分子发光分析法(精)

第五章分子发光分析法

基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。

第一节荧光分析法

一、概述

分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。

早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。1867年

Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。

荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。

二、基本原理

(一)分子荧光的产生

大多数分子含有偶数电子。根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。处于电子激发态的分子是不稳定的，它会很快地通过无辐射跃迁和辐射跃迁释放能量而返回基态。辐射跃迁发生光子的发射，产生分子荧

光和分子磷光；无辐射跃迁则以热的形式释放能量，包括振动弛豫(VR)、内转化(ic)和体系间窜跃(isc)等。图5-1为分子内所发生的各种光物理过程的示意图。

图5-01 分子内的光物理过程.doc图5-01 分子内的光物理过程.JPG

图5-1 分子内的光物理过程A1,A2-吸收F-荧光P-磷光ic-内转化isc-体系间窜跃VR-振动弛豫

振动弛豫是在同一电子能级中，分子由较高振动能级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁。振动弛豫过程的速率极大，在10-14～10-12s内即可完成。

内转化是相同多重态的两个电子态之间(如S2→S1,S1→S0)的非辐射跃迁。内转化过程的速率在很大程度上决定于相关能级之间的能量差。相邻单重激发态之间能级较近，其振动能级常发生重叠，内转化很快。因此，通常不论分子被激发到哪一个电子激发态，在10-13～10-11s内经内转化和振动弛豫都会跃迁到最低电子激发态的最低振动能级上。基态(S0)和第一电子激发单重态(S1)之间的能量差较大，因而S1→S0内转化的速率相对要小得多，使得第一电子激发态有相对较长的寿命。

处于第一电子激发单重态最低振动能级的分子，以辐射跃迁的形式返回基态各振动能级时，就产生了分子荧光。由于激发态中存在有振动弛豫和内转化现象。使得荧光的光子能量比其分子受激发所吸收的光子能量低。因此，荧光波长λ3总比激

发波长λ1或λ2要长。而且，不论电子开始被激发至哪个能级，都将只发射波长为λ3的荧光。荧光的产生在10-9～10-6s内完成。

体系间窜跃是指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁。当分子的第一、二电子处于激发三重态(2S+1=3)时，以T l、T2表示。单重激发态S l的最低振动能级同三重态T1的较高振动能级重叠。因而S1→T1的体系间窜跃就有了较大的可能性。第一电子激发单重态的分子经体系间窜跃到达三重态后，快速振动弛豫至最低振动能级v=0上。此时有两种途径返回基态，一是辐射跃迁发出磷光，二是体系间窜跃。由于改变电子自旋的跃迁属禁阻跃迁，因而跃迁速率小得多，使得三重态有较长的寿命，约为10-3～10 s

(二)荧光效率及其影响因素

1．荧光效率物质在吸收了紫外和可见光后，激发态分子是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁回到基态，决定了物质是否能发荧光。通常以荧光效率(或荧光量子产率)来描述辐射跃迁概率的大小。荧光效率定义为发荧光的分子数目与激发态分子总数的比值，即

()激发态分子总数发荧光的分子数荧光效率=f ? (5—1)

荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也就越强，若以各种跃迁的速率常数来表示，则

i K K K ∑+=f f

f ? (5—2)

式中：K f 为荧光发射过程的速率常数，∑K i 为非辐射跃迁的速率常数之和。一般来说，K f 主要取决于物质的化学结构。而∑K i 则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。具有分析应用价值的荧光化合物，其荧光效率在0.1～1之间。

2．荧光与分子结构的关系 首先，物质只有能够吸收紫外—可见光。才有可能发荧光。因此，发荧光的物质分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基团，且共轭体系越大，π电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。大部分能发荧光的物质都含有一个以上的芳环，随共轭芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波长方向移动。如萘的荧光效率为0.29，荧光波长为310 nm ，而蒽的荧光效率为0.46，荧光波长为400 nm 。

其次，分子的刚性平面结构有利于荧光的产生。以荧光黄和酚酞为例，二者结构十分相似，但荧光黄在0.1mol·L -1NaOH 溶液中的荧光效率高达0.92。而酚酞由于没有氧桥，分子不易

保持刚性平面，不易产生荧光。刚性平面结构可以减少分子的振动相碰撞去活的可能性。

一些有机配位剂与金属离子形成螯合物后荧光大大增强，这也可用刚性结构的影响来解释。例如，8—羟基喹啉本身荧光较弱，与Mg2+形成螯合物后则是强荧光化合物。再如，滂铬BBR本身不发荧光，与Al3+在pH＝4.5时形成的螯合物发红色荧光。

Al3+-滂铬BBR螯合物.JPG

取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。给电子取代基如―OH、―NH2、―NR2和―OR等可使共轭体系增大，导致荧光增强；吸电子取代基如―COOH、―NO和―NO2等使荧光减弱，例如，苯胺和苯酚的荧光较苯强，而硝基苯为非荧光物质。

随着卤素取代基中卤素原子序数的增加，物质的荧光减弱，而磷光增强。这种所谓的“重原子效应”是由于重原子中能级交叉现象严重，容易发生自旋轨道偶合作用，使S1→T1的体系间窜跃显著增加所致。

3．环境因素对荧光的影响同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质。一般来说，电子激发态比基态具

有更大的极性。溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。例如，奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。

温度对于溶液荧光强度的影响非常显著。通常认为，辐射跃迁的速率基本不随温度而变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著地增大。因此，对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光影响比荧光更大。

大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大。共轭酸碱两种型体具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种型体，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长，例如：

不同共轭体系的荧光.JPG不同共轭体系的荧光.doc

溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。

由于氧分子的顺磁性质，溶液中溶解氧的存在，使激发单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。其它顺磁性物质也有这种作用。

