谷胱甘肽转移酶(GSTπ)与白血病耐药的研究进展

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谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)试剂盒说明书

货号: MS1204 规格：100管/96样 谷胱甘肽S-转移酶 （glutathione S-transferase，GST）试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为 GST 具有 GSH-Px 活性，亦称为 non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST 催化的反应减少 GSH 含量，但是不增加GSSG 含量。 测定原理： GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm 波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸馏水。 试剂组成和配置： 试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加2 mL蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 测定： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂三放在 25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。 3. 空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL试剂一，180μL试剂二和20μL试剂三， 迅速混匀后于340nm 测定吸光度变化，记录10s和310s吸光度为 A1 和 A2。 4. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL上清液，180μL试剂二和20μL试剂三， 迅速混匀后于340nm 测定吸光度变化，记录10s和310s吸光度为A3和 A4。 注意：空白管只需测定一次。 第1页，共3页

谷胱甘肽转移酶抑制剂筛选方法一

谷胱甘肽转移酶（GST） 还原型谷胱甘肽占绝大多数。 谷胱甘肽转移酶 (GST) 是广泛分布于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、寄生虫及微生物体内的一组多功能同工酶。GST是由23-29KDa的不同亚基构成的同源二聚体，每一类GST同工酶中组成的亚基种类有多种，因此编码GST同工酶的基因是一个巨大的超基因家族。 GST主要功能是催化某些内源性或外来有害物质(过氧化物、α, β2不饱和醛酮、烷基或芳香基化合物)的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加其疏水性使其易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的目的，有抑制细胞癌变的功能。 通常认为，谷胱甘肽转移酶的作用是催化谷胱甘肽与外来的或内在的有害物质亲电结合排出体外而起到解毒的作用，但是对于治疗癌症药物的研究主要是针对能够抑制谷胱甘肽转移酶（GST）活性的酶抑制剂，而不是GST催化解毒作用。 研究表明，GST的酶活性水平与肿瘤的耐药性密切相关心。因此，GST可能是治疗耐药肿瘤的潜在药物作用靶点。 与GSTs相关疾病有：人类癌症包括胃癌，结肠癌，胰腺癌和肺癌动脉粥样硬化和冠心病。 近年来对GST抑制剂的研究越来越多，研究报道的GST抑制剂主要有：依他尼酸（EA）及其类似物、TLK199及其类似物、黄酮类化合物、双功能基化合物，还有其他一些抗虐药物如乙嘧啶和奎尼丁等等。 抗肿瘤药物与GSH作用模式图：

图中GST-∏是人体内一种Ⅱ相代谢酶，其对肿瘤的耐药作用主要由其解毒功能引起， 其作用机制：①催化谷胱苷肽(GSH)与亲电子药物如各种烷化剂结合，增加其水溶性，加速其排泄而使药效减低；②清除葸环类药物等产生的自由基，减轻药物自由基对细胞的损伤； ③通过直接与药物结合的形式降低药物活性等。 机理解释：图中是一个肿瘤细胞，当治疗肿瘤的药物顺铂进入细胞时，GST就会催化谷胱甘肽GSH与顺铂结合而将其排出体外，所以为了加强药效，就需要使GST的功能受到抑制，GST 抑制剂占据GST酶活性位点，使GST无法催化GSH与顺铂结合，这样就会降低抗肿瘤药物的耐药性。 筛选方法： 方法一：比色法 在该酶的抑制剂筛选中，采用比色法直接测定底物浓度，主要依据产物有紫外或可见光的特征吸收，通过测定反应体系的OD值变化，测定酶和抑制剂的活性。 实验原理：1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）与谷胱甘肽（GSH）在谷胱甘肽转移酶(GST)的作用下生成复合物CDNB-SG,该化合物在340nm 下呈现最大的光吸收值，根据加入样品前后酶活性的变化情况测定样品对GST的抑制活性。 实验材料： 试剂：还原型谷胱甘肽；1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）；次氯酸钠溶液；待筛选样品。 仪器：SpectraMax M5 型连续光谱酶标测试仪；Costar 384孔微板。

谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase ,GST)活性测定试剂盒使用说明

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）活性测定试剂盒使用说明货号：SN101 规格：50管/48样 产品简介： 谷胱甘肽S-转硫酶（GST）是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与谷胱甘肽巯基的共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-SeGSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。 GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm，通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 试验中所需的仪器和试剂： 紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml石英比色皿、双蒸水 产品内容： 试剂一：试剂一×1支，用前充分溶解于100ml双蒸水中，4℃保存3个月 试剂二：粉剂二×1支；稀释液二×1管，用前将稀释液二加入粉剂二中充分溶解后加双蒸水至 5.0ml，4℃保存3个月 试剂三：粉剂三×1支，4℃保存3个月，临用前加试剂一 5.0ml充分溶解，临用前配制。

操作步骤： 一、样品测定的准备： 称约0.1g组织，加入1ml试剂一，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清(如上清不清澈，再离心3min)。 二、GST测定操作 1、混合试剂配制：将试剂二与试剂一按1：8混合 2、试剂三放在25℃预温 3、分光光度计调到340nm处，设定时间为5min，用双蒸水调零 4、取0.1ml样品与0.9ml混合液混合，于25℃预温5min，再加入试剂三0.1ml，迅速混匀，于340nm处测定5min内吸光值的变化,第0s的吸光值记为A1，第300s的吸光值记为A2 5、空白管测定为操作4中以0.1ml试剂一代替0.1ml样品液 酶活计算： 一、血液GST活性计算 1、GST活力单位定义：在25℃下，每ml血液每分钟催化1μmol/L CDNB与GSH结合的GST酶量为U。 2、计算公式： GST（U/ml）=ΔA340/min×〔106/(ε·d)〕×（V总/V样）=ΔA/min×106/(9.6×103×1)〕×1.1/0.1=ΔA340/min×1145.83

谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展

动物医学进展,2008,29(10):53-56 Pr ogress in Veterinary Medicine 文献综述 谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶研究进展* 马森 (武夷学院化学系福建省高校绿色化工技术重点实验室,福建武夷354300) 摘要:谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽转硫酶(GST)是一对抗氧化酶。GSH-Px为含硒半胱氨酸,至少有4种同工酶,催化还原H2O2和有机氢过氧化物。GST不含硒,有多种同工酶,不能分解H2O2,但具有清除过氧化物和解毒的双重功能。二者广泛存在于组织细胞、红细胞、血浆和乳中,与细胞损伤、缺氧、中毒、衰老、多种疾病的发生有关;GSH-Px活性也与机体硒水平密切相关。文章综述了GSH-Px 和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展。 关键词:谷胱甘肽过氧化物酶;谷胱甘肽转硫酶;研究进展 中图分类号:Q554.6文献标识码:A文章编号:1007-5038(2008)10-0053-04 谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathione pero xidase, GSH-Px)于1957年由M ills从牛红细胞中发现,分子结构中含硒,故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px),是体内清除H2O2和许多有机氢过氧化物的重要酶。1976年,Law rence等发现组织中还存在一种不含硒的GSH-Px,命名为谷胱甘肽转硫酶或不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(g lutathio ne-S-tr ansferase,GST或on-Se-GSH-Px),在体内具有清除过氧化物及解毒的双重功能。文章对GSH-Px和GST的分类与结构、性质、作用、检测原理、动物临床方面的应用及研究进展进行了阐述。 1分类与结构 从人和动物组织或细胞中提纯的GSH-Px,分子质量为76ku~95ku,为水溶性四聚体蛋白,4个亚基相同或极为类似,每个亚基有1个硒原子。目前发现GSH-Px至少有4种同工酶,其在机体中的分布、亚基结构、一级序列和酶学特点上有显著不同。第1种为细胞谷胱甘肽过氧化物酶(cGPx),主要分布在组织细胞的细胞区、线粒体和红细胞中,催化还原H2O2和有机氢过氧化物,对各类氢过氧化物都有较好的催化作用。第2种为磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶(PH GPX),主要分布在各种组织细胞外的细胞液内,部分分布在细胞膜上,主要还原磷脂过氧化氢、脂肪酸过氧化氢和甾体过氧化氢, PH GPX是必需的生物膜组成成分,可阻止生物膜非专一性的磷脂过氧化。第3种为血浆谷胱甘肽过氧化物酶(pGPx),主要分布在血液中,既能还原磷脂氢过氧化物又能还原H2O2。第4种为消化系统谷胱甘肽过氧化物酶(GIGPX),高表达于胃肠道黏膜上皮细胞。牛红细胞GSH-Px有178个氨基酸,第35位是1个硒半胱氨酸。在其亚基结构中有4处A-螺旋和4处B-折叠。整个酶分子中,4个亚基处在一个平面,具有催化活性的硒半胱氨酸位于酶分子表面凹穴的活性部位,易于接触有机氢过氧化物等底物。后者虽然不溶于水,但由于活性基团周围存在一些疏水性芳香环氨基酸残基,形成脂溶性底物可进入的疏水区域,可以与硒半胱氨酸反应,从而使GSH-Px显示很高的反应性。GST是分子质量40ku~50ku的二聚体蛋白质,随着亚基的不同组合而有多种同工酶,如哺乳动物的GST分为A, L,P,H,R等5类水溶性GST,另外还有一类是脂溶性的微粒体同工酶。随着对GST的深入研究,新GST种类不断被发现。已确定了上述5种主要的酶家族中至少一个成员的三维结构,这些结构都具有包括两个结构域的基本蛋白质折叠。大鼠肝胞浆GST是由Ya、Yb、Yc3种不同亚基组合成的YaYa、YcYc、YaYc、YbYb等同工酶,亚基的分子质量为22.5ku~25ku;大鼠肝微粒体GST的亚基分子质量却为14ku;不同来源的GST中氨基酸组成可能有差异,分子质量常不一致[1-5]。 *收稿日期:2008-05-04 基金项目:福建省教育厅/乳谷胱甘肽过氧化物酶研究0项目(JB03266) 作者简介:马森(1947-),男,青海西宁人,教授,主要从事动物生理生化研究。

