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柱层析使用方法

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柱层析(原理与装置)

利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类,依据其作用原理又可分为吸附柱层析(原理见第97~100页和第101~102页)、分配柱层析(原理见第91~92及94~95页)和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题,其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。

1.吸附柱层析的器材

(1)层析柱

图3-35 层析柱

实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式:一是下部带有活塞的玻璃管,如图3-35a所示,活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的,这样可以不涂真空油脂,以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞,则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细,套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的,普通橡皮管一般不可充作此用,因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀,而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的,所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速,如图3-35b所示。此外,薄膜塑料柱如图3-35c,因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点,应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的,两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧,另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长,下端拉细了的玻璃管内,使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气,薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。

层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定,其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定,一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长,分离效果好,但可分离的量小,且分离所需时间长;柱身短粗,分离效果较差,但一次可以分离较多的样品,且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离,宜选用细长的柱子,如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物,则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱,直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。

(2)吸附剂

柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30~50倍,对于难以分离的混合物,吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素,最后用实验方法选择和确定。

市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后,用蒸馏水洗到其浸出液的pH值为4,适用于分离酸性物质;碱性氧化铝浸出液的pH值为9~10,用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应pH值为7.5,适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分,可适用于各类有机物的分离。

柱层析所用氧化铝的粒度一般为100~150目,硅胶为60~100目,如果颗粒太小,淋洗剂在其中流动太慢,甚至流不出来。

氧化铝和硅胶的活性各分五个等级(见表2-5)。哪个活性级别分离效果最好,要用实验方法确定,而不是盲目选择高的活性级别,最常使用的是Ⅱ~Ⅲ级。如果吸附剂活性太低,分离效果不好,可通过“活化”来提高其活性。所谓“活化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分,提高其吸附活性的过程。通常是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。“活化”的温度和时间应根据分离需要而定。氧化铝一般在200℃恒温4h,硅胶在105~110℃恒温0.5~1h。“活化”完毕,切断电源,待温度降至接近室温时,从烘箱中取出放进干燥器中备用。有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好,可将吸附剂放在空气中让其吸收一些水分,分离效果反而好一些。

此外,一些天然产物带有多种官能团,对微弱的酸碱性都很敏感,则可用纤维素、淀粉或糖类作吸附剂。活性碳是一种吸附能力很高的吸附剂,但因粒度太小而不常用。

(3)淋洗剂

淋洗剂是将被分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂,所以也称为洗脱剂或简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重要。如果淋洗剂的极性远大于被分离物的极性,则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸附,从而将原来被吸附的待分离物“顶替”下来,随多余的淋洗剂冲下而起不到分离作用;如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性,则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中,不能随流动相向下移动,也不能达到分离的目的。如果淋洗剂对于被分离物各组分溶解度太大,被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离;如果溶解度太小,则会造成谱带分散,甚至完全不能分开。常用溶剂的极性大小次序也因所用吸附剂的种类不同而不

尽相同,第99~100页给出了在硅胶和氧化铝柱中常用溶剂所表现出的极性次序,可作为选择溶剂的参考,首先在薄层层析板上试选(见图3-40),初步确定后再上柱分离。如果所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解性能也较大的溶剂,反之则改用极性和溶解性都较小的溶剂,直至获得满意的分离效果。

除了分离效果外还应当考虑:①在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长期共存不发生任何化学反应,也不被吸附剂或被分离物催化而发生自身的化学反应;②沸点较低以利回收;③毒性较小,操作安全;④适当考虑价格是否合算,来源是否方便;⑤回收溶剂一般不应作为最终纯化产物的淋洗剂。

淋洗剂的用量往往较大,故最好使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合

适的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂一般由两种可以无限混溶的溶剂组成,先以不同的配比在薄层板上试验,选出最佳配比,再按该比例配制好,像单一溶剂一样使用。如果必须在层析过程中改变淋洗剂的极性,不能把一种溶剂迅速换成另一种溶剂,而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐渐加到正在使用的溶剂中去,逐步提高其比例,直至所需要的配比。一条经验规律称为“幂指数增加”,例如,原淋洗剂为环己烷,如欲加入二氯甲烷以增加其极性,则不应立即换为二氯甲烷,而应使用这两种溶剂的混合液,其中二氯甲烷的比例依次为5%,15%,45%,最后再换为纯净的二氯甲烷。每次加大比例后,须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是一般方法,其目的在于避免后面的色带行进过快,追上前面的色带,造成交叉带。但如果两色带间有很宽阔的空白带,不会造成交叉,则亦可直接换成后一种溶剂,所以应根据具体情况灵活运用。