(三)荧光强度与溶液浓度的关系

根据荧光效率的定义，荧光强度I f 应为所吸收的辐射强度I a 与荧光效率φf 的乘积：

I f = φf I a =φf (I 0-I )

由于 I I A 0

lg = I =I 0·10-A

可得 I f =φf I 0(1-10-A )

()()??????--= !33.2!22.3--3.2320f f A A A I I ? (5―3)

如果溶液很稀，吸光度A <0.05，方括号中其它各项与第一项相比均可忽略不计，则上式可简化为

I f =2.3φf I 0A=2.3φf I 0kbc (5—4)

可见，当A <0.05时，荧光强度与物质的荧光效率、激发光强度、物质的摩尔吸收系数和溶液的浓度成正比。对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，荧光强度只与溶液浓度有关：

I f =Kc (5―5)

上式为荧光定量分析的基本依据。以荧光强度对荧光物质的浓度作图，在低浓度时，呈现良好的线性关系。当荧光物质

的溶液浓度较高时，荧光强度同浓度之间的线性关系将发生偏离，有时甚至随溶液浓度增大而降低(图5-02 荧光强度与溶液浓度的关系.JPG图5-2)。导致标准曲线弯曲的原因，除了式(5-3)中的高次项影响外，还存在猝灭效应。

荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物质、称为荧光猝灭剂。前面提到的氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂。由荧光物质自身引起的荧光强度减弱的现象称为荧光自猝灭效应。经常遇到的自猝灭现象有两种。一种是当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。另一种是由于激发态分子之间的碰撞，导致非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。很显然，不论哪种情况，增大荧光物质的浓度均会使荧光猝灭效应增强，从而导致标准曲线向浓度轴弯曲，即使荧光强度降低。

(四)荧光的激发光谱和发射光谱

以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强的波长处测量荧光强度，以激发波长为横坐标。荧光强度为纵坐标绘

制关系曲线，便得到荧光激发光谱。激发光谱实质上就是荧光物质的吸收光谱。若固定激发光的波长和强度不变，测量不同波长下的荧光强度，绘制荧光强度随波长变化的关系曲线，使得到荧光发射光谱，简称荧光光谱。激发光谱和荧光光谱是荧光测定时选择激发波长和荧光测量波长的依据，也可用于鉴别荧光物质。

三、荧光分析仪器

常用的荧光分析仪器也是由光源、单色器、液槽、检测器和信号显示记录器五部分组成。它与分光光度计比较主要差别有两点。第一，荧光分析仪器采用垂直测量方式，即在与激发光相垂直的方向测量荧光(图5-03 荧光分析仪器示意图.doc图5-03 荧光分析仪器示意图.JPG如图5-3所示)，以消除透射光的影响。第二，荧光分析仪器有两个单色器，一个是激发单色器，置于液槽前，用于获得单色性较好的激发光；另一个是发射单色器，置于液槽和检测器之间，用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰。

(一)光源

荧光测量中的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度。在荧光计中，常使用卤钨灯作光源；在荧光分光光度计中，通常采用高压汞灯或氙弧灯作光源。高压汞灯是

利用汞蒸气放电发光的光源，其光谱略呈带状，以365nm的谱线为最强。荧光分析中常使用365nm、405nm和436nm三条谱线。高压氙弧灯是荧光分光光度计中应用虽广泛的一种光源。氙灯是一种短弧气体放电灯，工作时，在相距约8mm的钨电极间形成一强电子流(电弧)，氙原子与电子流相撞而解离为正离子，氙正离子与电子复合而发光，其光谱在250～800 nm范围内呈连续光谱。

此外，作为一种新型荧光激发光谱，可调谐染料激发器显示出了巨大的优势。

(二)单色器

荧光计的单色器是滤光片，因而荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。荧光分光光度汁一般采用两个光栅单色器。荧光分光光度计既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。

(三)检测器

荧光的强度一般较弱，要求检测器具有较高的灵敏度。荧光计采用光电管作检测器，荧光分光光度计采用光电倍增管作为检测器。

荧光分析之所以具有比吸收光度法高得多的灵敏度，是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，而且荧光强

度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定灵敏度提高。吸收光度法则不然，它测定的是吸光度，不管是增大入射光强度I0，还是提高检测器的灵敏度，都会使透过光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值并不会改变，因而灵敏度不能提高。

四、荧光分析法的应用

(一)无机化合物的分析

大多数无机离子与溶剂之间的相互作用很强，其激发态多以非辐射跃迁方式返回基态，发荧光者甚少。然而很多无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的络合物，利用这一性质可对其进行荧光测定。目前采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70种，其中较常采用荧光法测定的元素有铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。

能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。它们通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。由于螯合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。例如，荧光镓在pH＝5.0时与Al3+形成发射黄绿色荧光的络合物,pH＝3.0时与Ga3+形成发射黄色荧光

的络合物；安息香在碱性介质中与硼酸盐形成发射绿蓝色荧光的络合物，与Zn2+形成发射绿色荧光的络合物；桑色素在碱性溶液中与Be2+形成发射黄绿色荧光的络合物等。

荧光分析中常用的另一类络合物是三元离子缔合物。例如，罗丹明B为阳离子荧光染料，Au3+、Ga3+、Tl3+等阳离子首先与Cl-、Br-等卤素离子形成二元络阴离子，再与罗丹明B缔合形成荧光化合物。再如，曙红为阴离子荧光染料，Ag+与邻菲咯啉形成的二元络阳离子，再与曙红缔合后可使其荧光猝灭，由荧光降低的程度也可对Ag+进行分析。

荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。除了上述Ag+外，可采用荧光猝灭法间接测定的离子还有F-、S2-、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+等。