GST(谷胱甘肽转硫酶)测定

GST（谷胱甘肽转硫酶）测定 原理：GST（谷胱甘肽转硫酶）测定具有催化还原性谷胱甘肽GSH与2，4 二硝基苯CDNB 结合的能力，其结合产物的光吸收峰值波长为340nm,通过测定340nm处吸光度上升速率，即可计算出GST的活力单位。反应式为： C6H3(NO2)2Cl+GSH→C6H3(NO2)2SG+H++Cl- 实验仪器：分光光度计 实验试剂： 1）0.1mol/l 磷酸盐缓冲液PH 6.5（配制见p331） 2) 10m mol/l 还原型谷胱甘肽(GSH)：用前临时配制，15.35mg GSH 溶于少量磷酸盐缓冲液，定容于5.0ml 3) 1.25 mmol/l CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)：称取25.35mg，溶于5.0ml无水乙醇，加磷酸盐缓冲液定容至100ml，室温下可用一周 实验步骤： 取样品，精确称量后（约取0.05g）,加1.5mlPBS冰上研磨，离心，收集上清 酶活测定反应体系（参照孟师兄） 试剂总反应（ml）非酶反应(ml) GSH(10m mol/l) 0.05 0.05 CDNB(1.25 mmol/l) 0.4 0.4 PBS(0.1mol/l) 0.45 0.55 样品液0.1 ------ 混匀后测定0，1，2，3，4，5min处340nm的吸光值 (初步估计要做6个样，每个样做3个平行。药品消耗大概： GSH 1.8ml, CDNB 24.4ml PBS 18ml) GST蛋白浓度测定 （1）标准曲线绘制 试管：0 1 2 3 4 5 6 1mg/ml标准蛋白溶液：0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 双蒸水; 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 向各管分别加入3ml的考马斯亮蓝，测OD595（595nm为GST染色后的特征吸收峰） 结果计算： 1) 计算酶反应的A340值：为总反应测定所得的（A340）总与非酶反应的（A340）非之差，即（A340）酶=（A340）总—（A340）非 2）根据不同时间测定的（A340）酶，计算酶促反应每分钟的平均变化值△（A340）/min 3) 样品中酶的比活力按下式计算：

谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione） 谷胱甘肽(glfftathione)是由Hopkins发现并命名，1929年Hopkins及Kendall等各自独立的发现其为含有甘氨酸的三肽。谷胱甘肽化学名为：N-(N-L-r-Glutamyl-L-cysteninyl)glycine，即N(N-L-r-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸。谷胱甘肽可分为还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidizided glutathione，GSSG)。通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，是由r一谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽。谷胱甘肽是机体内的重要活性物质，它具有清除自由基、解毒、促进铁质吸收及维持红细胞膜的完整性、维持DNA的生物合成、细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。 1 GSH的理化特性 谷胱甘肽分子量为307．33，熔点189～193℃(分解)，晶体是无色透明细长柱状(板状)，等电点(PI)为5.93，成品见光易分解，易氧化，谷胱甘肽分子中有一特殊的6-肽键，即由谷氨酸的6-COOH与半胱氨酸的a-NH：缩合而成，这样的肽键与蛋白质分子中的一个氨基酸中Q-COOH和另一个氨基酸中α-NH2失水缩合而成的肽键显然不同。由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化，2分子还原型谷胱甘肽(简称GSH)，脱氢以二硫键-S-S-)相连便成为氧化型的谷胱甘肽(简称GSSG)，所以谷胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类，在生物体中起重要功能作用的是还原型谷胱甘肽。 2 GSH在自然界中的分布 谷胱甘肽广泛分布于自然界的生物体中(Wierzbicka等，1989)，主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉、血液中，许多植物，如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类及细菌中也含有一定量的谷胱甘肽。在动物细胞中还原型谷胱甘肽水平达5mmol／L，而氧化型仅为0．1mmol／L，细胞内高水平的GSH对动物机体维持正常机能是十分重要的。据测定，谷胱甘肽在未加工的肉中含量是50～200mg／kg，在新鲜水果和蔬菜中的含量是50～150mg／kg，干燥酵母中含有约．15％的谷胱甘肽，在乳制品、谷物和熟食品中含量较低。 3 GSH的代谢过程 谷胱甘肽在体内的代谢过程现已基本清楚。进入血液循环的GSH可被一些组织直接吸收入细胞，也可被组织细胞膜上的r-谷氨酰转肽酶(rGT)降解为r-谷氨酰氨基酸(氨基酸来自细胞外液中的游离氨基酸)和半胱氨酰甘氨酸，而后被二肽酶降解为半胱氨酸和甘氨酸或以二肽的形式转运到细胞内后再被降解为半胱氨酸和甘氨酸。大多数哺乳动物的肾、肝脏、小肠、肺组织中有较高的r-GT和二肽酶活性，它们是清除循环系统中GSH的主要器官。在细胞内，GSH的组成氨基酸在r-谷氨酰环化转移酶、r-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化下生成谷胱甘肽。GSH的合成通过其自身对r-谷氨酰半胱氨酸合成酶的反馈抑制来调控。肝脏是体内合成GSH的主要场所。细胞内的谷胱甘肽在谷胱甘肽硫转移酶(GST)的催化下，可与细胞内外产生的活性亲电子基、有机氢过氧化物(x)结合成GSH-S-复合物，经一系列反应生成N-乙酰-Cys-(x)后运出细胞而排出体外。GSH清除细胞内自由基、过氧化物、ROOH的同时，2分子的GSH转变为GSSG，GSSG在谷胱甘肽还原酶(GR)作用下由NADPH供氢还原为GSH。上述反应形成r-谷氨酰循环。由于猪肾脏中的r-GT与肝脏中的r_GT活力比较低，因此对于猪，肝脏和胆管分支在GSH周转中起重要作用。 4 GSH的生物学功能 谷胱甘肽的生理功能十分广泛，其主要功能有：(1)清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉毒素等毒物；(2)参与氨基酸(谷氨酰氨、半胱氨酸及其它中性氨基酸)的转运；(3)利于铁的吸收、硒的吸收、钙的吸收，谷胱甘肽还可以使饲料中的过氧化脂肪酸在吸收时或吸收后恢复为正常的脂肪；(4)保护胃肠道黏膜上皮，防止因炎症、局部缺血、氧化物质等对肠黏膜的损伤；(5)贮存并提供其组成氨基酸(1尤其是半胱氧酸)；(6)参与蛋白质和DNA的合成;(7)作为还原物质，利于维生素E、维生素c的还原，维持巯基酶活性，并可作为甘油醛磷酸脱

谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法

谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC0350 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体45mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加5mL蒸馏水溶解。 产品说明： 谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。 GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 自备仪器和用品： 紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂 一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 第1页，共3页

