SDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽

?研究原著?　文章编号:100022790(2000)0620761203 S D S-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽

石继红,赵永同,王俊楼,韩　苇,颜　真,张英起　(第四军医大学生物技术中心,陕西西安710033)

关键词:SD S2聚丙烯酰胺凝胶电泳;肽;蛋白质

中图号:Q503 文献标识码:A

摘　要:目的　研究SD S2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD S2PA GE)显示小分子多肽的方法.方法　观察不同方法处理的样品,上样量对电泳结果的影响及对分子量标准(M r2512～16949)进行直线回归分析.结果　样品的不同处理条件未见有差异;在该实验系统条件下上样样品为每孔5～10Λg较佳;分子量标准直线回归系数r=-0.962.结论　样品处理方便;上样量少;在160g?L-1T,60g?kg-1C较低的丙烯酰胺含6mo l ?L-1脲的分离胶中能够显示M r为2512的多肽,是一种显示小分子多肽的较好方法.

Ana lysis of low m olecular peptides by sod iu m dode-cyl sulfa te-polyacrylam ide gel electrophoresis

S H I J i2H ong,ZH A O Y ong2T ong,W A N G J un2 L ou,H A N W ei,YA N Z hen,ZH A N G Y ing2Q i

B i o techno logy Cen tre,Fou rth M ilitary M edical U n i2 versity,X i’an710033,Ch ina

Keywords:SD S2PA GE;pep tides;p ro teins

Abstract:A I M　To establish a sensitive m ethod of elec2 tropho resis fo r low mo lecular w eigh t pep tides.M ETHOD S　T ricine2SD S2po lyarcrylam ide gel electropho resis w ith6mo l?L-1urea w as used.T he samp les w ere treated w ith different m ethods(temperature and ti m e interval)and varying loading quantity of samp les.T he linear regressi on analysis w as m ade.RESUL TS　D ifferent treatm ent of samp les had no ef2 fect on the experi m ental results.T he op ti m um loading scope of samp les w as5～10Λg per lane.T he co rrelati on coefficient of mo lecular m arkers w as-0.962.CONCL USI ON　Separat2 ing gel w ith6mo l?L-1urea at low er acrylam ide concentra2 ti on(160g?L-1T,60g?kg-1C)is useful fo r identifi2

收稿日期:1999209221;　修回日期:1999212213

作者简介:石继红(19632),男(汉族),河北省枣强县人.讲师.T el.

(029)3374774

cati on of pep tide w ith M r from2512to16949.It is conve2 nient and si m p le to operate and is a w ell2established m ethod fo r analysis of low mo lecular pep tides.

0　引言

20世纪60年代Shap iro建立了SD S2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SD S2PA GE)方法之后,W eber,Glo ss2 m ann和Douglas等人进行了多次改进,已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性,但对于M r 小于10000的蛋白质来说是无能为力的[1].20世纪80年代初Schaβgger等[2]应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质,但分离效果不甚理想且重复性较差.之后他们又进行了系统地研究和摸索,能够分离较大M r范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现,具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出.我们在进行基因工程药物的开发研制中,对SD S2PA GE 方法进行了多次改进,在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果.此法所需仪器简单,操作方便,重现性好,时间短,只需微克量的多肽便可显带且能迅速估计出其M r,值得进一步推广和利用.

1　材料和方法

1.1　试剂和仪器　SD S、脲、甘油、过硫酸铵均为分析纯,西安化学试剂厂出品;丙烯酰胺(分析纯)为汕头市光华化学厂产品;N,N′2甲叉双丙烯酰胺(分析纯)为浙江黄岩人民化工厂生产;T ris(分析纯)为成都试剂厂出品;T E M ED为B I O2RAD产品;T ricine (U ltra Pu re Grade)为So lon Ind产品.B I O2RAD小型垂直式电泳附件模具;FD2201稳压稳流电泳仪(上海医用分析仪器厂).

1.2　肽分子质量标准　肽分子质量标准的M r范围2512～16949为Phar m acia L KB公司产品.胸腺肽Α1是美国加州圣马刁市赛生药品公司产品(商品名“Z ADA X I N”),是一乙酰化的多肽,M r为3108,p I 318.经Sep hadex G225柱去除所含的甘露醇,然后

冷冻干燥,用样品缓冲液配成所需样品.

1.3　方法

1.3.1　电泳贮存液的配制　阳极缓冲液中T ris为0.2m o l?L-1用HC l调pH值至8.9.阴极缓冲液为0.1m o l?L-1的T ris,0.1m o l?L-1的T ricine和0101g?L-1的SD S溶液,其pH值约为8.25.胶缓冲液为3.0m o l?L-1的T ris和0.03g?L-1的SD S,用HC l调pH值至8.4.

称取48g丙烯酰胺和1.5g N,N′2甲叉双丙烯酰胺溶于100mL纯水中,溶解混匀后经4号滤纸过滤即得到495g?L-1T,30g?kg-1C的贮存液;称取46.5g丙烯酰胺和3.0g N,N′2甲叉双丙烯酰胺溶于100mL纯水中,同样得到495g?L-1T,60g?kg-1C的贮存液(T代表丙烯酰胺的总浓度,C代表交联度).

1.3.2　胶的制备　与一般SD S2PA GE电泳相似[3],按T ab1给出的数据分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶,依次灌胶.

表1　分离胶、间隙胶和浓缩胶的组成

T ab1　Compo siti on of separating,spacer and stack ing gels

Compo siti on A crylam ide

so luti on A

V mL

A crylam ide

so luti on B

V mL

Gel buffer

(V mL)

U rea

D istilled

w ater

(V mL)

Persulfate of

100g?kg-1

(V ΛL)

T E M ED

(V ΛL)

F inal

vo lum e

(V mL)

Separating gel

160g?L-1T,60g?kg-1C

w ith6mo l?L-1urea

-3.33.33.61.0454.510.05

Spacer gel

100g?L-1T,30g?kg-1C

0.60-1.0-1.40202.03.02

Stack ing gel

60g?L-1T,30g?kg-1C

0.30-0.93-1.27252.52.53

A:495g?L-1T,30g?kg-1C;B:495g?L-1T,60g?kg-1C.T:the to tal percentage concentrati on of bo th monom ers;C:the percentage con2 centrati on of the co ro sslinkage.