(二)有机化合物约分析

脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发生荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。如丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定0.1的丙三醇。

芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可以直接用荧光法测定。如在微碱性条件下，可测定

0.001μg·mL-1以上的对氨基萘碘酸及0～5μg·mL-1的蒽。对于具有致癌活性的多环芳烃。荧光分析法已成为员主要的测定方法。为了提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后再进行测定。例如，水杨酸与铽形成络合物后。荧光增强，测定灵敏度提高。再如，糖尿病研究中的重要物质阿脲(四氧嘧啶)与苯二胺反应后，荧光增强，可用于测定血液中低至10-10mol阿脲。

在生物化学分析、生理医学研究和临床、药物分析领域，许多重要的分析对象，如维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化物、酶和辅酶等，均可用荧光法分析。由于荧光法的高灵敏度，它还用于生理过程中生物活性物质之间的相互作用、生化物质的变化以及反应动力学过程的研究和监视。

第二节磷光分析法

一、概述

磷光是分子从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射。磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合和进行定量分析的一种方法。但是在1975年以前。绝大多数磷光分析工作都是在低温条件下进行的，后来相继出现了一些室温磷光分析方法，

如固体表面室温磷光法、胶束增稳室温磷法和敏化室温磷光法等分析方法，使磷光分析法在药物分析、临床分析等领域的应用日益发展，并与荧光分析相互补充，在有机定量分折中发挥出愈来愈重要的作用。

二、基本原理

(一)产生和磷光强度

前已述及，磷光是由处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。由于分子的第一电子激发三重态(T1)的能量低于其第一电子激发单重态，因此，磷光辐射的波长比荧光更长。三重态T1向基态Ｓ0属自禁阻跃迁。跃迁速率小，使得三重态稳定性大，因而磷光比荧光有长很多的寿命。当激发光停止后，荧光立即消失，而磷则将持续一段时间(10-4～10s)三重态的寿命较长，使得激发态分子发生T1→S0体系间窜跃这种非辐射跃迁的概率较大。因而，磷光物质在室温溶液中产生的磷光一般都比较弱。当磷光物质浓度很小时，磷光强度I p与磷光物质浓度c之间的关系为

I p=2.3φp I0kbc(5—6)

式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，k为磷光物质的

摩尔吸收系数，b为试样池的光程。在一定的条件下，φp、I p、k、b均为常数，因此式(5—6)可写成

I p=Kc

根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线

(二)温度对磷光强度的影响

溶液中物质的磷光强度与温度有密切的关系。在室温条件下，溶剂分子热运动比较剧烈，绝大多数处于激发三重态的物质分子均会与溶剂分子碰撞而失活，磷光很难产生。随着温度的降低，分子热运动速率减慢，磷光逐渐增强。当溶液在液氮中冷冻至玻璃状时，某些物质可以产生很强的磷光。低温磷光分析就是基于这一原理而建立起来的。对于吲哚、色氨酸和利血平等物质，其低温磷光分析法有比荧光法更高的灵敏度。(三)重原子效应

使用含有重原子的溶剂(如碘乙烷、溴乙烷)或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称作重原子效应。前者称为外部重原子效应，后者称为内部重原子效应。重原子效应的机理是，重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道

偶合作用。从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大。有利于增大磷光效率。利用重原子效应是提高磷光分析灵敏度的简单而有效的手段。目前应用较多的除重原子溶剂外，还可采用碘化物，Ag+盐、Pb2+盐和Ti+盐也有应用。

(四)室温磷光

在一般情况下，溶液中磷光物质的室温磷光太弱。不能用于分析。当向溶液中加入适当的表面活性剂时，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境，增强了定向约束力，从而减少了磷光分子与溶剂分子的碰撞概率。增加了三重态的稳定性，导致磷光强度显著增大，称此为胶束增稳室温磷光。

当磷光物质吸附于某些固体表面时，分子的刚性增加，三重态的碰撞去活化概率大大减小，也可在室温下产生较强的磷光。由此又产生了固体表面室温磷光分析方法。

三、磷光分析仪器

磷光分析仪器与荧光分析仪器相似，也是由光源、激发单色器、液槽、发射单色器、检测器和放大显示装置所组成。由于分析原理上的差别，磷光分析仪器有些特殊部件。

1．试样室测定低温磷光一般在液氮温度(77K)下进行，

盛放试液的试样池需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。固体表面室温磷光分析则需特制的试样室。

2．磷光镜有些物质既产生荧光，又能产生磷光。为了在有荧光现象的体系中测定磷光，常采用一种叫磷光镜的机械切光装置，利用荧光与磷光寿命的差异消除荧光干扰。现代的磷光分析仪多采用脉冲光源与程控检测相结合的时间分辨技术。

四、磷光分析法的应用

磷光分析法在药物分析、临床分析及环境分析领域得到了一定的应用。它与荧光法互相补充，已成为痕量有机物分析的重要手段。

低温磷光分析已应用于萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃以及含氮、硫和氧的杂环化合物分析，还用于阿司匹林、柯卡因、磺胺密啶、维生策K、B6、E等许多药物的分析。固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物快速灵敏的分析手段。胶束增稳室温磷光分析已用于萘、芘、联苯的分析。

第三节化学发光分析法

一、概述

化学发光分析是利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。在化学发光中，发光物质所需的激发能既不是光。也不是热和电，而是由化学反应过程中所提供的化学能。化学发光现象自19世纪中期就为人们所熟知，但应用于分析化学却是20世纪五六十年代的事。1970年左右。化学发光法被推荐作为监测空气污染物的方法。70年代后，液相化学发光分析得到快速发展。目前，这一方法已广泛地应用于痕量元素分析、环境监测以及生物医学分析等领域，成为一种重要的痕量分析手段。

