d有丝分裂原激活的蛋白激酶的活性研究

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细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)说明书

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)水平。用纯化的小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，再与HRP标记的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：135U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)说明书活性

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）水平。用纯化的小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），再与HRP标记的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性浓度。 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后， 离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中 如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为18 U/L，12 U/L ，6 U/L，3 U/L，1.5 U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

DNA依赖性蛋白激酶在妇科肿瘤中的研究进展

?１０２８? ＤＮＡ依赖性蛋白激酶在妇科肿瘤中的研究进展 刘双胡Ａ（综述），卢玉波※，祝英杰（审校） （昆明医学院第三附属医院妇瘤科，昆明６５０１１８） 中围分类号：１１．７３７．３文献标识码：Ａ文章编号：１００６－２０８４（２０１０）０７－１０２８－０３ 摘要：ＤＮＡ依赖蛋白激酶（ＤＮＡ－ＰＫ）是哺乳动物细胞ＤＮＡ损伤修复的关键酶。研究表明， 妇科肿瘤，如宫颈癌、卵巢癌中普遍存在ＤＮＡ－ＰＫ表达的变化，提示该酶在妇科肿瘤的发生、发 展过程中发挥着重要的作用，并与肿瘤的临床分期、放射敏感性和预后有重要关系。近年来， 关于ＤＮＡ－ＰＫ的结构与功能、在肿瘤细胞株中的活性、在肿瘤组织中表达的研究日益深入，以 ＤＮＡ—ＰＫ为靶点的ＤＮＡ修复抑制剂作为肿瘤放化疗增敏药已陆续研发并进入临床前试验，有 望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。 关键词：ＤＮＡ依赖蛋白激酶；ＤＮＡ双链断裂；宫颈癌；卵巢癌 ＴｈｅＬａｔｅｓｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤｉｍ－ＰＫｉｎＧｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃＯｎｃｏｌｏｇｙＨＵＳｈｖａ．ｇ－ｙ．ｅ，ＬＵ沌一ｂｏ，朋Ｕ ｎ增ｌ】！ｅ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｇ＇ｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＴｈｉｒｄＨｏ印ｔｍｌＡｆｆｄｉａｔｅｄｔｏｌ６，ｎｍｉｎａＭｅｄｗａｌＣｏｌ— ｌｅｇｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０１１８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＤＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ＤＮＡ—ＰＫ）ｉｓａｋｅｙＤＮＡｄａｍａｇｅｒｅｐａｉｒｅｎｚｙｍｅｓｏｆ ＭａｍｍａｌｉａｎｅｅＵｓ．Ｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｈａｔｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｓｕｃｈａｓｃｅｒｖｉｃａｌａｎｄｏｖａｒｉ∞ｃａｎｃｅｒ． ｅｘｐｒｅｓｓｅｄＤＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ．Ｅｎｚｙｍｅｉｎｔｈｅｓｅｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｔｕｍｏｒｓｐｌａｙｅｄ∞ ｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ ｔｕｍｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｕｍｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｓｔａｇｅ，ｒａｄｉａ－ ｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎｔｍ，ｅｎｔｙｅａｒｓ，ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｕｍｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＮＡ．ＰＫｈａｓｂｅｅｎｒｅｓｅａｃｈｅｄｄｅｅｐ．ＷｉｔｈＤＮＡ．ＰＫ∞ｔｈｅｔａｒｇｅｔｏｆｔｈｅＤＮＡｒｅｐａｉｒｉｎｈｉｂｉ．１０ｔｓａｎｄｃａｎｃｅｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ—ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇｄｒｕｇｓｈａｖｅｂｅｅｎｇｒａｄｕａｌｌｙｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｅｎｔｅｒｅｄｔｈｅｐｒｅ－ｅｌｉｎ??ｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．Ｉｔｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｂｅａｎｅｗｔａｒｇｅｔｏｆｃａｎｃｅｒｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＤＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ；ＤＮＡｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ；Ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅ盹ｅｍｌｅｅｒ； Ｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒ 多种因素如电离辐射、ＤＮＡ代谢以及活性氧损 伤等都可以引起细胞ＤＮＡ双链断裂（ＤＮＡｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ，ＤＳＢ），这是基因突变、染色体断裂的主 要原因之一，ＤＮＡ依赖性蛋白激酶（ＤＮＡｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｋｉ—ｎａｓｅ，ＤＮＡ—ＰＫ）是ＤＮＡ损伤修复的关键 酶，决定着受损肿瘤细胞的转归。辐射损伤可被体 内的化学反应迅速修饰，而细胞内残存的ＤＮＡ损伤 则通过损伤监视系统纠正，此监视系统包括ＤＮＡ损 伤的识别、损伤信号传递、基因转录以及细胞反应。 研究发现ＤＮＡ－ＰＫ参与了ＤＮＡ损伤的直接识别，并 且对于ＤＳＢ修复、基因重组、基因转录以及基因调控 等具有重要作用。近年来其在肿瘤的发生、发展、诊 断和治疗等研究中引起人们越来越多的重视。现就 ＤＮＡ－ＰＫ的生物学作用及其在妇科肿瘤组织内的异 常表达、与放射敏感性的关系、肿瘤放射增敏作用等 有关方面的研究进展予以综述。 ｌＤＮＡ?ＰＫ的分子生物学特征 １．１ＤＮＡ－ＰＫ的结构ＤＮＡ－ＰＫ是由双链ＤＮＡ激 活的１个丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，ＤＮＡ．ＰＫ由一个 催化亚基（ＤＮＡ－ＰＫｃｓ）和２个调节亚基Ｋｕ７０／Ｋｕ８０ 异二聚体组成（Ｋｕ蛋白最初是作为一种自身抗原在 一名患有多发性肌炎－硬皮病重叠综合征自身免疫性 疾病的Ｅｌ本患者血清内被发现的，其命名是源于第１个患者姓名的前２个字母Ｋｕ）。哺乳动物细胞中，Ｋｕ蛋白由２条相对分子质量分别为７０和８６的多肽链组成异源二聚体，分别称为Ｋｕ７０和Ｋｕ８６（也称Ｋｕ８０），人Ｋｕ７０基因位于２２ｑ１３，编码６０９个氨基酸，Ｋｕ８０基因位于２ｑ３３～３４，编码７２３个氨基酸，ＤＮＡ－ＰＫｃｓ基因位于８ｑ１１，ＤＮ－ＰＫｃｓ蛋白由４１２７个氨基酸组成，相对分子质量约４７０１１Ｉ。 １．２ＤＮＡ－ＰＫ的功能ＤＳＢ是一种最严重的ＤＮＡ损伤，根据ＤＮＡ末端连接是否需要同源性， 将ＤＮＡ双链断裂修复可分为同源重组和非同源重 组（ＤＮＡｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ），在２条 修复途径当中，ＮＨＥＪ修复是人类最主要的修复途 径旧＇３Ｊ。ＤＮＡ－ＰＫ是ＮＨＥＪ修复系统中最重要的组成 部分，也是这一过程的关键酶，它参与细胞ＤＳＢ的修 复，并且可以通过磷酸化多种蛋白底物而广泛参与 转录和细胞凋亡过程，在维持细胞的遗传稳定性方 面具有重要意义。ＤＳＢ修复过程如下：ＤＳＢ发生后， 首先ＫｕＳ０和Ｋｕ７０识别并结合于每一条ＤＮＡ链末 端，Ｋｕ蛋白本身具有的解螺旋酶活性使２个断端局 部解链，其次Ｋｕ－ＤＮＡ复合物吸引ＤＮＡ．ＰＫｃｓ到损伤 部位与之结合并被激活，完成修复后ＤＮＡ－ＰＫ即发生 自身磷酸化ＤＮＡ—ＰＫ复合体从ＤＮＡ链上解离【３，４】。 ＤＮＡ双链发生断裂后，ＤＮＡ－ＰＫ缺陷的细胞可 能因染色体断裂不能修复而死亡，也可能发生不合 理的重组导致染色体异常，甚至不修复而导致遗传 信息丧失，这些细胞携带异常的遗传信息继续存活， 可能成为癌变发生的根本原因【５Ｊ。ＤＮＡ—ＰＫ功能的 丧失必然导致细胞损伤修复能力的降低，ＤＮＡ损伤 在细胞内累积造成基因组的不稳定性及突变率增 加。有研究证实，ＤＮＡ．ＰＫ具有防止肿瘤发生和发展 的作用，损伤修复功能缺陷者易患各种恶性肿瘤，几 乎所有癌症患者的损伤修复能力均低于正常人旧。。万方数据