1.3.3　样品缓冲液的制备及样品的处理　蛋白质样

品与上样缓冲液(4g?L-1SD S,120g?L-1甘油,50

m o l?L-1T ris,20mL?L-1巯基乙醇含0.1g?L-1

溴酚蓝,pH6.8)混合均匀,分别按40℃孵育30

m in;60℃孵育10m in和煮沸2m in处理.

1.3.4　电泳条件　内槽装阴极缓冲液、外槽用阳极

缓冲液恒压电泳,先40V约1h,当样品进入分离胶

时,电压升至60V约2h.

1.3.5　染色、脱色和胶的保存　电泳完毕时胶置于

染色液[2.5g?L-1考马斯亮蓝R2250的乙醇(V)∶

冰乙酸(V)∶水(V)为9

∶2∶9]中振荡染色1.5～2

h,转至脱色液(400mL?L-1的乙醇,40mL?L-1的冰乙酸)中扩散脱色,直到背景清晰.胶的保存与一般SD S2PA GE类同[3].

2　结果

2.1　不同处理的样品对S D S-PAGE的影响　多肽样品经上述3种不同处理,经SD S2PA GE后,分子质量蛋白标准(M r2512～16949)没有电泳差异,均能较清晰地显示6条带(F ig1).分子质量蛋白标准分别在每孔上不同量的蛋白质(F ig2),当上样量为1Λg 时,分子质量蛋白标准仅能显示其中的5条带.当上样量达到5～10Λg时,M r2512的肽带明显可见.

2.2　分子量标准蛋白回归方程及对低分子量标准品的分析　应用160g?L-1T,60g?kg-1C含6m o l?L-1脲的丙烯酰胺凝胶能够较好地显示标准蛋白的6条带(F ig1).对其M r对数(lg M r)和在分离胶中迁移的距离(Λ)进行直线回归分析,回归方程为Yδ=-0.0378x+4.5512,相关系数r=-0.962,从曲线查及胸腺肽Α1单体的M r为3135(其理论M r为3108).

图1　样品的不同处理

F ig1　T reated samp les w ith different conditi on

L ane1,4:40℃30m in;L ane2,5:60℃10m in;L ane3,6:100℃2 m in

图2　样品量的不同对电泳的影响

F ig2　Q uantity’s effect on electroph ro sis

F rom lane1to6the p ro tein quantity is4,8,12,16,20,24Λg re2 spectively.

3　讨论

SD S2PA GE的有效分离范围取决于聚丙烯酰胺的浓度和交联度,其孔径随着双丙烯酰胺:丙烯酰胺比率的增加而减小,比率接近于1∶20时,孔径达到最小值[3].M r低于10000的小分子肽,即使用较高浓度的聚丙烯酰胺凝胶的SD S2PA GE也不能完全分离[2].杨联萍等[4]指出用含脲的SD S2PA GE,即使用银染方法M r小于8000的蛋白标准品也无着色.而我们用含6m o l?L-1脲160g?L-1T,60g?kg-1C 的SD S2PA GE方法,不需银染而直接用2.5g?L-1的考马斯亮蓝R2250染色1.5～2h,即可把标准品中的6条带显示得非常清楚,且简单方便,上样量小,重复性好.实验范围内(蛋白标准M r为2512～16949)肽M r的对数与迁移率呈良好的线性关系,相关系数r=-0.962.我们以低M r胸腺素Α1作参照,其结果3153与实际M r3108标准相符,从而证明该方法的准确性和待测样品结果的可信性,该方法是一种显示小分子多肽和估测其M r的较好方法.在含SD S缓冲液的样品中,小分子多肽的浓缩是较困难的,这是因为小分子多肽与SD S形成的复合体具有和SD S本身类似的电荷和大小,因此浓缩对于小分子多肽的SD S2PA GE来说就成了一个突出的问题[5].上述方法中T ricine以阳离子形式存在可以作为拖尾离子,使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带.此外,快速的固定、染色和脱色对于小分子多肽电泳是必要的.这主要是由于小分子多肽对染料的结合力较弱,易扩散冲洗掉而着色较差.随着生物活性多肽物质的发现和多肽类药物的研制,小分子多肽电泳变得越来越重要,已成为生物活性物质纯化分析过程中不可缺少、经常使用的快速鉴定方法.

参考文献:

[1]C leveland DW,F ischer SG,K irschner MW et a l.Pep tide m ap2

p ing by li m ited p ro teo lysis in sodiun dodecyl sulfate and analysis by gel electropho resis[J].J B io Che m,1977;252(3):1102-

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[2]Schaβgger H,Jagow G.T ricine2sodium dodecyl sulfate2po lyacry2

lam ide gel electropho resis fo r the separati on of p ro teins in the range from1to100KD a[J].A na l B ioche m,1987;166(2):368 -397.

[3]金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南[M],第2版.北京:科学

出版社,1992:880-887.

[4]杨联萍,孔祥平,易学瑞.SD S2PA GE电泳对小分子多肽的分析

[J].生物工程进展,1998;18(6):49-51.

[5]F ish WW,R eyno lds JA,T anfo rd C.Gel ch rom atography of

p ro teins indenaturing so lvents[J].J B io Che m,1977;245(19): 5166-5168.

编辑　许福明

?消　息?　唐都医院微创治疗腰椎间盘突出症

本报讯　唐都医院介入放射科引进先进的半导体激光器,率先在国内开展激光椎间盘减压术治疗腰椎间盘突出症,取得了良好的效果,现已治疗200余例,治愈率达94.9%.