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 二、测定： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零。 2.试剂二、试剂三放在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。 3.空白管：取1mL石英比色皿，加入100μL试剂一，900μL试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A1，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A2。 4.测定管：取1mL石英比色皿，加入100μL上清液，900μL试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A3，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A4。 三、GST活性计算： （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。 GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷（ε×d）×106×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。 GST（U/g鲜重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活单位。 第2页，共3页

谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究

X X X大学 生物化学实验技术 生命科学学院 专业：X X X X X X X X X 姓名：X X X 2013/X/X 【摘要】酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10 %。本实验利用亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶，以1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）为底物，研究酶促反应动力学的特性，加深对酶促反应的特点的理解。利用分光光度法测定了GST 的酶活力为0.089 IU，用考马斯亮蓝G-250染色法测定GST 的比活力为11.125 μmol/min?mg，用直线作图法得出了GST 的米氏常为0.26 mmol/L，最大速率0.029μmol/L?min。

谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究

谷胱甘肽转硫酶的制备及 动力学研究 【摘要】酶学研究是生物化学研究中的重要领域。谷胱甘肽转硫酶（Glutathion S-transferases，GSTs）是一类广泛存在于动物和人体各种组织中的参与解毒作用的同工酶家族,其中在哺乳动物肝脏中含量最高，约占肝可溶性蛋白的10 %。本实验利用亲和层析法纯化谷胱甘肽转硫酶，以1-氯-2,4-二硝基苯（ CDNB）为底物，研究酶促反应动力学的特性，加深对酶促反应的特点的理解。用分光光度法测定了 GST 的酶活力为0.089 IU，用考马斯亮蓝G-250染色法测定GST的比活力为11.125 μmol/min·mg，用直线作图法得出了 GST 的米氏常数为0.26mmol/L，最大速率0.029μmol/L·min。 【关键词】谷胱甘肽转硫酶；亲和层析；CDNB；酶活力；考马斯亮蓝G-250染色法；比活力；米氏常数。 【引言】酶是生物体内的重要生物大分子，酶学也是当今生物化学研究的一个重要组成部分。对于酶的研究一般按照以下的策略：分离纯化；测定关键常数，即酶活力、米氏常数等；精细研究活性基团和关键结构域等。本实验以猪肝为实验材料，分离纯化GST 并测定其酶活力和米氏常数。 1.1亲和层析法原理 酶与酶的底物之间可以可逆地结合和分离，将酶的底物结合在亲和层吸柱上，使还有待分离物质的粗提物在有利于酶结合底物的条件下通过层析柱，可以使欲分离的组分吸附在柱上[1]。然后更换缓冲溶液使酶竞争性地从层析柱上洗脱，达到纯化的目的。亲和层析法分离生物大分子示意图如下：

谷胱甘肽S-转移酶(GST)活性检测试剂盒说明书 微量法

谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0355 规格：100T/96S 产品内容： 试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体22mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加2mL蒸馏水溶解。 产品说明： GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。 GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外-可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂 一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入 1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体：直接测定。 二、测定： 1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，用蒸馏水调零。 2.试剂二放在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。 3.空白管：取微量石英比色皿，加入20μL试剂一，180μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A1，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A2。 4.测定管：取微量石英比色皿，加入20μL上清液，180μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于340nm 测定10s吸光度记A3，37℃水浴5min后，快速取出测定吸光度记A4。 三、GST活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样品每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活性单位。GST（U/g鲜重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟催化1μmol CDNB与GSH结合为一个酶活单位。GST（U/104cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×106×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T =0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]÷500