化学发光分析具有下列突出特点：

(1)灵敏度很高。例如，用荧光素酶和腺苷三磷酸(ATP)的化学发光反应，可测定低至2×10-17mol/L ATP;利用鲁米诺化学发光体系测定Cr3+,Co2+等离子的检出限也低至10-12g/mL。

(2)测定的线性范围宽。一般有5~6个数量级。

(3)仪器设备简单。化学发光分析仪没有激发光源，由于不存在杂散光和散射光等引起的背景干扰，并且检测的是整个光谱范围内的发光总量，因而也不需要单色器。

(4)分析速度快。流动注射化学发光分析每小时可测定100个以上的试样。

二、基本原理

(一)化学发光反应的条件

化学发光的激发能由化学反应所提供，在反应过程中，某一反应产物的分子接受反应能被激发，形成电子激发态，当它们从激发态返回基态时以辐射的形式将能量释出来。这一过程可表示为

A+B─→C?+D C?─→C+?ν

能够产生化学发光的反应必须具备下述条件：

(1)能快速地释放出足够的能量。根据ΔE＝?υ计算，在可见光区观察到化学发光，需170~300 kJ·mol-1激发能。一些氧化还原反应，特别是具有过氧化物中间产物的氧化反应可满足这种要求，

(2)反应途径有利于激发态产物的形成。

(3)激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其它分子。

(二)化学发光效率和发光强度

第五章分子发光分析法习题答案

第五章分子发光分析法 2、简述影响荧光效率的主要因素 答：荧光效率（Ψ?）＝发荧光的分子数/激发态分子总数。荧光效率越高，辐射跃迁概率越大，物质发射的荧光也就越强，则Ψ?＝K?/( K?+∑Ki)， 一般来说，K?主要取决于物质的化学结构，而∑Ki则主要取决于化学环 境，同时也与化学结构有关，其影响因素有： ①分子结构：发荧光的物质分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基 团，且共轭体系越大，л电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。 随着共轭芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波方向移动。 ②a其次，分子的刚性平面结构有利于荧光的产生，有些有机配位剂与金属离子 形成螯合物后荧光大大增强；b给电子取代基如－OH、－NH 2、－NR 2 和-OR等可 使共轭体系增大，导致荧光增强；吸电子基如－COOH、－NO和－NO 2 等使荧光减弱，c随着卤素取代基中卤素原子序数的增加，物质的荧光减弱，而磷光增强。 ③环境a溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大；b对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低；c大多数含酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液PH的影响很大；d溶液中表面活性剂的存在减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率；e溶液中溶解氧的存在，使激发态单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，会使荧光效率减低。 3、试从原理和仪器两方面比较吸光光度法和荧光分析法的异同，并说明为什么 荧光法的检出能力优于吸光光度法 答：原理：紫外－可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法，而荧光分析法是由于处于第一激发单重态最低能级的分子以辐射跃迁的形成返回基态各振动能级时产生的荧光的分析方法，两者的区别在于前者研究的是吸收光谱，且电子跃迁为激发态的振动能级到基态的振动能级间的跃迁。 仪器：荧光分析仪器与分光光度计的主要差别有：a 荧光分析仪器采用垂直测量方式，即在与激发光相垂直的方向测量荧光，以消除透射光的影响；b 荧光分析器有两个单色器，分别用于获得单色器较好的激发光和用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰。 因为荧光分析法的灵敏度高，其检出限通常比分光光度法低2～4个数量级，选择性也比分光光度法好，这是由于：a 荧光分析仪器在与激发光相垂直的方向测量荧光，与分光光度在一直线上测量相比，消除了透射光的影响，测量更为准确，灵敏度高；b 吸光光度法只采用一个单色器，而荧光分析仪器有两个单色器，

分子发光分析法总结

第12章分子发光分析法 12.1.0发射光谱 物质通过电致激发、热致激发或光致激发等激发过程获得能量，变为激发态原子或分子M*，当从激发态过渡到低能态或基态时产生发射光谱，多余能量以光的形式发射出来：M*→M+hν 通过测量物质的发射光谱的波长和强度来进行定性和定量分析的方法叫做发射光谱分析法。分子荧光和磷光分析法属于发射光谱法。 12.1.1分子荧光和磷光分析法 1.荧光和磷光的产生 1)Jablonski能级图 2)多重度：M=2s+1（s为电子自旋量子数的代数和，其值为0或1） 单重态（S）：分子中全部轨道里的电子自旋配对，即s=0，M=1 三重态（T）：电子在跃迁过程中自旋方向改变，分子中出现两个自旋不配对的电子，即s=1，M=3 三重态能级比相应单重态能级略低。

3)去活化：处在激发态的不稳定分子返回基态的过程。 振动弛豫：分子吸收光辐射后从基态的最低振动能级跃迁到激发态的较高振动能级，然后失活到该电子能级的最低振动能级上。 内转换：相同多重度等能态间的无辐射跃迁。 外转换（猝灭）：激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用导致能量转换而使荧光或磷光强度减弱或消失。 系间跨越：不同多重度等能态间的无辐射跃迁。 荧光发射：单重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。 磷光发射：三重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。 2.激发光谱和发射光谱及其特征 激发光谱：以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。 发射光谱：以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。 荧光发射光谱的特点： 1)Stokes位移：在溶液中，分子荧光的发射峰相比吸收峰位移到较长的波长。 2)荧光发射光谱与激发波长的选择无关。 3)镜像规则：荧光发射光谱和激发光谱镜像对称。 12.1.2荧光量子产率和分子结构的关系 荧光量子产率（荧光效率/量子效率）：表示物质发射荧光的能力，