腰椎间盘突出症是一种常见症、多发病,严重影响患者的正常生活与工作。传统的治疗方法是卧床休息、推拿、按摩,而手术的创伤大,并发症多.唐都医院介入放射科王执民教授等在开展胶原酶溶术十余年的基础上,引进半导体激光器,开展激光椎间盘减压术治疗腰椎间盘突出症.其治疗原理是在电视透视下,将光导纤维通过穿刺针导入病变椎间盘内,再利用激光能量将椎间盘髓核组织气化并吸出,以减少病变椎间盘的体积和压力,使突出组织回缩,解除对神经根的压迫,达到临床治疗目的.

男性患者宋某,其腰部酸痛伴双下肢后外侧抽痛麻木5a,且逐年病情加重.3月18日,王执民教授等为其实施腰425椎间盘内激光减压术,术后3d患者自觉腰部酸痛明显减轻,麻木缓解,1mo症状完全消失,康复出院.

摘自《四医大通讯》,2000205215,第2版

聚丙烯酰胺开题报告

开题报告 一、课题名称 聚丙烯酰胺的制备。 （一）主要原料极其规格 丙烯酰胺聚合级工业品 M E TA MS 工业级 （甲基氧代乙基二甲基氨甲基硫酸酯） （二）制法 丙烯酰胺与适宜的阳离子单体（如ME T AM S）在水-特丁基醇（TB A）中自由基催化下发生沉积共聚合反应而制得聚丙烯酰胺。 （三）流程说明 配制好的50%液态丙烯酰胺单体溶液，通过离子交换塔，除去聚合抑制剂铜离子后，间断的加入沉积共聚合反应器然后加入精致水、蜜白胺和循环的TB A溶剂，再加入液态缓冲剂氯化铵，用氮气吹扫，除去残余的氧后，再加入催化剂-活化剂溶液。在聚合反应器中进行绝热反应，温度为50~60度、反应时间5~6h 聚合物的收率是定量的。 产物为悬浮于水和TB A中的微粒。通过离心机分出水和TB A，再将粒料在干器中进行干燥包装出厂母液经精制循环使用。二、课题研究的目的和意义 设计一种聚丙烯酰胺的生产工艺流程，能用于中试生产，工业及民用水处理的需求。 聚丙烯酰胺再合成水溶性聚合物中是用途最广、用量最大的，自五十年代用于造纸工业作为添加剂，已有四十多年的历史。采用不同的聚合工艺，引入不同的官能团，可得到一系列具有不同分子量和不同电荷密度的产品，使其应用范围更加广泛，现已被称为标准的造纸助剂。据报道，美国1985年用于造纸作为助流助滤剂的PA M为8700吨，1985—1990年间增长6—10%。因此

研究和开发高质量的PA M具有一定的理论价值和实际意义。 本课题的目的是研制出一种固含量高、分子量高、溶解迅速、稳定好、单体残存量少的聚合物乳胶产品，要求其生产工艺简单，生产成本低的生产工艺流程。 三、课题研究的对象 聚丙烯酰胺产品规格：有聚丙烯酰胺粉剂、非离子型和阴离子型干粉、胶体等。 聚丙烯酰胺产品用途：用作油田泥浆处理剂、污水处理剂、纺织上浆、纸张补强剂、絮凝剂等，广泛应用于石油、冶金、纺织、食品等工业。 1、石油工业 聚丙烯酰胺虽然对水的表面张力降低很小，但分子中有活性基团，吸附于界面之后，能改变界面状态，多年来作为增稠剂、降失水剂、絮凝剂、分散剂、降阻剂、阻垢剂、流度控制剂用于石油工业，提高钻井流体流动性和石油采收率，并减少流体阻力。 作为泥浆性能调整剂，经常使用的是部分水解聚丙烯酰胺。其作用是调节钻井液的流变性，携带岩屑，润滑钻头，减少流体流失等。用PA M调节的钻井泥浆相对密度低，固体含量少，能减轻对油气层的压力和堵塞，容易发现油气层，并有利钻井。 此外，还可大大减少卡钻事故，减轻设备磨损，并能防止井漏和坍塌，使井径规则。在提高石油采收率的三次采油方法中，聚合物驱油技术占有重要地位 在油田生产过程中，由于地层的非均质性，常产生水浸问题，需要进行堵水。PAM类堵水剂的发展甚快，用量大，具有对油和水渗透能力的选择性。选择性堵水这一点是其他堵水剂所没有的。采用P AM还可调整地层内吸水剖面及封堵大管道，实践中已见到良好效果。 从70年代以来，国际上发展起来一种新型发醇产品—黄原胶，它是由甘蓝黑腐单细胞菌以碳水化合物为主要原料（如玉米、淀粉等），经生物工程的手段得到的一种高分子微生物聚合物。