(4)被分离的混合物

在实际工作中,被分离的样品是不能选择的,但认真考察各个组分的分子结构,估计其吸附能力,对于正确选择吸附剂和淋洗剂都是有益的。若化合物的极性较大,或含有极性较大的基团,则易被吸附而较难被洗脱,宜选用吸附力较弱的吸附剂和极性较大的淋洗剂。反之,对于极性较小的样品则选用极性较强的吸附剂和弱极性或非极性淋洗剂。若各组分极性差别较大,则易于分离,可选用较为短粗的柱子,使用较少的吸附剂;若各组分极性相差甚微,则难于分离,宜选用细长的柱子并使用较大量的吸附剂。

(5)其他物品

储存淋洗剂的分液漏斗一只,接收洗出液的锥形瓶若干只,其容积大小根据淋洗剂的体积确定。玻璃毛少量,白沙少量,各自洗净烘干。若层析柱很小,也可用少量脱脂棉代替玻璃毛。

2.吸附柱层析的操作

(1)装柱

装柱的方法分湿法和干法两种。

湿法装柱时,将柱竖直固定在铁支架上,关闭活塞,加入选定的淋洗剂至柱容积的1/4 ,用一支干净的玻璃棒将少量玻璃毛(或脱脂棉)轻轻推入柱底狭

窄部位,小心挤出其中的气泡,但不要压得太紧密,否则淋洗剂将流出太慢或根本流不出来。将准备好的白沙加入柱中,使在玻璃毛上均匀沉积成约5mm厚的一层。将需要量的吸附剂置烧杯中,加淋洗剂浸润,溶胀并调成糊状。打开柱下活塞调节流出速度为每秒钟1滴,将调好的吸附剂在搅拌下自柱顶缓缓注入柱中,同时用套有橡皮管的玻璃棒轻轻敲击柱身,使吸附剂在淋洗剂中均匀沉降,形成均匀紧密的吸附剂柱。吸附剂最好一次加完。若分数次加,则会沉积为数层,各层交接处的吸附剂颗粒甚细,在分离时易被误认为是一个色层。全部吸附剂加完后,在吸附剂沉积面上盖一层白沙(如柱很小,也可不用白沙而盖上一张直径与柱内径相当的滤纸片),关闭活塞。在全部装柱过程及装完柱后,都需始终保持吸附剂上面有一段液柱,否则将会有空气进入吸附剂,在其中形成气泡而影响分离效果。如果发现柱中已经形成了气泡,应设法排除,若不能排除,则应倒出重装。装好的吸附柱各层材料的分布见图3-36。

干法装柱时,先将柱竖直固定在铁支架上,关闭活塞。加入溶剂至柱容积的3/4,打开活塞控制溶剂流速为1滴/秒,然后将所需量的吸附剂通过一支短颈玻璃漏斗慢慢加入柱中,同时,轻轻敲柱身使柱填充紧密。干法装柱的缺点是容易使柱中混有气泡。特别是使用硅胶为吸附剂时,最好不用干法装柱,因为硅胶在溶剂中有一溶胀过程,若采用干法装柱,硅胶会在柱中溶胀,往往留下缝隙和气泡,影响分离效果,甚至需要重新装柱。

装填薄膜塑料柱时,可先按图3-35c所示的那样用抽气法将薄膜展开成圆柱形,在底部装入一段玻璃毛,吸附剂通过一个粗颈漏斗自柱顶装入。装至1/3处,将柱身在坚硬的表面上礅结实,再装入1/3,再礅结实,直至装到需要的高度。装成的薄膜柱应紧密结实,可以像玻璃柱那样用夹子夹住,再在其底部扎一些小孔即可使用。(2)加样

