大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变与筛选 山大微生物大实验
山东大学
实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株
的诱变和筛选
作者：姚健(201000140136)
同组者：刘新强
指导老师：林建群(教授)
实验日期：2013年5月22日-6月1日
微生物大实验报告
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
山东大学生命基地班姚健 201000140136
摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria.
关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选
Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening
1引言
筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
1.1 营养缺陷型
营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株[1]。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得到原养型。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。
1.2 紫外线诱变
诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。
紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。它是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原
子的内层电子能级提高，但不能使原子失去电子。紫外线是微生物育种中最常用的诱变剂之一。由于碱基间电子的相互作用，DNA分子在260nm处有最大的紫外吸收峰，因此决定了紫外线诱导细胞发生突变的有效波长为260nm。15W紫外灯产生的紫外线中，80%集中在260nm左右，诱变效应良好。低剂量紫外线可诱变获得较多的正突变，高剂量紫外线则易产生大量负突变，但可获得特性明显改变的突变菌株。紫外线诱发突变的原理是使DNA同一链上的两相邻胸腺嘧啶之间发生交联，形成胸腺嘧啶二聚体。在DNA复制时，相应核苷酸无法与胸腺嘧啶二聚体配对形成碱基对，DNA复制中断，引起突变。当细胞中的DNA 分子含有大量胸腺嘧啶二聚体时，SOS修复机制被激活，DNA被修复，但包含大量错配的碱基对，从而导致基因突变[2]。紫外线是应用最早的诱变剂。紫外线诱变具有简便易行、诱变效果良好、可大幅提高菌株的生产特性等优点，迄今仍是实验室和工业上常用的诱变手段。
1.3 缺陷型富集——抗生素法
利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被杀死，得以浓缩。本实验采取的筛选方法就是青霉素浓缩法。
1.4 缺陷型检出——点植对照法
营养缺陷型的检出是通过一系列培养基实现的。基本培养基（MM）——能满足野生型和原养型菌株最低营养要求的合成培养基。完全培养基（CM）——能满足各种营养缺陷型菌株营养要求的天然培养或半合成培养基。诱变后的菌体经富集培养后，涂布于CM平板上，将长出的菌落按一定排列次序逐个地点种到MM平板、CM平板的相应位置。培养后，在CM上有菌落生长而在MM的相应位置上没有生长的菌落，可能是营养缺陷型。挑取菌体分别接种于MM、CM上进一步复证[3]。
图1：点种方格图
1.5 缺陷型鉴定——生长谱法
在同一平皿上测定一种营养缺陷型菌株对多种生长因子的需求情况，称生长谱测定[4]。补充培养基（SM）是在MM中有针对地补加某一种或几种营养成分，以满足特定营养缺陷型菌株生长要求的培养基。将所得营养缺陷型菌株的菌悬液与MM混合倾注平板。凝固后，在标定的位置上加少量特定的生长因子（氨基酸、碱基等结晶粉末）。经培养后，出现浑浊生长圈的位置所对应的生长因子即为该营养缺陷型不能合成的营养物质，此菌株即为该物质对应的的营养缺陷型。
2实验材料和方法
2.1材料
2.1.1菌株：大肠杆菌E.coli K12
2.1.2培养基
（1）LB液体培养基（10mL /100mL锥形瓶×4）：酵母膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100ml，pH7.2，高压灭菌121℃，20min。
LB固体培养基（250mL /500mL锥形瓶×1）：在上述液体培养基中添加,2%的琼脂。
（2）2×LB液体培养基(3mL/试管×2)：酵母膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水50ml，pH7.2。
（3）基本培养基：Vogel 50×（即浓缩50倍）：MgSO4·7H2O 10g，柠檬酸100g，NaNH4HPO4·4H2O 175g，K2HPO4·2H2O 599.88g，水600ml。使药品溶解后再定容1000ml。
（4）基本固体培养基：50×2ml，葡萄糖2g，蒸馏水98ml，琼脂2g，pH7.0，高压灭菌115℃，20min。
（5）无N基本培养基（5mL /100mL锥形瓶×1）：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，水100ml，pH 7.0，高压灭菌115℃，20min。
（6）2N基本培养基(5mL/试管×1)：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，硫酸铵0.2g，葡萄糖2g，水100ml，pH 7.0，高压灭菌115℃，20min。
2.1.3 试剂
蒸馏水、生理盐水（4mL/管×10）
混合氨基酸和混合维生素：氨基酸分7组，其中6组每组6种氨基酸，每种氨基酸等量研细充分混合。第7组是脯氨酸，因为这种氨基酸易潮解，所以单独成一组。
Ⅰ赖氨酸精氨酸甲硫氨酸半胱氨酸嘌呤胱氨酸
Ⅱ组氨酸精氨酸苏氨酸谷氨酸天冬氨酸嘧啶
Ⅲ丙氨酸甲硫氨酸苏氨酸羟脯氨酸甘氨酸丝氨酸
Ⅳ亮氨酸半胱氨酸谷氨酸羟脯氨酸异亮氨酸缬氨酸
Ⅴ苯丙氨酸胱氨酸天冬氨酸甘氨酸异亮氨酸酪氨酸
Ⅵ色氨酸嘌呤嘧啶丝氨酸缬氨酸酪氨酸
Ⅶ脯氨酸
Ⅷ把维生素B1、B2、B6泛酸，对氨基苯甲酸（BAPA），烟碱酸及生物素等量研细，充分混合，配成混合维生素
Ⅸ空白对照（CK）