小分子肽在高血压中的作用

小分子肽在高血压中的作用 摘要：心血管生物活性多肽是维持人体生命活动最重要的物质基础，它们在调节和整合心血管系统的生长发育及疾病的发生发展等方面均起到了重要的作用。小分子活性多肽是心血管活性多肽的一大类，具有分子量小（相对分子质量一般小于10000）、结构简单、组织分布广泛、生物效应多样、合成与代谢迅速和免疫原性低等特点，是心血管自稳态调节的最重要成分，其功能紊乱具有重要的发病学意义。高血压是最常见的心血管疾病之一，神经、体液因素网络调节异常和平衡失调以及心血管局部旁/自分泌功能紊乱是高血压病的发病基础，高血压发病过程中多种小分子活性肽参与其中，如肾素-血管紧张素系统（renin angiotensin system, RAS）、钠尿肽（natriuretic peptides，NPs）、内皮素等，以及新发现的Apelin、偶联因子6（Coupling Factor 6）等，形成复杂的网络调节系统，共同参与高血压的发生和发展。对小分子活性肽在高血压中作用的研究，可进一步认识高血压的发病机制，以小分子活性肽为靶点防治高血压可能具有广阔的临床应用前景。 近年心血管分子生物学、反向生理学、反向药理学和反向药物学以及孤儿G蛋白偶联受体策略的应用极大促进了心血管活性多肽的发现及其功能的研究，开拓了生物活性分子研究的新领。这些活性多肽大多都是小分子物质，称作小分子肽，是心血管自稳态调节的最重要成分，其功能紊乱具有重要的发病学意义。近年来，心血管活性多肽对高血压调节作用及在高血压发生机制及诊断、治疗和早期干预措施中的作用正被大家重视，其基础和临床研究不断取得新的进展，已成为当前生命科学研究中最活跃、发展最迅速的领域之一。本文将主要从最近几年在小分子活性肽的生物学效应、参与高血压发病的机理以及其在高血压中可能具有的临床应用等方面的研究作一论述。 一、肾素-血管紧张素体系（renin angiotensin system, RAS） 肾素-血管紧张素系统（renin angiotensin system, RAS）)是人体经典的循环调节系统，通过对心脏、血管、肾脏的调节维持机体水、电解质及血压的平衡，是人类生理功能的一个重要调节机制。它的过度激活是高血压和其他心血管疾病发展的重要决定因素，并因此成为高血压治疗的重要靶点。近年来发现组织中包括血管壁、心脏、中枢神经、肾皮质髓质中亦有肾素一血管紧张素系统，这又引申出新的RAAS的作用机制：局部组织性RAS，它在细胞中通过自分泌、旁分泌和胞分泌各自在其组织细胞发挥作用。随着近年来研究的深入，又发现了血管紧张素转换酶(ACE)的同族物——ACE2以及ACE的各种旁代谢产物如血管紧张素1-9(Angl-9)、血管紧张素1-7(Ang 1-7)以及Ang 1-7的受体Mas等，其中ACE2、Ang 1-7成为研究的热点，它们在血压调节中发挥着与ACE、AngⅡ相抗衡的作用，目前被看成是心血管系统保护因子。 Ang1-7是近年发现的Ang新成员，在ACE2、脯氨基内肽酶、中性肽酶等酶的作用下水解水解Ang II、Ang I产生，与G蛋白偶联Mas受体结合，从而形成ACE2-Ang(1-7)-Mas轴，拮抗传统RAS中关键轴ACE-Ang lI-AT1的生物学活性，在体内发挥广泛的生物学效应，如强大的利钠利尿作用，具有强大的舒张血管、抗细胞增殖等作用，以及增强缓激肽效应发挥降低血压的作用。新的RAS体系参与血压调控主要依赖于ACE与AngⅡ，ACE2与Ang(1-7)两条途径，一条起升压效应；另一条对抗前一路径，引起血压下降。ACE与ACE2一旦失衡，将使体内血压改变。在ACE2相对缺乏状态，AngⅡ作用占优势，导致血管收缩增强，引发高血压。 大量研究已表明，肾素-血管紧张素系统在高血压的发病以及高血压所引起的心脏和血管重塑等病理生理过程中发挥了重要的作用。心肌重塑是高血压最常见、最重要的并发症，它是导致多种心血管疾病独立的危险因子。最近发现，ACE2-Ang（1-7）-AT1轴在抑制心肌重塑方面发挥重要的作用。用慢病毒携带ACE2基因体内转染自发性高血压大鼠（SHR），ACE2基因

(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析

常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构 象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min， 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，

加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作

聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺 1、定义 丙烯酰胺聚合物是丙烯酰胺的均聚物及其共聚物的统称。工业上凡是含有50%以上的丙烯酰胺（AM）单体结构单元的聚合物，都泛称聚丙烯酰胺。其他单体结构单元含量不足5%的通常都视为聚丙烯酰胺的均聚物。 聚丙烯酰胺，polyacrylamide（PAM），CAS RN：[9003-05-8]，结构式为： n是聚合度。n的范围很宽，数量级为102~105，相应的相对分子质量由几千到上千万。 分子量是PAM的最重要参数。按其值得大小有低分子量（<100×104）、中等分子量（100×104~1000×104）、高分子量（1000×104~1500×104）和超高分子量（>1700×104）四种。不同分子量范围的PAM有不同的使用性质和用途。 2、分类 聚丙烯酰胺按在水溶液中的电离性可分为非离子型、阴离子型、阳离子型、两性型。 非离子型聚丙烯酰胺（NPAM）的分子链上不带可电离基团，在水中不电离；阴离子型聚丙烯酰胺（APAM）的分子链上带有可电离的负电荷基团，在水中可电离成聚阴离子和小的阳离子；阳离子型聚丙烯酰胺（CPAM）的分子链上带有可电离的正电荷基团，在水中可电离成聚阳离子和小的阴离子；两性的聚丙烯酰胺（AmPAM或ZPAM）的分子链上则同时带有可电离的负电荷基团和正电荷基团，在水中能电离成聚阴离子和聚阳离子，ZPAM的电性依溶液体系的PH值和何种类型的电荷基团多寡而定。 PAM的电性称谓和所带的电荷基团解离后的电性称谓相同。 按照聚合物分子链的几何形状可把PAM分为线型、支化型和交联型。PAM分子链的形状一般是线型结构。但是在丙烯酰胺自由基聚合反应的过程中会发生链转移反应。