加样亦有干法、湿法两种。湿法加样是将待分离物溶于尽可能少的溶剂中,如有不溶性杂质应当滤去。打开柱下活塞小心放出柱中液体至液面下降到滤纸片处,关闭活塞,将配好的溶液沿着柱内壁缓缓加入,切记勿冲动吸附剂,否则将造成吸附剂表面不平而影响分离效果。溶液加完后,小心开启柱下活塞,放出液体至溶液液面降至滤纸片时,关闭活塞,用少许溶剂冲洗柱内壁(同样不可冲动吸附剂),再放出液体至液面降到滤纸处,再次冲洗柱内壁,直至柱壁和柱顶溶剂没有颜色。加样操作的关键是要避免样品溶液被冲稀。在技术熟练的情况下,也可以不关下部活塞,在每秒钟1滴的恒定流速下连贯地完成上述操作。

干法加样是将待分离样品加少量低沸点溶剂溶解,再加入约5倍量吸附剂,拌和均匀后在通风橱中蒸发至干。揭去柱顶滤纸片,将吸附了样品的吸附剂平摊在柱内吸附剂的顶端,在上面加盖滤纸片或加盖一层白沙。干法加样易于掌握,不会造成样品溶液的冲稀,但不适合对热敏感的化合物。

(3)淋洗和接收

图3-36 淋洗

样品加入后即可用大量淋洗剂淋洗。随着流动相向下移动,混合物逐渐分成若干个不同的色带,继续淋洗,各色带间距离拉开,最终被一个个淋洗下来。当第一色带开始流出时,更换接收瓶,接收完毕再更换接受瓶,接受两色带间的空白带,并依此法分别接收各个色带。若后面的色带下行太慢,可依次使用几种极性逐渐增大的淋洗剂来淋洗。为了减少添加淋洗剂的次数,可用分液漏斗在柱顶“自动”添加,如图3-36所示。分液漏斗的活塞打开,顶塞密封,尾部插进柱上部的淋洗剂液面以下,当液面下降后,漏斗尾部露出,即有空气泡自尾部进入分液漏斗,这就加大了漏斗内液面上的压力,漏斗内的淋洗剂就自动流入柱内,使柱内液面上升,当液面淹没漏斗尾部时,就不再有空气进入漏斗,漏斗内的淋洗剂就不再流出。在使用薄膜塑料柱进行层析时,一旦色带形成并拉开距离,可将柱吸干,用刀沿“空白带”处切开,将各色带分别萃取,各自蒸去溶剂,即得到相应组分的化合物。

(4)显色

分离无色物质时需要显色。如果使用带萤光的吸附剂,可在黑暗的环境中用紫外光照射以显出各色带的位置,以便按色带分别接收。但柱上显色远不如在薄层板上显色方便。所以常用的办法是等分接收,即事先准备十几个甚至几十个接收瓶,依次编出号码,各接收相同体积的流出液,并各自在薄层板上点样展开,然后在薄层板上显色(相关的显色操作见薄层层析部分)。具有相同R

f值的为同一组分,可以合并处理。也可能出现交叉带,若交叉带很少,可以弃之,若交叉带较多,或样品很贵重,可以将交叉部分再次作柱层析分离,直至完全分开。例如,某一样品经等分接收和薄层层析并显色处理后如图3-37所

示。由图可知,1,7,8号接收液都是空白,没有任何组分,可以合并。2~6号为第一组分,可以合并处理,9~13号为第二组分,14~16号为第三组分,17~20号为第四组分。其中第14号实际是一个交叉带,以第三组分为主,也含有少量第二组分。如果对第三组分的纯度要求不高,可以并入第三组分;如果对第三组分的纯度要求甚高,可将第14号接收液浓缩后再做一次柱层析分离。

3.柱层析操作中应注意的问题

(1)要控制淋洗剂流出的速度。一般控制流速为1滴/秒。若流速太快,样品在柱中的吸附和溶解过程来不及达到平衡,影响分离效果。若流速太慢,分离时间会拖得太长。有时,样品在柱中停留时间过长,可能促成某些成分发生变化。或流动相在柱中下行速度小于样品的扩散速度,会造成色带加宽、交合甚至根本不能分离。