细胞活性测定

细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。 用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。

激酶检测：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例

激酶检测：PKC蛋白激酶活性检测实验服务案例 实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330） 实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8） 基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC 活化度）。 操作步骤： 1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。 2．在4℃，用14000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。 3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到 2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。 5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag? PKC 5×BufferPepTag? C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。 标准PKC检测 PepTag? PKC Reaction 5X Buffer，5ul PepTag? C1 Peptide (0.4ug/ul)，5ul PKC Activator 5X Solution 超声处理的，5ul 短肽保护液（非必须），1ul 样品， 9ul 去离子水使终体积为，25ul PKC阳性对照检测 PepTag? PKC Reaction 5X Buffer，5ul PepTag? C1 Peptide (0.4ug/ul) ，5ul PKC Activator 5XSolution 超声处理的，5ul 短肽保护液（非必须），1ul

细胞周期蛋白依赖性激酶

细胞周期蛋白依赖性激酶 周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)在调控纺锤体聚合检查点中起重要作用,其功能是启动、促进和完成细胞周期事件 细胞周期蛋白Β1与CDK1形成复合物并磷酸化有丝分裂过程所必需的酶,引发有丝分裂的开始。细胞一旦进入有丝分裂期,促分裂后期复合物(an2aphase-promoting complex,APC)对细胞周期蛋白Β1进行酶解,阻止细胞周期蛋白Β1与CDK1形成复合物,灭活已形成的CDK1-细胞周期蛋白Β1复合物,促使有丝分裂结束诱导细胞进入分裂后期。纺锤体聚合检查点激活后使APC的活性受到抑制,致使细胞周期蛋白Β1不间断地表达,阻滞细胞在分裂中期。在紫杉醇处理的细胞中,因细胞周期蛋白Β1连续表达引起的CDK1-细胞周期蛋白Β1活性增强与紫杉醇诱导的有丝分裂阻滞和细胞凋亡同时存在,而且CDK1显性负突变导致对紫杉醇诱导凋亡的抗性[8]。Zhao JS, Kim JE, Reed E, et al·Molecular mechanism of antitumor activity of taxanes in lung cancer (Review)·International Journal of Oncology, 2005, 27:247~256·细胞分裂周期的调控由内在和外在的2类途径通过细胞周期关卡进行控制。通过关卡实现时相的过渡受到细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-depend-entkinases, CDKs)的激活、CDKs 的失活、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinase inhibitors, CKIs)的激活以及泛蛋白介导的蛋白水解等因素的影响。肿瘤细胞生长表现为细胞增殖失控、细胞周期和关卡调控失控。因此, CDK可作为抗肿瘤药物的靶点。 Bcl-2Bcl-2、Bax均为Βcl-2家族的成员,前者是从小鼠B细胞淋巴瘤中分离出来的一种由239个氨基酸组成的细胞凋亡抑制因子,可抑制射线、药物、癌基因等多种原因诱导的细胞凋亡;后者是细胞凋亡促进因子。Bcl-2蛋白通常与Bax蛋白形成异二聚体,阻止具有促凋亡活性的Bax蛋白同二聚体的形成,从而达到抑制细胞凋亡的作用 JNK/SAPK有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-acti2vated protein kinases,MAPKs)超家族亚科的JNK/SAPK(c-Jun N- terminal kinases/stress - activated protein ki2nase),是与细胞凋亡密切相关的细胞内信号转导酶,通过一系列磷酸化级联放大反应将细胞外各种刺激性信号传入细胞内,调节着细胞分裂周期及细胞凋亡。JNK活性提高不是微管蛋白抑制剂引起肿瘤细胞凋亡所必需的,但JNK的激活有利于细胞的凋亡[6]。Sudo T, Nitta M, Saya H, et al·Dependence of paclitaxel sensitivity on a functional spindle assembly checkpoint·Cancer Res, 2004, 64(7):2502~2508· caspase caspase家族涉及凋亡启动,是哺乳动物中的一类半胱氨酸蛋白酶家族。caspase 家族现有caspase-1~11个成员,某一个成员的激活将引起家族中其他成员一系列酶的级联反应[6]。紫杉醇通过激活caspase-3诱导U-2OS细胞死亡,进而引起细胞周期阻滞[13] p53p53是研究最为广泛的抑癌基因,被认为是基因组的守护者,有野生型和突变型。野生型p53的过表达往往能够激活一系列基因的表达从而产生两个结果:细胞分裂周期阻滞和细胞凋亡。p53是遗传毒性压力的紧急制动器,阻止基因组中过多突变的蓄积。Yang等发现微管相关蛋白as2trin的沉默可以诱导p53依赖的细胞凋亡,同时伴随着促凋亡bax蛋白表达的提高和caspase-3活性的增加[15][15]Yang YC, Hsu YT, Wu CC, et al·Silencing of astrin induces the p53-dependent apoptosis by suppression of HPV18 E6 expression and sensitizes cells to paclitaxel treatment in HeLa cells·Biochem Biophys Res Commun,2006, 343(2):428~434· 微管由α和β两种微管蛋白的异二聚体组成,其聚合和解聚的动力学特性,在细胞有丝分裂过程中发挥着重要作用。药物结合到微管或者微管蛋白的特定位点,干扰微管的聚合和解