小分子肽多肽

百病本源——神奇的小分子肽（免疫球蛋白小分子肽） 益寿康免疫球蛋白小分子肽 配料表：胶原蛋白肽、牛初乳冻干粉、葡萄糖、安赛蜜、卵白蛋白 规格：75g（5g×15） 用量：请在医生的指导下服用。（温馨小提示：本品一定要用温水冲调，记着是温水哦） 本品每袋含免疫球蛋白1Gg 抗体含量560mg 免疫球蛋白来源于“黄金奶源带”的牛初乳中提取；牛初乳到加工车间加工过程不超过20分钟，以保证营养含量和抗体含量不流失。 胶原蛋白肽：胶原蛋白肽来源于深海鳕鱼身上提取的。是由胶原或明胶经蛋白酶降解处理后制成的一种胶原蛋白前体产品，比普通胶原蛋白分子量小，更易消化吸收。针对于人体衰老细胞分裂、衰竭、萎缩，微整形术后损伤、新细胞再生受阻、细胞生长变异、增生等多项细胞修复功能障碍问题研发的医生营养。 大量国内外研究证明，胶原蛋白肽具有多种功效，例如抑制血管紧张素转化酶活性，具有抗氧化活性，能消除自由基，减少膝关节或髋关节等骨关节炎患者的疼痛，增强骨密度，维持骨代谢平衡等。 益寿康免疫球蛋白中的肽是以小分子肽的形式出现。小分子肽又称寡肽，或称为低聚肽，一般由2～10个氨基酸组成，拥有很多独特的生物活性，是蛋白质结构的功能片断，在生物体内具有重要的生理功能，小分子肽可介导细胞与细胞、蛋白质与蛋白质、细胞与蛋白质及其他非肽类药物、蛋白调控因子与基因表达之间的相互作用。所以，小分子肽虽然在生物体中含量较少，但活性强、作用大，是细胞分化、识别、免疫、应激、衰老及分子进化等一切生命过程的参与者或调节因子。 小分子肽的优势： 抑制——抑制细胞变性，增强人体免疫力。 激活——激活细胞活性，有效清除对人体有害的自由基。 修复——修复人体变性细胞，改善细胞新陈代谢。 促进——促进、维持细胞正常平衡的新陈代谢。 A、四大优势 1.直接 直接吸收，不需要消化，直接作用于细胞，激活细胞活性，修复基因。 2.快速 快速吸收，如同针剂。主动吸收，运送营养。100%吸收，无排泄废物。 3.全面 调控人体八大系统，使人体器官达到最佳运转机制。 4.安全 与人体自身分泌的完全一样，对人体无任何毒副作用。 B、五大作用 作用一：健壮筋骨，预防风湿、类风湿、骨质疏松、松骨、骨膜、滑膜、关节等。 作用二：提高免疫力，预防白血病、白癜风、牛皮癣、甲亢、癌症等。 作用三：延缓机体衰老，恢复心、肝、肺、肾等脏器功能。 作用四：修复受损组织，包括胃肠粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜、眼角膜、视网膜、虹膜等。 作用五:修复肝损伤，改善心脑血管、促进造血和代谢功能，调节内分泌，术后和化疗后体能恢复等。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

【跑电泳的步骤】 1、取出电泳仪器和四个烧杯； 2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口； 3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口； 4、取出所有药品。Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好； 5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只； 6、先配分离胶 7、组装凝胶模具，插好板 （1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里； （2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。 8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂； 9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）； 10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干； 11、配浓缩胶； 12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我； 13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。），样品煮沸3分钟； 14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内； 15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV； 16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。 【附配方】 分离胶separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL)1板2板

Prescription12%10%7.5% 3.5 mL7.0 mL Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL 1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL0.91 mL 1.82 mL 30%Acry/bis 2 mL 1.7 mL 1. 3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶（29.2g+0.8g/100mL） 10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL 10%AP50uL50uL50uL35uL70uL 7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uL 3.5uL uL 浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL) Prescription Volume(2 mL)(2 mL) Del H2O 1.4mL 2.1mL 0.5M Tris-HCL pH6.8250uL375uL 30%单体胶330uL495uL 10%SDS20uL30uL 10%AP20uL30uL TEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏) 【附所需试剂配制】 1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在

美极客小分子肽-徐老师

美极客小分子肽-徐老师 要想知道获得健康，那么就要知道人类为什么会生病，是吗？从根源找起。徐老师微信：746894458我们人体是由什么组成的？细胞对吗？那么我们人类就不该有成千上万种病，而是只有一种病，那就是细胞故障，我们的细胞生病了为什么我们的细胞会生病呢？细胞得不到需要的营养，因为我闷偏食，喜欢的就拼命吃，不喜欢得一口不吃，又因为平时我们吃的东西都含有一定得毒素，时间一长造成了毒素超载，从而细胞就生病了了！我们身体的毒素只有20%通过排便系统排出来的。剩下得80%都将进入我们得血液里，最后导致疾病，那么得病了怎么办？ 世界卫生组织告诉我们说，治愈疾病的最有效的途径就是修复细胞，改善细胞，激活细胞，如何做到这些呢，那就是要补充能够合成肽的物质，叫做活性肽。徐老师微信：746894458什么是肽？肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，是介于大分子蛋白质和氨基酸之间的一段最具活性、最易吸收、生理功能效价高的一种崭新营养。分子量段在5000~180之间的才能称为“肽”。分子量段在5000~3000之间的肽称为“大肽”；分子量段在3000~1000之间的肽称为“多肽”，分子量段在1000~180之间的称为“小肽”、“寡肽”、“低聚肽”，也称为小分子活性多肽，一般由

2~6个氨基酸组成。生物学家将肽称为“氨基酸链”，将小分子活性多肽统称为“生物活性肽”。“酶法多肽”是生物活性肽中一类具有极强活性和多样性，具有天然绿色食品属性，功效营养成份最完整的小分子活性肽。到现在，人们已发现100多种存在于人体的肽，对于多肽的研究和利用，在世界范围内已经出现了一个空前的繁荣景象。肽的特点就是直接吸收不需要经过肠胃消化，第二就是快速吸收，喝下去5-10分钟就进入我们所有器官血液，徐老师微信：746894458肽是构成人体细胞的基本材料，人体的一切活性物质都是以肽的形式存在，没有肽生命就会停止。科学家研究发现，30岁以后，活性肽在体内的分泌量会逐渐下降，尤其是生存环境的破坏以及不健康的生活方式导致现代人严重缺肽，缺肽会导致细胞逐渐萎缩，分裂减缓，并失去原有的活力，这时组织器管慢慢萎缩，功能渐渐退化，身体开始快速衰老并且疾病丛生。人体各个领域，包括激素，神经，生殖及细胞的更新，代谢，生长，修复，以及各个器官和细胞得生理功能都有肽的参与，所以我们要健康就要立刻补肽，是不是，很多运动员或者健美人士都知道要补蛋白质，所以去喝那些桶装蛋白质粉，其实他们不知道直接喝蛋白质作用不是很大，为什么呢？第一就是液体蛋白，人体分解它的能力很弱，第二呢，液体蛋白遇酸就会变性，而我闷得胃是不是酸性的，所以大多数的蛋白质都被破坏了！而只有小分