表1：混合氨基酸配制
2.1.4 仪器
试管，三角瓶，5mL离心管，移液枪，枪尖，称量纸，玻璃棒，接种环，振荡器，离心机，振荡培养箱，恒温箱，7cm小培养皿1个，9cm培养皿20个，涂布棒，酒精灯，无菌超净台，烧杯，容量瓶，牙签，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，黑布等。
2.2实验方法
2.2.1 菌悬液制备
（1）用接种环取E.coli K12 一环加入到10ml LB培养液中在恒温振荡培养箱中37℃，150r/min振荡培养过夜。
（2）取0.3ml 菌液转接到10ml LB培养液中，在37℃摇床上振荡培养4—6小时，使细胞处在对数生长期；
（3）取适量菌液加入到5ml离心管中，7000rpm离心3—4 min，离心2次，弃上清液，打匀沉淀，加入4ml无菌生理盐水，充分振荡混匀。
2.2.2 诱变处理
取3ml菌悬液，加入到7cm小皿内，轻轻震荡使其均匀在皿底形成一薄层。平放在灭菌的超净工作台上，盖盖灭菌1min，然后打开皿盖照射2.5min，后加入2倍LB培养基3ml，盖上黑布在37℃中黑暗培养12h以上。
2.2.3 诱变后处理
（1）取3ml诱变后菌液加入到离心管中，7000rpm离心3—4分钟，弃上清，再将培养皿中剩余的菌液一起倒入离心管中，7000rpm离心3—4分钟，弃上清，加入4ml生理盐水离心洗涤2次，重悬于3ml生理盐水中，取0.2 ml加入到5ml无氮基本培养基内，置于恒温振荡培养箱中37℃，150r/min振荡培养12小时以上。
（2）加入2N培养基5ml和适量氨苄青霉素，使菌液中的青霉素终浓度为20μg/ml，37℃下振荡培养。
2.2.4 检出缺陷性菌株
（1）从培养12、16、24h的菌液中，各自取100μl，分别在LB完全培养基和基本培养基上涂布2个平板，做好标记，在37℃下培养36—48h。
（2）从上述涂布的平板中选取完全培养基上菌落远大于基本培养基上的一组进行点种。将提前制好的
方格纸贴于平板背面。用无菌牙签从上述完全培养基上挑取又圆又小的菌落按照先基本后完全的顺序点种在新鲜的平板上。挑取约200个菌落，37℃培养过夜。 2.2.5 复证
挑取LB 完全培养基上有而基本培养基上没有的菌落，在基本培养基上划线复证，并在完全培养基上保留备份，37℃过夜培养。24小时后仍不长的为缺陷型。 2.2.6 生长谱鉴定
（1）将待测缺陷型接于10ml LB 培养基中, 150r/min 振荡培养过夜。取3mL 菌液加入离心管中，7000r/min 离心3—4min ，再加入3mL 菌液，离心，共加3次菌液，每次3mL ，收集菌体，加入生理盐水离心洗涤3次制成3ml 菌悬液，取1 ml 菌悬液于平皿中央，迅速加入基本培养基，迅速混匀，待平板冷却后做生长谱实验。在平板的背面将小平板划分为9个区域。将混合物质轻轻抖落在标定位置，注意不能出现可见的粉末颗粒。点好样后等上一段时间待营养物质渗入培养基中，再倒置放于培养箱中37℃培养。 （2）观察培养结果，根据生长情况以及组合分析，确定是何种缺陷型。
3 实验结果及分析
3.1 营养缺陷型浓缩
3.1.1 青霉素浓缩法处理大肠杆菌不同取样时间生长情况
图2：12h 取样时野生菌和突变菌的涂布情况 图3:16h 取样时野生菌和突变菌的涂布情况
图4:24h取样时野生菌和突变菌的涂布情况
通过观察图2、图3、图4，发现随着培养时间的增加，完全培养基和基本培养基上的菌落数逐渐下降。观察12、16、24h菌液涂布后培养的菌落生长情况，在12h、16h和24h的基本和完全培养基上都有菌落长出，12h、16h时涂布的平板菌浓很大。由于12h培养时间过长，很难找单菌落；16h 的完全培养基中的菌落数与基本培养基上菌落数的比例相较24h的要小，说明在24h时营养缺陷型菌株有最大富集度。挑取24h的完全培养基上的单菌落以先基本后完全的方式进行点种，37℃培养过夜，观察菌落生长情况。
3.2营养缺陷型检出和鉴定
3.2.1 营养缺陷型检出
图5：点种平板结果（左为基本培养基，右为完全培养基）
在9、31、49、56、78、81、109和115号格子对应的完全培养基生长了菌落，而相同位置的基本培养基却没有菌落生长，因此可以暂认为这些菌株为营养缺陷型菌株。
实际比较选择过程中，很难确定基本培养基上是否长出菌落，这可能是因为点钟过程中用力过大，在培养基上留下一个印，光线使得很难判断出到底是长出来的菌落还是戳的印，所以就需要将认为是发生了突变的菌株进行复证。
3.2.2 营养缺陷型复证
图6:营养缺陷型的划线复证（左：完全培养基右：基本培养基）
观察图6，9、31、49、56、78、81号菌株在完全培养基和在基本培养基上都生长，说明这6个菌株不是营养缺陷型菌株，表明之前的点种检出营养缺陷型操作产生了假阳性反应。而这6个菌株之所以在点种实验步骤中不在基本培养基上生长可能是因为菌体在基本培养基上生长缓慢，而且点种接种量小，培养时间短，所以形成的菌落很小，加之点种前可能划破了平板表面，从而影响观察并造成误差。109、115号菌株在基本培养基上不长，因此可能为诱变菌株。最终选取了109、115号作为生
长谱鉴定备选菌，下图为对109和115号菌株的生长谱鉴定结果。
3.3生长谱鉴定结果
图7:109号菌株生长谱鉴定结果
图8:115号菌株生长谱鉴定结果
观察图7和图8，两个菌株在两个平板上都长满了，可以知道109、115号菌株营养缺陷型生长谱鉴定的结果是混合氨基酸组和混合维生素组均有菌落长出，基于这个结果，现分析如下：（1）菌株长满平板有一种可能，那就是含有它不能自己合成的氨基酸的混合氨基酸添加过量，渗透到了整个平板。平板这时候可近似看做是完全培养基，所以这时即使是有营养缺陷型也鉴定不出来。
（2）它们都是原养型的菌，但是在复证的时候可能由于某种未知的原因导致其没有在基本培养基上生长。之后的生长谱测定中，可能由于初始温度稍高之类的差异导致了原来限制生长的因素消失，于是普遍都能生长。
（3）菌株还可能发生了回复突变，但这种情况出现的概率太小。
（4）109、115号菌悬液制作过程中未能洗净其中的完全培养液，使得营养充分，而在平板上生长，导致实验的失败。
（5）基本培养基加入氨基酸后（外界高渗溶液）导致细胞膜通透性增加，而该菌发生营养缺陷的原因刚好是转移酶受到了抑制。因此酶的作用底物能够顺利到进入细胞内被进一步合成利用。
4注意事项
（1）紫外诱变需要避光，以防光修复作用。
（2）在进行生长谱测定洗涤菌液时，要将离心后的上清液全吸净，若有LB培养基成分则会促进菌体生长，从而不能确定是否有缺陷型菌种。