细胞活性测定方法介绍和使用探讨

细胞活性测定方法介绍和使用探讨 细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍： 1、 MTT 法 MTT：化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 2、 XTT 法 XTT，化学名： 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲瓒产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲瓒产物的吸光度与活细胞的数量成正比。 优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。 缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

蛋白激酶与癌症

蛋白激酶 1、按底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类（5类） ①.丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶 ②.酪氨酸（Tyr）蛋白激酶： 1.EGFR（EGFR、HER2/ErbB2、ErbB3、ErbB4）：表皮生长因子受体 2.PDGFR（PDGFRα、PDGFRβ）：血小板衍生生长因子受体 CSF1R: 集落刺激因子1受体 c-Kit：干细胞生长因子受体 Flk2：胎肝激酶2 3.InsR：胰岛素受体 IGF-1R：类胰岛素生长因子受体 IRR：胰岛素相关受体 4.NGFR：神经生长因子受体 5.FGFR（FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4）：成纤维细胞生长因子受体 6.VEGFR（VEGFR1、VEGFR2/FLK-1、VEGFR3/FLT4）：血管内皮生长因子受体 7.HGFR：肝细胞生长因子受体 8.c-Met Ron sea 9.Ltk Alk 10.c-RET 11.Ros 12.Eph、Eck、Eek、Erk、Elk 13.Tie、Tie-2 Src家族 Tec家族（Btk、Itk/Tsk/Emt、Tec、Txk和Bmx等） ZAP70家族 、TYK1）等 Abl Wee等 ③.组氨酸蛋白激酶（组氨酸、精氨酸或赖氨酸的碱性残基被磷酸化，见于双组分信号系统） ④.色氨酸蛋白激酶 ⑤.天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶 2、按序列相似性及功能（7类） ①.AGC组：核苷酸依赖家族（PKA、PKG、PKC家族） ②.CaMK组：Ca2+/钙调素调节的蛋白激酶家族、snfl/AMPK家族 ③.CMGC组：CDK、MAPK、GSK3、CLK家族

④.CKI：酪氨酸激酶家族I ⑤.TK：酪氨酸蛋白激酶 ⑥.TKL：类似酪氨酸激酶 ⑦.STE 癌症 1、癌症主要有四种： 1、癌瘤：影响皮肤、粘膜、腺体及其他器官； 2、血癌：即血液方面的癌； 3、肉瘤：影响肌肉、结缔组织及骨头； 4、淋巴瘤：影响淋巴系统。 常见的癌症有血癌（白血病）、骨癌、淋巴癌（包括淋巴细胞瘤）、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌（包括子宫癌,宫颈癌）、肺癌（包括纵隔癌）、脑癌、神经癌、乳腺癌、食道癌、肾癌等。