谷胱甘肽的功能

谷胱甘肽的功能 谷胱甘肽以两种状态存在，还原型（GSH）和氧化型(GSSG)。还原态时，半胱氨酸的巯基能给其他不稳定分子一个还原当量，比如活性氧。给出一个电子后，谷胱甘肽自己变得活泼，所以轻易地就能和其他活性谷胱甘肽反应形成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。由于细胞内谷胱甘肽含量相当高（在肝脏里高达5mM），使得这种反应可能发生。GSSG能被谷胱甘肽还原酶还原，再次生成GSH。 在健康的细胞和组织中，90%以上的谷胱甘肽以还原态（GSH）存在，剩下不足10%的以氧化态（GSSG）存在。GSSG/GSH的比例升高是氧分压升高的标志。 谷胱甘肽有多个功能： ●它是由细胞产生的主要内源性抗氧化剂，直接参与自由基和活性 氧化合物的中和，同时保持外源性抗氧化剂比如维生素C和E以还原态（活性状态）存在。 ●控制NO的循环，NO循环对生命来说是至关重要的，如果没被控 制就会出问题。 ●它被用于代谢反应和生化反应中，比如DNA的合成和修复、蛋白 质合成、前列腺素的合成、氨基酸运输和酶的激活。所以，体内的任何系统都能被谷胱甘肽系统的状态影响，特别是免疫系统、神经系统、胃肠道系统和肺。 在动物体内的功能 在共轭反应和还原反应中，GSH被认为是其酶作用底物，在细胞

溶质、微粒体和线粒体中被谷胱甘肽S转移酶所催化。然而，它同样能和一些化学物质参与无酶共轭。 对于N-乙酰对苯醌亚胺（NAPQI）的情形，当GSH由于过量服用退热净（对乙酰氨基酚）而耗尽时，活性细胞色素P450----由扑热息痛（在美国称为退热净）形成的活性代谢物----就会变得有毒，这时候，谷胱甘肽对于用药过量就是一种重要的解毒剂。谷胱甘肽和NAPQI共轭以将其解毒。在这种情况下，它保护细胞蛋白的巯基，否则巯基就会被共价性的改变；当所有的GSH被耗尽时，NAPQI开始和细胞蛋白反应，在这个过程中，杀死细胞。对付过量服用这种止痛药的常用疗法是使用N-乙酰-L-半胱氨酸（通常是喷成雾状），它被细胞加工处理成L-半胱氨酸，并且用于GSH的重新合成。 谷胱甘肽（GSH）参与白细胞三烯的合成，并且作为谷胱甘肽过氧化酶的辅助因子。作为一种重要的亲水性分子，在那些亲脂性的代谢物和毒物成为胆汁的一部分之前，GSH就经肝脏的生物转化作用被加入到那些有毒物质和代谢物中。谷胱甘肽同样对于甲乙二酰的去毒很有必要，甲乙二酰是一种代谢副产物。 这个解毒反应是由乙二醛酶系统执行的。乙二醛Ⅰ型酶（EC4.4.1.5）催化甲乙二醛和还原性的谷胱甘肽转化成S-D-丙醇酰谷胱甘肽。谷胱甘肽Ⅱ型酶（EC3.1.2.6）催化S-D-丙醇酰谷胱甘肽水解成谷胱甘肽和D-乳酸。 谷胱甘肽最近在美容品产业中被用作一种黑色素的抑制剂。在一些像日本、菲律宾的国家，这种产品被卖做美白皂。在酪氨酸酶和左

谷胱甘肽

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抗氧化剂和自由基清除剂谷胱甘肽具有环保护作用的有害影响,包括细菌,病毒污染物和自由基. 调节其他抗氧化剂-谷胱甘肽其他重要的抗氧化剂如维生素C和E不能做好他们的工作,充分保护您的身体免受疾病. 解毒剂- 另一个主要功能是谷胱甘肽的解毒外国化合物等致癌物和有害代谢物. 谷胱甘肽是人体的#1防御细胞的损伤. 维他命A,C,E及贝他胡萝卜素,"抗氧化的"维生素,帮助保护细胞免受损伤. 但主要研究者发现,我们的第一道防线是一种肽(片蛋白),称为谷胱甘肽最重要的抗氧化剂和detoxifier于人体. 优秀的科学家,在史丹福大学研究的影响谷胱甘肽缺乏对人类细胞. "他们指出,如果没有适当的水平谷胱甘肽我们从字面上细胞"自杀"的"经历一个过程称为程序性细胞死亡" 殊死搏斗,在每一个细胞在你身上. 我们的细胞是在打一场仗不断地生存下去.科学家们相信,每一个细胞在体内是攻击000次,一天中的氧和氢分子(freeradicals),企图毁灭我们的身体,结束自己的生命. 这些分子撕裂孔,在我们的细胞,破坏了蛋白质,脂肪,即使是我们的基因.它们可造成的细胞发生变异,成为病害的其他方式,或者干脆停止运转和模具. 破坏氧化自由基牵连的原因是心脏病,中风,阿尔茨海默病,parkenson的疾病,癌症,白内障以及其他健康问题. 这些破坏分子所产生的身体的副产品身体的正常功能. 他们因暴露于太阳X射线和辐射,污染,压力大,体力消耗和因各种疾病. 口服谷胱甘肽(+142%谷胱甘肽)抑制酪氨酸酶活性.一旦酪氨酸酶活性的代谢一直被抑制,然后逆转的时候去合成光色素称为褐色素（phaeomelanin）而非造成皮肤黑、黯淡的合成色素称为真黑素（eumelanin）. 循环不断地流,只要存在左旋谷胱甘肽并存代谢黑色素.最后,轻易将你的皮肤迅速改变为白嫩细腻. 经过美国国家食品药品管理局验证和麻萨诸州州总医院的成分及效果检测，亚当森大学的化验室分析数据材料这一切证明我们的超级全身美白胶囊,是一个最安全的,纯净,有效的口服皮肤增白剂在当今市场.

谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)试剂盒说明书

货号：QS1204 规格：50管/48样 谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。 测定原理： GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配置： 试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体45mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加5 mL蒸馏水溶解。 粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 测定操作： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂三放在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）保温。 3. 测定管：取1mL石英比色皿，加入100μL上清液，900μL试剂二和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光度变化，记录10 s和310 s吸光度为A1和A2。 GST活性计算公式： (1). 按蛋白浓度计算 活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟催化1nmol/L CDNB与GSH结合为1个酶活单位。 GST（nmol/min/mg prot）=(A2－A1))÷ε÷d×109×V反总÷(Cpr×V样)÷T 第1页，共2页

还原型谷胱甘肽的作用机制

还原型谷胱甘肽的作用机制 ( 摘要)肝脏疾病是临床常见疾病，研究还原型谷胱甘肽( Glutathione，GSH) 在 肝细胞中的作用机制，进而描述氧化应激在肝细胞损伤中的作用，着重讨论了还原型谷胱甘肽的本质及其作用机制。结果表明GSH作为抗氧化剂和细胞代谢剂，成为临床中重要的治疗和辅助治疗药物。 （关键词) 氧化应激还原型谷胱甘肽肝损伤 (Abstract) liver disease is common clinical disease of reduced glutathione (Glutathione, GSH) in the mechanism of liver cells, and then describe the oxidative stress in the liver cell injury, focusing on the prototype of glutathione also glycylglycine nature of its mechanism. The results showed that GSH as an antioxidant and cell metabolism of drugs, to become an important clinical treatment and adjuvant drugs. (Key words) oxidative stress; reduced glutathione; liver injury 还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的一种三肽，广泛存在于哺乳动物体内，参与体内三羧酸循环及糖代谢，使人体获得高能量，是细胞内主要的巯基(—S H)和含量最丰富的低分子多肽，是细胞内主要的代谢调节物质，其对生物体氧化还原系统和巯基酶有活化作用，可清除组织中的氧自由基。肝脏是体内GSH主要的合成和消耗场所，其受有毒物质或射线等损害时，可诱导产生大量氧自由基；GSH可提供活性巯基或在酶催化下直与自由基结合，保护和恢复肝细胞功能。GSH能激活多种酶。如巯基(—SH) 酶一辅酶等，从而促进糖类、脂肪及蛋白质代谢。并能影响细胞的代谢过程，是一种细胞内重要的调节代谢物质。GSH由于其广泛的生物效应。临床上除应用于肝脏疾病外，还应用于恶性肿瘤、神经、泌尿、消化、等多种疾病。 现将G S H的作用机制及临床应用综述如下。 一氧化应激损伤肝细胞的机制 肝细胞损伤是各种肝病共同的病理基础，其中氧化应激在肝细胞损伤中占有很重要地位。因此，对氧化应激导致肝细胞损伤的研究便成为治疗肝脏疾病的一个重要途径。机体存在着正常的自由基清除体系。生理情况下，活性氧簇( Reactive Oxygen Species ROS ) 的产生与清除保持平衡，不出现细胞损伤；病理情况下，体内ROS产生过多或抗氧化体系不足，即出现促氧化物与抗氧化物之间的动态平衡失调，过多的ROS 可引起肝细胞膜、线粒体膜、微粒体膜及溶酶体膜发生的脂质过氧化，产生脂质过氧化物( 1ipoperoxides,LPO) 及其降解产物( 如丙二醛MDA等)，LPO不仅使ROS增加，毒性增强，而且可抑制抗氧化系统，削弱细胞防御机制，增加其对外源性过氧化物毒害的敏感性。因此，体内ROS 的过渡激活、脂质过氧化反应的引发和持续是肝细胞损伤的重要病理基础之一。 二GSH的作用机制 还原型谷胱甘肽(GSH)广泛存在于正常细胞，谷胱甘肽作为一种抗氧化剂，能活跃肝脏代谢，保护肝细胞膜，增强肝脏解毒功能，通过外源性补充谷胱甘肽，可增强肝细胞的解毒功能，促进损伤的肝细胞修复、再生，防止胆汁瘀积，促进黄疸消退及肝功能恢复。GSH是非酶性抗氧化剂。通过其巯基氧化一还原态的转换，作为可逆的供氢体。其分子特点是具有活性巯基(-SH)和y-谷氨酰键。其中巯基是GSH最重要的功能基团。巯基参与机体内多种重要生化反应，保护体内重要酶蛋白巯基不被氧化、灭活而保证能量代谢和细胞利用。在GSH代谢途径中，在GSH转移酶( GST )、谷氨酰转肽酶( Y-GTP )、GSH-过氧化