（3）在倾注平板时，培养基温度不能太高，也不能太低。太高则容易杀死细菌，太低则容易凝固，导致培养基不均匀，不能铺成平板，也能导致菌液不均匀，从而不能确定是否有缺陷型菌株产生。（4）实验过程中要严格控制无菌，在菌落的选取、划线培养、菌悬液的吸取、接种等环节都要进行严格的无菌操作，任何一步的杂菌污染都会对最终的实验结果造成严重影响。
（5）紫外线对皮肤和眼睛有很大伤害，实验中应避免人体暴露在紫外线中。各种器具、培养基及需加入培养基中的试剂均需灭菌。
（6）无N和2N培养基的使用，是为了浓缩营养缺陷型。
（7）点种时要先基本后完全，并注意不要划破培养基表面。
（8）复证是必须的，不可轻视，点种容易出现假阳性反应。
（9）营养缺陷型鉴定时要使用倾注平板，不能采用涂布的方式，倾注平板能够较好的保证菌体能够分布的均匀。而且如果涂布的话，在培养基表面容易留下水迹，造成了氨基酸的溶解扩散，使实验失败。（10）生长谱鉴定时，点的氨基酸量不能太多，防止扩散混杂。
（11）在做检出缺陷性菌株时，用无菌牙签从上述完全培养基上挑取又圆又小的菌落按照先基本后完全的顺序点种在新鲜的平板上。
5讨论
本次实验以大肠杆菌E.coli K12为实验菌株通过紫外线诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定菌株的缺陷型类型。由于基因突变具有的不定向性、低频性的固有因素，以及操作和实验条件有限等因素，通过诱变育种得到想要的新菌种需要高通量，工作量大而且不易得到预期的菌种，因此实验未能得到预期的营养缺陷型菌株。
在青霉素处理时，其时间分为12h、16h和24h，因为在这个过程中处理时间也起到重要的作用。青霉素处理的时间过短就不能有效地杀死大部分我们不需要的细胞，而处理时间过长则所得到需要的缺陷型菌株获得率会大大下降。
倾注培养法进行生长谱的鉴定有其优点。由于氨基酸没有经过灭菌处理，而且在氨基酸点样过程中很容易发生受杂菌污染，这样就很有可能导致培养基的表面有杂菌菌落产生。比如这时候采用涂布法，那极有可能引发实验的干扰，产生假阳性。而用倾注法的菌落不容易扩散，能够将菌落限定在特定的区域，氨基酸等补充营养物质扩散时，要向培养基内部扩散，如果涂布平板则菌分布在表面，而倾注平板法菌主要分布在培养基内部，这样缺陷型菌接触补充营养物质的机会将更大，细菌可以利用外来的氨基酸，更容易生成肉眼可见的菌落。菌落生长圈就会出现在培养基内部，这样我们只观察透明培养基的内部的生长圈情况就可以了。
而对于倾注法存在的问题，第一，倾注平板容易造成平板不平，或者不均，影响菌的生长和观察。第二，倾注平板时容易将菌杀死，而对于这个情况的掌控，只能依靠人为的感觉。第三：它还是没能更高程度地避免染菌，因此也要求我们的无菌操作精度要高。
6参考文献
[1]王芃,袁盛凌,郑继平,李淑琴,段海清,张兆山. 一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法[J]. 微生物学通报. 2004(02)
[2]刘莉君,程茂基,杜波,方华平. 紫外线诱变选育高产富硒酵母的研究[J]. 当代畜牧. 2007(06)
[3]谢宝贵,朱虎,江玉姬,饶永斌,郑金贵. 银耳的诱变与营养缺陷型菌株的筛选[J]. 江西农业大学学报(自然科学). 2004(02)
[4]李宗伟,苏明杰,谈重芳,王雁萍,金庆生. 生长圈法应用于选育L-异亮氨酸菌株的条件优化[J]. 食品工业科技. 2012(18)
7 实验总结及个人体会
虽然说我们最后没有鉴定出突变菌株属于何种营养缺陷型，略感遗憾，但是整个过程的效果都不错，包括培养、诱变、富集、筛选、复证等等，都达到了预期的效果。本实验的每一个步骤都值得去深思，考虑它的前因后果。具体的实验过程非常的锻炼人，基本包含了大学微生物实验能用到的技术，对于提升实验技能大有帮助。本实验的自由度较高，指导老师只进行有限的讲解，给予我们极大的独立思考和完成实验的空间，注重过程，不苛求结果。有些操作丝毫不起眼，但作用却很大，无菌操作和生长谱测定中加混合氨基酸的量一定要少就需要引起重视。总而言之，这次微生物大实验让我获益良多，在实验技能和思维上都有了很大的提高，最后还要感谢老师的悉心指导和付出，帮助我们顺利地完成本学期的微生物大实验课程！
大肠杆菌菌株区别
JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7 噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcr AΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA 就能被上述酶切割。 E.coli JM110
大肠杆菌的培养
大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 固体培养基在液体培养基的基础上再加入％－％的琼脂1 试管斜面与平板的制备 （1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后， 补充水到所需的总体积。将称量好的％琼脂放入已溶的药 品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。 （3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH, 边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之 用1mol/L HCl进行调节。 （4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培 养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。
（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、配制日期。 （6）灭菌将上述培养基以,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近， 用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌 生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度 稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸 取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次 吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。 （12）次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃，170r/min 恒温振荡培养18h作种子培养液。
