤其是生长限制因子的耗尽；
●营养物的比例失调；
●有害代谢产物累积；
●pH、氧化还原电势等物化条件不适宜。
思考:细菌数量增加率为0的原因?
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●应用意义：
●1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产
量，措施如下：
●补充营养物质（补料）
●调pH
●调整温度
2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。
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微生物生长与代谢产物形成的关系
微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一
致的。一般认为：
初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；
次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰
亡期。
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衰亡期(Decline或Death phase)：
细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。
细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。
营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生
速率，整个群体呈现出负增长。
该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分
细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。
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衰亡期
●特点
●个体死亡速度 > 新生速度，群体呈现负生长；
●细胞形态多样；
●细胞产生自溶；
●产生或释放抗生素；
●芽孢杆菌中芽孢的释放。
●衰亡期到来的原因
环境条件越来越不利，从而引起细胞内分解代谢大大超过合成代谢，导致菌体死亡。
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小结
什么时期细菌细胞生长速度最快
对数生长期
什么时期世代时间短而稳定
对数生长期
什么时期细菌细胞代谢活性最强
对数生长期
什么时候细菌细胞总数最多
最高生长量
什么时期菌体代谢产物最多
最高生长量
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主要生长参数（P137）
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3、二次生长
在培养液中同时存在两种均能为微生物
利用的主要营养物质时，微生物将首先利用
其中较易利用的营养物质开始生长，进入稳
定期后微生物经短暂的适应后将利用第二营
养物质再次开始新的对数期增长并进入稳定
期，从而表现为二阶段式的双峰生长曲线。
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不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH+4等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。
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分解代谢物阻遏
指细胞内同时有两种分解底物存在时，利用快的那种底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。例如有人将大肠杆菌培养在含乳糖和葡萄糖的培养基上，发现该菌可优先利用葡萄糖，并于葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，这就产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”其原因是，葡萄糖的存在阻遏了分解乳糖酶系的合成。这一现象称葡萄糖效应。由于这类现象在其他代谢中普遍存在，后来人们索性把类似葡萄糖效应的阻遏统称为分解代谢物阻遏。
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●活
●菌
●数
●
●时间
●大肠杆菌的二次生长曲线
乳糖耗尽
乳糖耗尽
葡萄糖耗尽
葡萄糖耗尽
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4、同步生长
同步培养(Synchronous culture)：
使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶
段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。
同步生长：
以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时
进行分裂的生长。
通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物
同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传
特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。
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●获得同步生长的方法
●环境条件诱导法
●改变环境条件，用控制温度、光线、培养基成分、或者用能够影响细胞周期中主
要功能的代谢抑制剂等条件，诱导同步生长。
●机械筛选法：选择性过滤法、密度梯度离心法或膜洗脱法等。
●原理：在非同步生长的微生物中，微生物处于不同的生长阶段，体积、大小和重
量不一，可用不同孔径的滤膜过滤或密度梯度离心，选出同一生长阶段的微生物。同步生长曲线——阶跃性曲线
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同步培养生长曲线特点
群体生长是一次性跳跃过程
维持的代数1-2代（？）
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二、连续培养
连续培养(Continous culture ）
在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。
培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。
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恒浊连续培养
不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定
控制连续培养的方法
恒化连续培养
保持恒定的流速
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1、恒浊连续培养
测定所培养微生物的光密度值
自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速
使培养物维持在某一恒定浊度
当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；
当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；
恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的
如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。
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1、恒浊连续培养
通过控制流速可以得到生长速率不同但密度基本恒定的培养物
细菌生长速率不仅受流速的控制，也与菌种种类、培养基成分以及培养条件有关。
可以不断提供具有一定生理状态的细胞；可以得到以最高生长速率进行生长的培养物。在发酵工业中，为了获得大量菌体以及与菌体相平行的代谢产物时，使用此法有较好的经济效益。
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2、恒化连续培养
使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高
生长速率下进行生长繁殖。
限制性因子必须是机体生长所必需的营养物质，如氨基酸和氨等氮
源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，因而可在一定浓度
范围内决定该机体生长速率。
恒化连续培养中，必需将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，
以作为限制性因子，而其他营养物均过量。
（细菌的生长速率取决于限制性因子的浓度，并低于最高生长速率）
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2、恒化连续培养
多用于科研
遗传学：突变株分离；
生理学：不同条件下的代谢变化；
生态学：模拟自然营养条件建立实验模型；
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连续培养法用于工业发酵就称为连续发酵
连续发酵与单批发酵相比的优点：
缩短发酵周期，提高设备利用率；
便于自动控制；
降低动力消耗及体力劳动强度；
产品质量较稳定；
缺点：杂菌污染和菌种退化、营养物利用率低
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乳糖耗尽
恒浊连续培养
恒化连续培养
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恒浊器与恒化器的比较
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分批培养与连续培养特征的比较
不同点：分批培养：经历四个时期
连续培养：理论上,对数生长期
相同点：群体培养特征
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分批培养与连续培养的关系
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第三节
真菌的生长与繁殖
自学
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第四节微生物生长的环境条件
微生物生长最适环境条件的选择应根据菌种特性、生产工艺要求而定营养物，包括氧广义上也是环境条件，但通常是指：温度、酸碱度、渗透压、氧化还原电位、表面张力、 CO2含量等，对斜面来说，还有湿度问题，湿度影响孢子的形成
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极端环境条件对微生物的影响死亡
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一. 温度的影响和选择
●湿热灭菌：121OC 30min 干热灭菌：160~170OC 1~2h
●为什么？
●微生物生长是一系列复杂化学反应的结果，温度升高能加快化学反应，影响微生物生
长速率
●温度每增加10C，生长速率近似增加一倍
●微生物的最低、最适和最高生长温度
●低温对微生物生长的影响，与菌种特性、菌龄和受冷方式有关
●菌龄：不同时期，受冷方式：缓慢致冷或突然致冷
热蒸汽的穿透力较热空气强，且蛋白质含水量越高，越易于凝固
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嗜冷菌、中温菌、嗜热菌的典型生长与温度关系幻灯片72
E. coli的比生长速率与温度关系 Arrhenius曲线幻灯片73
高温使蛋白质、核酸
等重要生物大分子发
生变性、破坏，以及
破坏细胞膜上的类脂
成分，导致微生物死亡。
温度愈高，十倍致死时间愈短
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火焰灼烧法
干热灭菌法
烘箱内热空气灭菌法
高温灭菌
湿热灭菌（消毒）法
巴氏消毒法：LTH法、HTST法
常压下
煮沸消毒法
间歇灭菌法
常规加压灭菌法
加压下
连续加压灭菌法
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