化学发光法及其应用

化学发光法及其应用 摘要：对近年来化学发光分析法的研究应用最新进展作了评述,包括化学发光体系的类型,化学发光法的新方法，化学发光在无机、药物分析及食品中的应用。 关键字：化学发光法；化学发光体系；应用； 化学发光是在没有光、电、磁、声、热源激发的情况下，由化学反应或生物化学反应产生的一种光辐射。以此为基础的化学发光化学发光(Chemiluminescence ，简称CL)分析法是近30 年来发展起来的一种高灵敏的微量及痕量分析法，由于可以进行发射光子计量，又没有外来激发光源存在时散射光背景的干扰，因而具有很高的灵敏度(检出限可达 10-12-10-21mol)，很宽的线性范围(3-6个数量级)，同时仪器设备又很简单、廉价、易微型化，在二十世纪的最后十年发展非常迅速。 近来,在改进和完善原有发光试剂和体系的同时，新发光试剂的合成,新体系的开发，与其它技术的联用，尤其是流动注射技术，传感器技术，HPLC 技术及各种固定化试剂技术的联用，更显示出化学发光分析快速，灵敏，简便等优点，也进一步拓宽了化学发光的应用范围。并且，化学发光在多类复杂有机物质，如氨基酸、蛋白质、维生素、核酸、DNA、激素、生物碱及各类药物及毒物的检测，多种生物活性物质的分析，多种抗体和抗原的免疫分析，基因芯片、蛋白质芯片、受体芯片、酶芯片、微流控芯片研究中得到了广泛地应用，而且呈现出上升趋势。为生命科学、环境科学、材料科学的研究提供了许多新的、高灵敏度的、有效的分析手段，推动了这方面科学理论和高新技术的发展；同时，其他相关学科的研究成果也为化学发光和生物发光提供了许多新的技术和手段，出现了许多新的化学发光和生物发光法，如纳米发光、发光成像、发光活体分析，大大促进了化学发光的发展及应用。本文将从以下几个方面论述化学发光分析法。 1 化学发光分析法的原理 化学发光(Chemiluminescence，简称CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，是指物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定组分含量的分析方法叫化学发光分析法[1]。 换句话说，化学发光是指吸收了化学反应能的分子由激发态回到基态时所产生的光辐射现象, 广义的化学发光也包括电致化学发光。一个化学反应要产生化学发光现象, 必须满足

四川大学仪器分析第八章-分子发光分析法答案讲课教案

四川大学仪器分析第八章-分子发光分析法 答案

第八章分子发光分析法 基本要求：了解荧光的产生和影响荧光强度的因素， 掌握分子荧光光谱法的定量关系和应用特点， 重点：荧光光谱法的定量关系、应用特点。 难点：荧光的产生和影响荧光强度的因素。 参考学时：3学时 作业参考答案 1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光？ 答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。 芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。 2.解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失 活、系间窜跃、荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱 答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。 三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射； 振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的振动能以热的形式失去的过程。 内转换：在相同激发多重态的两个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。 外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。 失活：激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。 系间窜跃：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。 荧光量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数 激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。 荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。

分子发光分析试卷

分子发光分析 中国·武汉 二O 一五 年 六 月

华中农业大学本科课程考试试卷 考试课程与试卷类型：分子发光分析姓名： 学年学期：2014-2015-2 学号： 考试时间：班级： 一、选择题（选出一个正确答案，将序号填写在【】里。每小题2分，共24分。） 1.非辐射跃迁的衰变过程中，不包括那个过程？【】 A 振动松弛B内转化C 系间窜越D系间转化 2．下面那个不是有效的荧光猝灭剂。【】 A 对二氰基苯 B N,N-二甲基苯胺 C N,N-二乙基苯胺 D 苯胺 3 下列那个不是市场上常见的荧光分光光度计。【】 A 美国Cary Eclipse（瓦里安） B 日本Hitachi(日立) C 岛津CF-5301PC等系列 D 上海F95/96等系列 4 常规的荧光分析法中，间接测量法不包括下面中的那个? 【】 A 荧光衍生法 B 荧光猝灭法 C 荧光吸收法 D 敏化荧光法 5 下列哪位人物没有提出同步荧光分析法。【】 A Clack B Inman C Winefordner D Stern 6 延迟荧光的主要类型不包括下面哪种？【】 A E-型迟滞荧光 B 简单荧光 C P-型迟滞荧光 D 复合荧光 7 动力学分析法不包括下面哪个类型。【】 A 酸催化法 B 非催化法 C 催化法 D 酶催化法 8 下列哪种检测方式不属于单分子荧光检测形式。【】 A 光子爆发检测 B 多分子图像记录 C 单分子图像记录 D 单分子光谱测绘 9 下列哪个不是测定铜的荧光分析方法？【】 A 直接荧光法 B 间接荧光法 C 荧光猝灭法 D 荧光滴定法 10 下列哪个物质不曾用于钒的荧光测定？【】 A 间苯二酚 B 苯甲酸-锌汞齐 C 1-氨基-4-羟基蒽醌 D 桑色素 11 下列哪个pH值会使铁离子与氨基酚反应的产物具有相对较强的荧光？【】

分子发光分析法(精)

第五章分子发光分析法 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。 第一节荧光分析法 一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。1867年

Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。 荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。 二、基本原理 (一)分子荧光的产生 大多数分子含有偶数电子。根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。处于电子激发态的分子是不稳定的，它会很快地通过无辐射跃迁和辐射跃迁释放能量而返回基态。辐射跃迁发生光子的发射，产生分子荧