微生物的诱变育种
微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，
菌种筛选方法 (2)
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
常用大肠杆菌感受态JM109,DH5a,BL21等的区别
【引用】常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别 生命科学2011-03-31 14:48:42 阅读80 评论0 字号：大中小订阅 本文引用自xxrrzq《常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别》 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pL ysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pL ysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；
细菌营养缺陷型的诱变和筛选
微生物大实验 细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选 摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。 关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定 引言 营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。 影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。 夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。再经培养后出现的菌落，多数是只能在完全培养基上生长的营养缺陷型。 青霉素浓缩法：利用青霉素特异性的杀死野生型细胞，保留营养缺陷型细胞的方法。青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，所以只能杀死生长繁殖中的细菌，而不能杀死停止繁殖的细菌。在基本培养基中添加青霉素，野生型细菌能够生长繁殖，会被杀死，而营养缺陷型不被
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变与筛选 山大微生物大实验
山东大学 实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株 的诱变和筛选 作者：姚健(201000140136) 同组者：刘新强 指导老师：林建群(教授) 实验日期：2013年5月22日-6月1日
微生物大实验报告 大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选 山东大学生命基地班姚健 201000140136 摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。 Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria. 关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选 Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening 1引言 筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。 1.1 营养缺陷型 营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株[1]。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得到原养型。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。 1.2 紫外线诱变 诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。 紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。它是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原
常用大肠杆菌感受态JM109,DH5a,BL21等的区别-用途-特征
常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pU C系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gy rA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLy sS菌株 该菌株含有质粒pLy sS，因此具有氯霉素抗性。PLy sS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰 目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLy sS ，C amr 4：JM109菌株 该菌株在使用pU C系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的La cZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gy r A96，thi－1，hsdR17，supE44，re lA1，Δ（lac－proA B）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TO P10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcr AΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xy l-5，mtl-1，le uB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GA TC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC 序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如F baI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8：E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化. 各种感受态细胞的区别用途特征 Xl1-Blue菌株