热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验

实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330） 实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。 操作步骤： 1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。 2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。 3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。 4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。 5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag? PKC 5×Buffer,PepTag? C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。 标准PKC检测 PepTag? PKC Reaction 5X Buffer 5ul PepTag? C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul PKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul 短肽保护液（非必须） 1ul 样品 9ul 去离子水使终体积为 25ul PKC阳性对照检测 PepTag? PKC Reaction 5X Buffer 5ul PepTag? C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul PKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul 短肽保护液（非必须） 1ul Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul 去离子水使终体积为 25ul PKC阴性对照检测（不加PKC） PepTag? PKC Reaction 5X Buffer 5ul PepTag? C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul PKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul 短肽保护液（非必须） 1ul 去离子水使终体积为 25ul

细胞活性鉴定

1、细胞活性的鉴定：死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要，尤其是经过长时间运输和储存的样本。检测的方法通常有两种：（1）实时的流式检测：利用荧光染料PI、7-AAD或EMA 进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。尤其适用于高度坏死的样本。7-AAD最常用，因为在488nm激发下，其最大发射光在670nm左右，适合与FITC或PE进行多色标记。但随着时间延长，7-AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。因此，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好的区分固定前的死活状态。（2）手工检测：使用Trypanblue或其他细胞活性染料。（3）使用专门的仪器进行检测。如Vi-cell。 2、7-AAD （7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，在流式细胞术中用于鉴定死细胞，这种作用与PI相似。它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD 强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，PI检测时同时占据FL-2和FL-3通道，而7-AAD只占FL-3通道，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI 的最佳替代品，可与Annexin V-EGFP/FITC/PE联合使用。 3、Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料PE（Phycoerythrin）标记的AnnexinV作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。 其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。 另外，本试剂盒中提供的7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料，同PI 有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将AnnexinV-PE与7-AAD联合使用时，7-AAD则被排除在活细胞（AnnexinV-/7-AAD-）和早期凋亡细胞（AnnexinV+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被AnnexinV-PE 和7-AAD结合染色呈现双阳性（AnnexinV+/7-AAD+），可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。。 操作方法 样品染色 1）悬浮细胞：300g，4℃离心5 min收集细胞。 贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。2）用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5 min。 3）加入250μl 1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1×106细胞/ml。 4）取100 μl细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE和10 μl7-AAD，轻轻混匀。 5）避光、室温反应15 min。 6）加入400μl1×Binding Buffer，混匀，样品在1小时内检测。 4、CFSE (carboxyfluoresceindiacetate, succinimidyl ester 羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯) 被动扩散进入细胞，其本身是无色无荧光的，被细胞内的酯酶分解后产生高强度的绿色荧光，定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光染色最强，该荧光产物与胞内的氨基结合长时间留存于细胞内并可被乙醛固定。未结合的试剂与副产物扩散至胞外基质中，被洗去。 传代或胚胎分裂分析，CFSE与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白，细胞分裂时被平均分配至子代细胞，荧光强度降到母代细胞的一半。适合用于胞内示踪，在细胞分裂或融合后分配至子代细胞中，并不会被转移至邻近的细胞。在小鼠淋巴细胞迁移实验中，CFSE注射进入小鼠体内后，标记的淋巴细胞的检测可长达8周。肝内注射荧光显微镜定位检测可长达20天。

MTT检测细胞活性的操作方法

MTT检测细胞活性的操作方法 一、MTT是什么 MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 二、MTT法用来做什么 简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。 MTT主要有两个用途 1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定； 2．细胞增殖及细胞活性测定。 三、为何MTT可以用来做上述工作 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。 四、实验所需材料 1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。 市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g 1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。 1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。 注意事项： 1. 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感 MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. 2．MTT甲瓒溶解液 2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。 2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。 该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时