四川大学仪器分析第八章分子发光分析法答案

第八章分子发光分析法 基本要求：了解荧光的产生和影响荧光强度的因素， 掌握分子荧光光谱法的定量关系和应用特点， 重点：荧光光谱法的定量关系、应用特点。 难点：荧光的产生和影响荧光强度的因素。 参考学时：3学时 作业参考答案 1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光 答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。 芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。 2.解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失活、系间窜跃、 荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱 答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。 三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射； 振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的振动能以热的形式失去的过程。 内转换：在相同激发多重态的两个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。 外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。 失活：激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。 系间窜跃：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。 荧光量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数 激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。 荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。 3.溶液中，溶剂的极性、pH值及温度是如何影响荧光强度的。 答：溶剂的影响：随着溶剂极性增加，荧光物质的n—π*跃迁能量增大，π—π*跃迁的能量降低，从而导致荧光强度增加，荧光波长红移。溶剂若能和荧光物质形成氢键或使荧光物质的电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四

化学发光分析法的应用研究与新进展

化学发光分析法的应用研究与新进展 摘要：化学发光分析法是根据化学反应的发光强度或发光总量确定相应组分含量的一种分析方法。同荧光法相比，化学发光法不需要外来的光源，减少了拉曼散射和瑞利散射，降低了噪音信号的干扰，提高了检测的信噪比，扩大了线性范围。并具通过特定的化学发光可以定性定量的测定微量物质，有操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。同时在实践的过程中化学发光分析法与其他方法相比较其灵敏度也较高，此外线性范围宽和仪器简单也是化学发光分析法的特点之一。正是基于这些特点，化学发光分析法在环境化学、临床医学、生物科学等领域得到十分广泛的应用和研究。本文从化学发光分析法的原理、优缺点和应用研究的新进展等方面进行了综述。 关键词：化学发光分析法，化学发光体系，鲁米诺，光泽精 引言 化学发光是化学反应体系中的某些分子或原子中的电子，如反应物、中间体或反应产物吸收了化学反应释放出的化学能后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子所产生的光辐射[2]。化学发光又称为冷光，它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下由化学反应而产生的光辐射。由于不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。具有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。在生物工程学，药物学，分子生物学，临床和环境化学等各个领域正显示出它蓬勃的生机。本文主要介绍化学发光分析法的原理、优缺点，常用的化学发光试剂及其体系，和在环境化学、临床医学、生物科学等领域的应用研究和化学发光分析法的近两年的应用新进展。 1 化学发光 1.1化学发光的原理 发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子

(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法

荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类 完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。

半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应

化学发光及生物发光的原理及其应用(精)

化学发光及生物发光的原理及其应用 第一部分概述 化学发光 (ChemiLuminescence ，简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光 ( 光辐射 ) 所吸收的能量来源不同。体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。化学发光体系用化学式表示为： 依据供能反应的特点，可将化学发光分析法分为： 1 ）普通化学发光分析法 ( 供能反应为一般化学反 应 ) ； 2 ）生物化学发光分析法 ( 供能反应为生物化学反应；简称 BCL) ； 3 ）电致化学发光分析法 ( 供能反应为电化学反应，简称 ECL) 等。根据测定方法该法又可分为： 1 ）直接测定 CL 分析法； 2 ）偶合反应 CL 分析法 ( 通过反应的偶合，测定体系中某一组份； 3) 时间分辨 CL 分析法 ( 即利用多组份对同一化学发光反应影响的时间差实现多组份测定 ) ； 4 ）固相、气相、掖相 CL 。分析法； 5 ）酵联免疫 CL 分析法等。 化学发光的系统一般可以表示为：

在整个的检测系统中其关键的部分为 PMT ，其直接影响到仪器的检测性能，其最高检测极限为 10 － 22 mol/L 。不同型号的仪器其检测技术不一样，但基本原理都是利用待测组份与体系的化学发光强度呈线性定量关系，而化学发光强度随体系反应进行的速度增强或衰弱。记录仪记录峰形，以峰高定量，也可以峰面积定量。因化学发光多为闪烁式发光 (1—2s 左右 ) ，故进样与记录时差短，分析速度快。 第二部分、化学发光常用的化学试剂及其原理 化学发光是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤，即化学激发和发光。因此，一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量（ 170 ～ 300KJ ／ mol ），第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。到目前为止，所研究的化学发光反应大多为氧化还原反应，且多为液相化学发光反应。 化学发光反应的发光效率是指发光剂在反应中的发光分于数与参加反应的分子数之比。对于一般化学发光反应，值约为 10 － 6 ，较典型的发光剂，如鲁米诺，发光效率可达 0 . 01 ，发光效率大于 0 。 01 的发光反应极少见。现将几种发光效率较高的常用的发光剂及其发光机理归纳如下。 1. 鲁米诺及其衍生物 鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、 4—氨基已基—N 一乙基异鲁诺及 AHEI 和 ABEI 等。鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为 425nm 的化学发光。 在通常情况下鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，但当有某些催化剂存在时反应非常迅速。最常用催化剂是金属离子，在很大浓度范围内，金属离子浓度与发光强度成正比，从而可进行某些金属离子的化学发光分析，利用这一反应可以分析那些含有金属离子的有机化合物，达到很高的灵敏度。其次是利用有机化合物对鲁米诺化学发光反应的抑制作用，测定对化学发光反应具有猝灭作用的有机化合物。其三是通过偶合反应间接测定无机或有机化合物。其四是将鲁米诺的衍生物如异鲁米诺 (ABEI) 标记到羧酸和氨类化合物上，经过高效液相色谱 (HPLC) 或液相色谱 (LC) 分离后，再在碱性条件下与过氧化氢－铁氰化钾反应进行化学发光检测。也可以采用其它分离方法，如将新合成的化学发光试剂异硫氰酸异鲁米诺标记到酵母 RNA 后，通过离心和透析分离，然后进行化学发光检测。此外应用的还有 N 2(B2 羧基丙酰基 ) 异鲁米诺，并对其性能进行了研究。