大肠杆菌菌株,酵母菌菌株,农杆菌菌株特点及使用
北京华越洋生物提供QQ:1733351176 大肠杆菌菌株，酵母菌菌株，农杆菌菌株-北京现货 菌种名称编号类别抗性规格 RosettaBlue(DE3)pLac I 12-300 大肠杆 菌 1 mL RosettaBlue(DE3)pLys S 12-321 大肠杆 菌 1 mL SF21 12-318 昆虫细 胞 无 1 mL SF9 12-319 昆虫细 胞 1 mL SG1117 12-251 大肠杆 菌 1 mL SMD 11681 12-270 酵母 1 mL SMD1163 12-272 酵母 1 mL SMD1168 12-114 酵母 1 mL SMD1168H 12-208 酵母 1 mL SMD168H 12-271 酵母 1 mL Stbl2 12-252 大肠杆 菌 nalidixic acid 1 mL Stbl3 12-253 大肠杆 菌 Str 1 mL Stbl4 12-254 大肠杆 菌 Tet 1 mL SURE 12-255 大肠杆 菌 Kan;Tet 1 mL T1 12-327 大肠杆 菌 1 mL TB1 12-256 大肠杆 菌 无抗性 1 mL TG1 12-44 大肠杆 菌 无抗性 1 mL TH1 12-257 大肠杆 菌 无抗性 1 mL TKB1 12-310 大肠杆 菌 Tet 1 mL
北京华越洋生物提供QQ:1733351176 Top10 12-81 大肠杆 菌 Str 1 mL Top10F 12-188 大肠杆 菌 1 mL Top10F’ 12-381 大肠杆 菌 Str,Tet 1 mL Tuner 12-306 大肠杆 菌 无抗性 1 mL Tuner(DE3) 12-258 大肠杆 菌 无抗性 1 mL Tuner(DE3))plysS 12-219 大肠杆 菌 Cam 1 mL Tuner(DE3)pLacI 12-307 大肠杆 菌 Cam 1 mL Turbo 12-259 大肠杆 菌 无抗性 1 mL WB600 12-276 枯草宿 主菌 1 mL X33 12-273 农杆菌 1 mL XL blue 12-260 大肠杆 菌 无抗性 1 mL XL-10 gold 12-261 大肠杆 菌 Tet,Cam 1 mL XL1 Blue 12-308 大肠杆 菌 Tet,Nalidi xic Acid 1 mL XL2 Blue 12-309 大肠杆 菌 Tet,Cam, Nalidixic Acid 1 mL Y1089 12-262 大肠杆 菌 1 mL Y1090 12-263 大肠杆 菌 1 mL Y187 12-325 酵母 1 mL Y2HGold 12-326 酵母 菌种名称编号类别抗性规格 1A75 12-274 枯草宿 主菌 1 mL
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定 mutugenesis and isolation of auxotroph 细菌革兰氏染色法 gram stain 酵母菌的形态结构观察 yeast morphology 培养基的配制和灭菌 types of mddia and sterlization 菌种保藏 preservation of cultures 细胞计数法 conting of cell 凝集反应 agglutination reactions 相差显微镜 phase contrast microscope 细胞融合 cell fusion 质粒DNA的提取 isolation of plasmid DNA 植物DNA的提取 isolation of plant DNA 多肽的末端分析 analysis of terminal of polypeptide PCR扩增DNA PCR amplify DNA fragment SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 蛋白质的性质 properties of protein 植物组织培养 plant tissue culture BL-410生物机能实验系统简介 the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备 preparation methods for nerve-muscle specimen of frog 人ABO血型的鉴定 Identification of humankind ABO blood group
营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选 采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。 营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。 营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下： 第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。 抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。 菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。 第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种流程及紫外诱变育 种的详细步骤 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
诱变育种的一般步骤： 1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种：