SDS-PAGE电泳问题总结

SDS-PAGE电泳问题总结(2012-04-19 20:07:12)转载▼ 标签：杂谈分类：々☆常用技术☆々 蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？ 回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不 一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善 胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量 丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围 15 ％15～45 kDa 12.5％15～60 kDa 10 ％18～75 kDa 7.5％30～120kDa 5 ％60～212kDa 来源于《蛋白质技术手册》汪家政 每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区 间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家 尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。 下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了 SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降 低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。 做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的 加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久， 否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很 简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不 如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。

聚丙烯酰胺PAM

PAM申华原料规格： 申华化学工业有限公司 原料规格表M40-RAD-01 RAW MATERIAL SPECIFICATION 1、原料名称（Material） 原料编号（Code No.）M-4030 版别：1.0 原料名称（Material）聚丙烯酰胺(部分水解)〖Polyacrylamide (PAM)〗 2、规格项目（Specifications） 规格项目（Specifications）指标（Limits）测试方法（Test Method） Appearance White Grain Total Solid / % ≥90 Solubilization Speed / hr ≤1.5 Anion Content / % 20-30 即水解度 Free Monomer / % ≤0.05 3、分子式（Formula） ?[?CH2?CH?]m?[?CH2?CH?]n? ∣∣ C＝O C＝O ∣∣ NH2O Na 4、分子量（Molecular Weight）：3000,000-13000,000 聚丙烯酰胺(cpolyacrylamids)简称PAM，是一种线型高分子聚合物，是水溶性高分子化合物中应用最为广泛的品种之一，聚丙烯酰胺和它的衍生物可以用作有效的絮凝剂，增稠剂，纸张增强剂，以及液体的减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、煤矿、矿冶、地质、轻纺，建筑等工业部门。 一、市售产品规格及主要技术指标 技术指标名称PAM 阴离子PAM 非离子PAM 阳离子PAM 复合离子 外观白色或微黄色粉末 粒径，mm < 2 固含量(%) ≥ 88 溶速(mim) ≤ 1.5 不溶物(%) ≤ 2 分子量(万) 500-2400 300-600 300-800 800-1500 水解度(%) 13-30 5-15 离子度5-50 10-20 注：根据用户要求，分子量控制在表格所定指标的范围内根据市场价格面议 加强混凝作用 ⑴聚合氯化铝（PAC）聚合氯化铝又名碱式氯化铝或羟基氯化铝。它是以铝灰或含铝矿物作为原料，采用酸溶或碱溶法加工制成。其分子式为[Al2(OH)nCl6-n]m ，其中m为聚合度，单体为铝的羟基配合物Al2(OH)nCl6-n ，通常n=1~5，m≤10。聚合氯化铝溶于水后，即

大豆小分子肽详细介绍

大豆多肽 大豆多肽(soy peptide) ,即肽基大豆蛋白水解产物( peptide - based soy protein hydroly-sate)的简称。它来源于大豆蛋白质的酶解产物，是大豆蛋白质经蛋白酶作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物。大豆中的蛋白质含量高，质量好，营养价值很高，与牛肉的营养价值大致相当。大豆蛋白质所含必需氨基酸种类全面，数量丰富,必需氨基酸模式(氨基酸比值)与人体需求较接近,消化率也较高。大豆多肽通常是由3~6个氨基酸组成的低肽混合物,相对分子质量分布以低于1000D的为主，主要出峰位置在相对分子量300 -700D范围内。其氨基酸的组成与大豆球蛋白十分相似，必需氨基酸的平衡良好,含量也很丰富,因此营养价值很高。 大豆多肽的特点 (一)黏度较低，溶解度较高 大豆蛋白的黏度随浓度的增加而显著增加。因此，大豆蛋白的浓度不能提得太高,超过13%就会形成凝胶状。若加工成酸性蛋白饮料时，pH值接近4.5左右(大豆蛋白的等电点)时就会产生沉淀。而大豆多肽则没有上述缺点。它的黏度较低而溶解度较高，这是因为水解物的分子量减小了；水解后产生了一些可离解的氨基和羧基基团,增加了水解物的亲水性。与大豆蛋白质相比，大豆多肽具有以下特点:①即使在高浓度时,其黏度较低:②在较宽的pH值范围内仍能保持溶解状态;③吸湿性与保湿性好。大豆多肽的这些性质有利于开发新产品。 (二)渗透压不高 大豆多肽溶液的渗透压的大小处于大豆蛋白与同一组成氨基酸混合物之间。当一种溶液的渗透压比体液高时,易使人体消化道周围组织细胞中的水分向胃肠腔内移动而出现腹泻。氨基酸类食品口服易发生这类问题。大豆多肽的渗透压比氨基酸的低得多。因此，大豆多肽可作为口服营养液使用。 (三)吸湿性，保湿性强 大豆多肽的吸湿性和保湿性比胶原蛋白多肽和丝蛋白多肽更强,这一特性非常适合于日 用化学工业用来配制护发膏及护发霜。 (四)能调节产品质构 大豆多肽具有抑制蛋白质形成凝胶的特性,可用来调整食品的硬度与质构。例如，水产品肉禽蛋白质及大豆蛋白质在加热时会形成凝胶，或面粉在形成面团时都会使质构变硬，如果添加一定量的大豆多肽,就会起到软化凝胶的作用。这一特性，可应用于火腿、香肠、鱼糕等高蛋白食品的软化。 大豆多肽的功能特性 大豆多肽即“多肽基大豆蛋白水解物"的简称,是大豆蛋白质经蛋白酶作用或微生物技术