化学发光免疫分析方法的研究及应用

本文由：华夏学术传媒网提供https://www.docsj.com/doc/638515856.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强

化学发光免疫分析方法

化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。 一、化学发光免疫分析方法的类别 化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。 （一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。 鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。 （二）化学发光酶免疫分析 化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。 碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。AMPPD 为1，

化学发光法在药物分析中的应用的综述报告

化学发光法在药物分析中的应用的综述报告化学发光分析法是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法，作为一种有效的痕量分析技术,因其具有灵敏度高、线性范围宽、而且分析速度快、重现性好等特点,在分析化学领域得到了迅速发展；但选择性较差如果将其与流动注射、高效液相色谱（HPLC)、毛细电泳(CE)等技术联用，就能较好的克服这一缺点。 化学发光反应体系目前主要使用的有：①鲁米诺、②光泽精、③过氧草酸盐-荧光物质-H2O2等电致发光、④Ce（Ⅳ）、⑤高锰酸钾-还原性有机物等，在医学、生命科学等领域中具有广泛的应用前景。 如果将高效液相色谱（HPLC)、毛细电泳(CE)等技术联用对药物进行分析，是分析化学较为活跃的发展领域，此方法彰示着化学发光法的潜在优势。 下面介绍一些化学发光法的研究成果： 基于碱性介质中敌百虫增强鲁米诺-H2O2体系发光的研究,建立了测定敌百虫的流动注射化学发光分析方法。该法测定敌百虫的线性范围为 1.0×10-8—1.0×10-5g/mL,根据IUPAC建议计算出检出限为3.2×10-9g/mL,相对标准偏差为1.10%(1.0×10-7g/mL的敌百虫,n=11)。对蔬菜中的敌百虫进行固相萃取,有效地除去蔬菜中的干扰物质,并对蔬菜样进行加标测定,回收率范围在88.5%—92.6%之间。 阿莫西林在硫酸溶液中的降解产物与Ce（Ⅳ）在罗丹明6G的增敏作用下可产生化学发光。据此建立了流动注射化学发光测定阿莫西林的新方法。该方法线性范围为0.01～20.0mg·L-1,检出限为

0.008mg·L-1,相对标准偏差(n=11,C=1.0mg·L-1为0.7％。方法用于药物中阿莫西林含量的测定,结果满意。 基于碱性介质中莱克多巴胺对鲁米诺-铁氰化钾体系化学发光的增敏作用,研究了各因素对化学发光的影响。结果表明,在最佳发光条件下,相对发光强度与莱克多巴胺浓度在 4.0×10-9～8.0×10-7 g.mL-1范围内呈良好的线性关系,检出限为2.5×10-9 g.mL-1,相对标准偏差为5.6%。应用该方法成功分析了猪肉和尿样中莱克多巴胺的含量,回收率为69.3%～101.3%,结果令人满意。 在甲醛存在下,高锰酸钾与尿酸能够发生化学发光反应,产生很强的化学发光。据此采用流动注射技术,建立了一种利用高锰酸钾甲醛尿酸化学发光体系测定尿酸的化学发光分析法。方法的检出限为6×10-6 g/L;相对标准偏差为1. 8% (4. 0×10-4 g/L尿酸,n=11 );线性范围为2. 0×10-5 ~5. 0×10-3g/L。本法用于人体尿液中尿酸的测定,结果令人满意。 在碱性条件下,铁氰化钾氧化鲁米诺产生发光,盐酸异丙肾上腺素对该体系有显著的增强作用。基于此并结合流动注射技术建立了测定盐酸异丙肾上腺素的新方法。该方法具有很高的灵敏度,检出限为8.6ng L(IUPAC) ;线性范围为0 .0 5～10 μg L。对1.0 μg L盐酸异丙肾上腺素平行测定11次,其相对标准偏差为3.6 %。 …… 化学发光法的分析对象可分为无机物（无机离子、N的氧化物、含S化合物）有机物、聚合物、活性氧、纳米分子等

化学发光分析法

化学发光法在环境监测中的应用 （上海大学环境与化学工程学院） 摘要：化学发光分析的方法是在环境监测工作中应用较多的一种现代测试技术，由于其自身灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优越特点使得化学发光技术在环境监测中的应用范围不断扩展。本文综述了化学发光分析法的原理、优缺点和在环境监测中的一些应用并简介了化学发光分析的局限性和在此基础上改进后的化学发光分析法在环境检测中的拓展应用。结合毛细管电泳技术与化学发光分析的联用，举例说明了化学发光分析的优良特点与化学发光分析的发展方向。 关键词：化学发光分析法；环境监测；应用 Chemiluminescence applications in enviromental monitoring Maguowen (School of chemical and enviromental Engineering, Shanghai University) Abstract:Chemiluminescence analysis method is a more modern testing technique commonly applied in environmental monitoring ,Because of its high sensitivity,wide linear range and simple equipment,chemiluminescence technology is in the ever-expanding range of applications in environmental monitoring.An reviewof the principle,advantage and disadvantage of chemiluminescence analysis and its improved application in enviromental monitoring is presented in this paper.discussed the characteristics and development of chemiluminescence analysis combined with capillary electrophoresis. Key words: chemiluminescence analysis;enviromental monitoring;application 化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度或辐射总量来确定其相应组分含量的分析方法。自19世纪下半叶发现一般有机物的化学发光反应以来，化学发光反应便被应用到分析化学领域中，特别是近十年来化学发光分析取得了很大的进展。随着人们对环境保护的重视，对环境监测要求也愈来愈高，化学发光法的众多优点使得其在环境监测分析方面的应用也逐渐增加，特别是在水和废水中对无机离子的分析监测方面有较多应用。近年来，随着环境科学研究的深入和发展，化学发光分析在环境监测中的应用也日益增多，并成功地应用于大气监测、水质监测以及环境污染机理的研究中[1]。 1基本原理与特点 1.1原理 化学发光分析是物质在进行化学反应时释放出的化学能被处于基态的反应分子吸收，分子从基态跃迁至激发态，在符合量子化条件时，激发态分子所吸收的化学能以光的形式辐射出来，成为化学发光。当在单重激发态返回基态时辐射的是荧光，其反应式为： 反应物A+反应物B激发态产物+其他产物 激发态产物基态产物+光子 化学发光的光强度Ιa与化学发光光子产率Φa之间的关系式为： Ia=Φa?dc(t)/dt[2] 由上式可知Ia是时间的函数，它与反应物的浓度及化学发光光子产率Φa成正比。用仪器测量一定时间内发光光子数或其积分值即发光强度或总发光强度，即可测出参与化学反应的各种物质的浓度，便能进行反应物质的定量分析。化学发光反应时待测物质与发光试剂反应发生化学发光。如某些金属离子能与鲁米诺和H2O2作用产生化学发光。另一方面，由于某些物质可与某些金属离子形成饱和配合物，使金属离子浓度降低，从而使其与鲁米诺的发光强度明显降低，基于此原理，可通