出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253- 265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不
菌种筛选方法
常用的菌种的筛选方法如下： （1）施加选择性压力分离法 主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势。而得以快速分离纯化的目的。如可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。 （2）随机分离方法 有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离方法分离。 A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法。实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌。 B、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株。原理是利用DNA的损伤，微生物发生突变。B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下，当DNA损伤时，诱发λ阻遏物CI分解，PL启动子启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时，可活化yecA蛋白，进而分解噬菌体的阻遏蛋白，再引起sifA基因启动lacZ基因转录，测定表达的?-半乳糖苷酶活性，来检测药物的存在。 C、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例，介绍筛选方法。首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物（如亚胺环己酮）的分离培养基中生长，然后采用影印法，将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中，培养2-3天后，用紫外线杀司长好的菌落，再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液，培养16小时后，被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈。 （3）目的微生物分离 A、根据形态筛选突变株 B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养
大肠菌群和大肠杆菌的区别
大肠菌群和大肠杆菌的区别 名称定义检测方法检测意义 大肠菌群 是指具有某些特性的一组与粪便 污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌 氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革 兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群包含大肠杆菌、柠檬酸 杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌 等。 MPN计数法 参见GB4789.3-2010 《中 华人民共和国国家标准食 品微生物学检验大肠菌群 计数》。 食品标准中一般只规定大肠菌群的含量限制， 而对大肠杆菌没有限制。 大肠菌群分布较广，在动物粪便和自然界广泛 存在。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境 中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要 指标，作为食品中的粪便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污 染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通 过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数 的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体 健康危害性的大小。 大肠杆菌 （大肠埃希氏菌） 也称大肠埃希氏菌，分类于肠杆 菌科，归属于埃希氏菌属，属于细菌。 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、 乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基 质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+ + - -或- + - -的细菌。它分布在自然界， 平板计数法 参见GB4789.38-2012《食 品安全国家标准食品微生 物学检验大肠埃希氏菌计 数》。 2
大多数是不致病的，主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。 备注： 生产加工中两者没有单独的控制方法，需按照食品加工标准卫生操作规范，从控制人员、器具、环境的清洁卫生着手，做好清洁消毒工作，确保生产加工过程不受到大肠菌落的污染。 2
各种大肠杆菌菌株特点
各种大肠杆菌菌株特点 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’ 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株 DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr 4、大肠杆菌JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5、大肠杆菌TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr) endA1，nupG 6、大肠杆菌HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7.XL10-Gold菌株：所制备的感受态细胞是目前转化效率最高的感受态细胞，缺失几乎所有已知的限制酶切系统；同时缺失核酸内切酶(endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性，提高感受态转化效率及大质粒转化能力的宿主菌基因型。