最全的聚丙烯酰胺分类与特点详解

最全的聚丙烯酰胺分类与特点详解 有代表性的高分子聚丙烯酰胺有：非离子型聚丙烯酰胺（简写NPAM，分子量800-1500万）、阴离子型聚丙烯酰胺（简写APAM，分子量800-2000万）、阳离子聚丙烯酰胺（简写CPAM，分子量800-1200万，离子度10%-80%）。用量一般为废水量的百万分之一至百万分之二。 阴离子聚丙烯酰胺（APAM）产品特性：阴离子聚丙烯酰胺（APAM）外观为白色粉粒，分子量从600万到2500万。水溶解性好，能以任意比例溶解于水且不溶于有机溶剂。有效的PH值范围为4到14，在中性碱性介质中呈高聚合物电解质的特性，与盐类电解质敏感，与高价金属离子能交联成不溶性凝胶体。 阳离子聚丙烯酰胺（CPAM）产品特性：阳离子聚丙烯酰胺（CPAM）外观为白色粉粒，离子度从20%到55%水溶解性好，能以任意比例溶解于水且不溶于有机溶剂。呈高聚合物电解质的特性，适用于带阴电荷及富含有机物的废水处理。适用于染色、造纸、食品、建筑、冶金、选矿、煤粉、油田、水产加工与发酵等行业有机胶体含量较高的废水处理，特别适用于城市污水、城市污泥、造纸污泥及其它工业污泥的脱水处理。

两性离子聚丙烯酰胺是由乙烯酰胺和乙烯基阳离子单体丙烯酰胺水解共聚而成。分子链上既有阳电荷，又有阴电荷的两性离子不规则聚合物。 非离子聚丙烯酰胺（简写NPAM) 产品特性：非离子聚丙烯酰胺系列产品是具有高分子量的低离子度的线性高聚物。由于其具有特殊的基团，便赋予它具有絮凝、分散、增稠、粘结、成膜、凝胶、稳定胶体的作用。污水处理剂：当悬浮性污水显酸性时，采用非离子聚丙烯酰胺作絮凝剂较为合适。这时PAM起吸附架桥作用，使悬浮的粒子产生絮凝沉淀，达到净化污水的目的。也可用于自来水的净化，尤其是和无机絮凝剂配合使用，在水处理中效果最佳。

设计一个制作抗小分子多肽单克隆抗体的流程

实验生物学考试 部门：研发姓名：王晓婧8．叶敏设计一个制作抗小分子多肽单克隆抗体的流程 用杂交瘤技术制备抗小分子多肽单克隆抗体的主要步骤如下（示意图见下图）： 1、获得免疫的B淋巴细胞 用此小分子多肽作为抗原注射进小鼠体内，使其淋巴细胞产生相应的抗体。对小鼠做三次免疫，并在取其脾脏的前三天做一次加强免疫，可使得到的抗体亲和力较好，此过程中不用分离脾脏中的B细胞和T细胞，因为与骨髓瘤融合的过程本身就是一个选择B细胞的过程。 取与免疫小鼠同系的小鼠的骨髓瘤细胞，可用不分泌型和酶缺陷型，现多用酶缺陷型，缺乏TK（胸腺嘧啶核苷激酶）和HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）。 2、融合 可用化学融合法和电融合法等。常用的化学融合剂为PEG（聚乙二醇），其分子量越大，融合率越高，但同时毒性也越强，故用作细胞融合剂的PEG一般选用分子量为4000及以下的，在pH8.0～pH8.8左右的碱性环境中。电融合用电脉冲，无毒且融合率也高。 3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶Thymidine T）。在HAT 培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏TK和HGPRT，不能利用补救途径合成DNA，而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，故不可避免的要死亡。 停用HAT培养基后，用HT培养基。未融合的B细胞和T细胞在正常培养的情况下都会自然消亡。 这样，只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了TK和HGPRT，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能增殖。 4、筛选 在HA T培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此必须进行筛选。常用酶联免疫吸附测定（ELISA），筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。 5、克隆化 对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告

一、实验目的 1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理； 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳： (1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素： ①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； ②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； ③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； ④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； ⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） (1)定义 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） (2)SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 (3) SDS-PAGE分类： ?SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类： 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成： 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种：