谷胱甘肽化学与酶法合成

谷胱甘肽化学法和酶法合成 1 化学性质 谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH）分子式为C10H17N3O6S，分子量为307.32348，熔点为189~193℃，晶体呈无色透明细长拉状，等电点为5.93。GSH有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型GSH占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。 图1 GSH的结构式 2 药理作用 GSH可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。 3 谷胱甘肽的生产方法 1888年，GSH首先从酵母中分离出来。日本1983年进行了含量较多的GSH 酵母的生产，其后又研究了GSH提取、分离技术及分析检测方法。目前国外实现了GSH规模生产。世界主要的氨基酸制造商Kyowa，Aji-nomoto和Degussa 等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发，仅Kyowa 1998年氨基酸的研究与开发就耗费达1.9亿美元，而GSH是其重点之一，Kyowa目前是GSH主要的供应商。目前GSH的主要生产方法有：萃取法、发酵法、酶法和化学合成法。 3.1萃取法 萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从GSH含量比较高的动植物组织中将GSH分离提取的一种方法，GSH的早期生产都是采用萃取法，是生产GSH的经典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。其工艺路线如下图：

图2 GSH发酵法工艺路线图 该方法的不足：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。 3.2酶法 在酶催化合成GSH中，几种关键的化合物和条件包括：GS HⅠ和GS HⅡ、氨基酸原料(L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸)、ATP、保持GS HⅠ和GSHⅡ活性所必需的辅因子(Mg2+)和一个适当的pH值环境。合成中，需求大量ATP，给GSH的工业化生产带来麻烦，大大提高了GSH生物合成的成本，所以只能寻求一个ATP生成系统来藕联ATP消耗系统。两种系统同在一种生物体内的称为自藕联系统，在多种生物体内的称为共藕联系统。自藕联系统研究的比较少，因为很难找到一种生物体同时含有ATP生成系统和ATP消耗系统。 Murata等人发现酒酵解菌(s.cerevisae)中的葡萄糖是最简单的ATP生产系统之一，可以提供足量的ATP用来GSH的生物合成。酶催化法合成GSH的浓度可以达到99/l，但是所用的氨基酸原料比较贵，提高了GSH生物合成的成本。 3.3发酵法 生物发酵法是利用廉价的糖作为原料，利用微生物体内物质的代谢途径来合成GSH的方法。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此微生物发酵法已成为目前GSH工业化生产的最普遍方法。在工业上，生物发酵法一般都选用s.eerevisae和Candidautilis为原料进行发酵。 一般情况下，微生物细胞中GSH含量不高，仅为细胞干重的0.1~1.0%。过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境，GSH是胞内产物，实际生产过程中需要进行提取，较低的含量无疑会大大提高生产成本。因此，发酵法生产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量。二者的有机结合将有利于GSH产量的大幅度提高。