仪器分析作业03参考答案(第三、五章紫外可见分光光度法+分子发光分析法)华南理工大学仪器分析

01. 溶液有颜色是因为它吸收了可见光中特定波长范围的光。若某溶液呈蓝色，它吸收的是什么颜色的光？若溶液无色透明，是否表示它不吸收光？ 答：溶液呈蓝色，表明其吸收了蓝光的互补光，即黄光（若答是吸收了黄光外的所有可见光，不能说错，但是这样的情况过于巧合，少见！）。若溶液无色透明，仅能说明其不吸收可见波段的光。 2. 分别在己烷和水中测定某化合物UV-Vis 光谱，发现该化合物的某个吸收峰由285 nm （己烷）蓝移至275 nm （水），（1）判断产生该吸收峰的跃迁类型；（2）试估算该化合物与水生成氢键的强度。 答：（1）溶剂极性增大，λmax 蓝移，表明该吸收峰是由n →π*跃迁产生的。 （2）()()? ?? ? ??λ-λ??=己烷氢键max O H max A 1 1hc N E 2 ? ?? ??????????=--99834-23102851-102751100.31063.61002.6 1mol J 28.15-?= 3. 按从小到大顺序对下列化合物的λmax 排序，并简单说明理由（不要想得太复杂） A. NO 2 B. NO 2 t-C 4H 9 t-C 4H 9 C. NO 2CH 3 D. NO 2 C 2H 5 答：B

分子发光分析法

1. 下列说法中错误的是( ) A 荧光和磷光都是发射光谱 B 磷光发射发生在三重态 C 磷光强度IP与浓度C的关系与荧光一致 D 磷光光谱与最低激发三重态的吸收带之间存在着镜像关系 2. 分子荧光分析中，含重原子（如Br和I）的分子易发生：( ) [ID: 1291] A 振动弛豫 B 内部转换 C 体系间窜跃 D 荧光发射 3. 三线态的电子排布应为( ) [ID: 1303] A 全充满 B 半充满 C D 4. 下列说法正确的是( ) [ID: 1307] A 分子的刚性平面有利于荧光的产生 B 磷光辐射的波长比荧光短 C 磷光比荧光的寿命短 D 荧光猝灭是指荧光完全消失 5. 分子荧光与化学发光均为第一激发态的最低振动能级跃至基态中各振动能级产生的光辐射，他们的主要区别在于( ) [ID: 1309] A 分子的电子层不同 B 跃至基态中的振动能级不同 C 产生光辐射的能源不同 D 无辐射弛豫的途径不同 6. 根据下列化合物的结构，判断哪种物质的荧光效率最大( ) [ID: 1310] A 苯 B 联苯 C 对联三苯 D 9－苯基蒽 7. 欲测定污水中痕量三价铬与六价铬应选用哪种方法( ) [ID: 1312] A 原子发射光谱法 B 原子吸收光谱法 C 荧光光度法 D 化学发光法

8. 若需要测定生物试样中的伟良氨基酸应选用哪种分析方法( ) [ID: 1315] A 荧光光度法 B 化学发光法 C 磷光光度法 D X荧光光谱法 9. 若需检测尿液中的对－硝基苯酚刻采用哪种方法( ) [ID: 1319] A 荧光光度法 B 化学发光法 C 磷光光度法 D X荧光光谱法 10. 若需测定生物体中的磷酸三腺甙（ATP），其浓度为－时，应采用下述哪种方法( ) [ID: 1326] A X荧光光谱法 B 荧光光度法 C 磷光光度法 D 化学发光法 DCDAC DDACD 第五章分子发光分析法[填空题测试] 1. 分子荧光分析法试根据物质的_________________进行定性，以_______进行定量的一种分析方法。答案 分子荧光光谱荧光强度 2. 分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁至激发态，再以无辐射弛豫转入最低三重态，然后跃回基态的各个振动能级，并产生光辐射。这种发光现象应称为________。[ID: 1334] 答案 分子磷光 3. ________类型的化学反应可以产生化学发光，化学发光反应自由能的变化（ΔG）一般应在________（kJ/mol）。[ID: 1337] 答案 氧化还原170－300 4. ________溶剂对荧光的光谱干扰最小，荧光光谱分析中的主要干扰是________。[ID: 1339] 答案 极性溶剂产生的散射光 5. 在极稀的溶液中，荧光物质的浓度________，荧光强度________，在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度________。[ID: 1340] 答案