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量

聚丙烯酰胺 PAM

聚丙烯酰胺 河南佰科聚丙烯酰胺厂生产的佰科牌阳离子聚丙烯酰胺是一类新型高效的有机高分子絮凝剂,因其分子链节上带有阳离子,与废水中带阴离子的胶体颗粒进行电荷中和作用,降低ζ电位,压缩扩散层。同时,阳离子型聚丙烯酰胺的长链产生架桥效应,使胶体絮凝。其它悬浮的颗粒也被吸附、包卷和捕集,并相互集结形成大的絮体,即“中和”与“架桥”作用。因此阳离子型聚丙烯酰胺在污水处理中越来越受到重视。另外，聚丙烯酰胺在市政污水处理领域也扮演着重要的角色。日益严格的法规促进了水处理工业的发展，市政污水处理领域不仅未受到金融危机的影响，反而表现出良好的增长势头。包括摩洛哥、突尼斯、阿尔及利亚和埃及等国家在内的北非地区出现了新的市政污水处理市场，而其他一些国家，例如沙特阿拉伯和卡塔尔，也正在加大对水处理的私有化投资。在工业废水处理方面，煤炭开采和热电站建设提供了巨大的业务空间，而对中水回用技术的日益关注也是一个市场推动因素。 子量在300-2000万之间，产品外观为白色或略带粉末，液态为无色黏稠胶体状,温度超过120℃易分解,易溶于水,其水溶液几近透明的粘稠液体，属非危险品，无毒、无腐蚀性，固体PAM有吸湿性，吸湿性随离子度的增加而增加，PAM热稳定性好；加热到100℃稳 定性良好，但在150℃以上时易分解产中氮气，在分子间发 生亚胺化作用而不溶于水，密度（克）毫升23℃1.302。玻 璃化湿度153℃，PAM在应力作用下表现出非牛顿流动性。 本品无毒，注意防潮、防雨,避免阳光曝晒。贮存期：2年,25kg 纸袋（内衬塑料袋外为贴塑牛皮纸袋）。堆高不超过10层. 聚丙烯酰胺产品详情：PAM为水溶性高分子聚合物， 不溶于大多数有机溶剂，具有良好的絮凝性，可以降低液体 之间的磨擦阻力，按离子特性分可分为非离子、阴离子、阳 离子和两性型四种类型。 度高，在阳离子絮凝剂中一般是指添加的阳离子单体多，阳离子单体很昂贵，所以，离子度往往和成本密切相关。在阴离子絮凝剂中则一般是水解后呈阴性的基团，如--COOH多，水解程度强。很多SS类型物质的表面往往带有电荷，显然，同样带有电荷的絮凝剂就可以利用异性相吸的原理来絮凝SS类型的物质。电荷中和后再利用聚丙烯酰胺本身的分子链来形成大的絮团。这个是污水絮凝剂的基本原理。 我国的印染企业大多集中在江浙广等地,所产生的废水基本上内部处理,印染废水处理常用的物化处理工艺主要是混凝沉淀法与混凝气浮法。电解法、生物活性炭法和化学氧化法等有时也用于印染废水处理中。而这些要用到聚丙烯酰胺的地方选择各种离子度，混凝剂一般用阴离子聚丙烯酰胺，物理处理有用到阴离子或者非离子絮凝剂，生化污泥一般采用阳离子或者高分子量的非离子比较常见。 ?油田应用于油水分离 在油田开发过程中,为了提高油井产量和原油采收率,需要大量的水资源进行注水驱油同时,随着原油的采出,地层水和注入水又会随着原油一起被采出,在地面进行油水分离后产生大量采油污水,为节约水资源和降低水的应用成本,必须考虑采油污水的净化回用问题。针对姬塬采油区采油污水具有

小分子肽电泳

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽 [日期：2007-02-13] 来源：[字体：大中小] SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽 第四军医大学学报2000年第21卷第6期 石继红赵永同王俊楼韩苇颜真张英起 摘要：目的 研究SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示小分子多肽的方法.方法观察不同方法处理的样品，上样量对电泳结果的影响及对分子量标准（M r2512～16949）进行直线回归分析.结果样品的不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔5～10μg较佳；分子量标准直线回归系数r=-0.962.结论样品处理方便；上样量少；在160 g·L-1 T，60 g·kg-1 C较低的丙烯酰胺含6 mol·L-1脲的分离胶中能够显示M r为2512的多肽，是 一种显示小分子多肽的较好方法. 关键词：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；肽；蛋白质 0引言

20世纪60年代Shapiro建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性，但对于M r小于10000的蛋白质来说是无能为力的［1］. 20世纪80年代初Sch?gger等［2］应用脲分离蛋白质复合体亚单位的11种蛋白质，但分离效果不甚理想且重复性较差.之后他们又进行了系统地研究和摸索，能够分离较大M r范围内的蛋白质.随着生物技术的飞速发展和基因工程药物的大量涌现，具有高生物活性的小分子多肽的分离、纯化和鉴定已显得尤为突出.我们在进行基因工程药物的开发研制中，对SDS-PAGE方法进行了多次改进，在较低的丙烯酰胺浓度下取得了理想的结果.此法所需仪器简单，操作方便，重现性好，时间短，只需微克量的多肽便可显带且能迅速估计出其M r，值得进一步推广和利 用. 1材料和方法 1．1试剂和仪器SDS、脲、甘油、过硫酸铵均为分析纯，西安化学试剂厂出品；丙烯酰胺（分析纯）为汕头市光华化学厂产品；N，N′-甲叉双丙烯酰胺（分析纯）为浙江黄岩人民化工厂生产；tris（分析纯）为成都试剂厂出品；TEMED为BIO-RAD产品；Tricine(Ultra pure Grade)为Solon Ind产品. BIO-RAD小型垂直式电泳附件模具；FD-201 稳压稳流电泳仪（上海医用分析仪器厂）. 1．2肽分子质量标准肽分子质量标准的M r范围2512～16949为Pharmacia lKB 公司产品. 胸腺肽α1是美国加州圣马刁市赛生药品公司产品（商品名“ZADAXIN”），是一乙酰化的多肽，M r为3108，pI 3.8. 经Sephadex G-25柱去除所含的甘露醇，然后冷冻干 燥，用样品缓冲液配成所需样品. 1．3方法 1．3．1电泳贮存液的配制阳极缓冲液中Tris为0.2 mol·L-1用HCl调pH值至8.9.阴极缓冲液为0.1 mol·L-1的Tris，0.1 mol·L-1的Tricine和0.01 g·L-1的SDS溶液，其pH 值约为8.25. 胶缓冲液为3.0 mol·L-1的Tris和0.03 g·L-1的SDS，用HCl调pH值至8.4. 称取48 g丙烯酰胺和1.5 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，溶解混匀后经4号滤纸过滤即得到495 g·L-1 T，30 g·kg-1 C的贮存液；称取46.5 g丙烯酰胺和3.0 g N，N′-甲叉双丙烯酰胺溶于100 mL纯水中，同样得到495 g·L-1 T，60 g·kg-1 C的贮存液（T 代表丙烯酰胺的总浓度，C代表交联度）.