(2)以下现象会严重影响分离效果,必须尽力避免。

a.色带过宽,界限不清。造成的原因可能是柱的直径与高度比选择不当,或吸附剂、淋洗剂选择不当,或样品在柱中停留时间过长。但更常见的却是在加样时造成的。若在样品溶液加进柱中后,没有打开下部活塞放出淋洗剂使样品溶液降至滤纸片处,即急于加溶剂冲洗柱壁,造成样品溶液大幅度稀释,或过早加大量溶剂淋洗,必然会造成色带过宽。所以溶样时一定要使用尽可能少的溶剂,加样时一定要避免样品溶液的稀释。

b.色带倾斜。正常情况下柱中的色带应是水平的,如图3-38a 所示。而倾斜的色带如图3-38b所示,在前一个色带尚未完全流出时,后面色带的前沿已开始流出,所以不能接收到纯粹的单一组分。造成色带倾斜的原因是吸附剂的顶面装得倾斜,或柱身安装得不垂直。

c.气泡。造成气泡的原因可能是玻璃毛或脱脂棉中的空气未挤净,其后升入吸附剂中形成气泡,也可能是吸附剂未充分浸润溶胀,在柱中与淋洗剂作用发热而形成,但更大量的是在装柱或淋洗过程中淋洗剂放出过快,液面下降到

吸附剂沉积面之下,使空气进入吸附剂内部滞留而成。当柱内有气泡时,大量淋洗剂顺气泡外壁流下,在气泡下方形成沟流,使后一色带前沿的一部分突出伸入前一色带(见图3-38c),从而使两色带难于分离。所以在装柱及淋洗过程中应始终保持吸附剂上面有一段液柱。

图3-38 层析柱中的色带(虚线表示更换接收瓶处)

d.柱顶面填装不平。这时色带前沿将沿低凹处向下延伸进入前面的色带(见图3-38d),这也是一种沟流。

e.断层和裂缝。当柱内某一区域内积有较多气泡时,这些气泡会合并起来在柱内形成断层或裂缝。图3-38e表示了裂缝造成的沟流,而断层相当于一个不平整的装载面,它造成沟流的情况与图38d相似。

层析柱使用说明书

目录 一产品介绍 (2) 二产品特点 (2) 三技术参数 (2) 四操作说明 (2) 五操作注意事项 (4) 六售后服务承诺 (5) 七合格证 (5) 八随机附件 (6)

一产品介绍: 层析过程是采用特殊的吸附剂,从植物提取液中选择性地吸附其中的有效部分,去除无效成分的一种分离纯化新工艺。可以解决植提生产中所面临的剂量大、产品吸潮和重金属残留等实际问题。经层析技术处理后所得到的精制物,可使有效成分高度富集,杂质少,提取得率仅为原生物的2~5%,而一般水煮法为30%左右,醇沉法为15%左右;可有效地去除吸潮成分,并增强产品的稳定性;可有效地去除重金属。层析分离工艺所得提取物体积小,不吸潮,容易制成外型美观的各种剂型,尤其适用于颗粒剂、胶囊剂、片剂等的生产。该技术将是对中药提取工艺影响最大、带动面最广的技术进步之一。用于生物工程、制药工业、精细化工领域的分离纯化设计制造的工业制备,具有分辨高、选择性好、流动连续、效率高、处理稳定、样品可多可少、易于操作的特点,适用于含量少的复杂高分子物质的分离纯化,是中草药、化学合成药及生物活性物质有效成分分离提纯的核心设备。 二产品特点: ①合理的高径比,精密的进出口流体分布装置,保证层析柱装填效果和填 料再生效果,为高效分离提供了保障。 ②产品采用不锈钢材料,并进行内外抛光,耐腐蚀、使用寿命长、硬度高、 运输安全,质量有保障。 ③本设备确保无污染、效率高、操作方便等。 三技术参数

四操作说明 层析操作流程一般为:预处理,逆流洗柱,水洗,吸附,解吸、再生等工艺。 1、预处理:在吸附树脂的生产过程中,一般均采用工业级原料,产品没有经过进一步纯化处理,因此树脂内部往往残留少量单体,致孔剂和其他有机杂质,所以在使用之前必须进行预处理。 吸附树脂预处理方法如下: (1)将准备装柱使用的新树脂,用2倍左右体积的甲醇或其他水溶性溶剂(如乙醇、丙酮)浸泡2小时,并不时搅动,使树脂充分溶胀。 (2)、将已充分溶胀的吸附树脂装柱,以每小时3至4倍床体积的流速,将5至8倍的甲醇或其他水溶性的溶剂(如乙醇、丙酮)通过树脂层,至流出液加水稀释不变混。 (3)、甲醇处理后,以每小时6至8倍床体积的流速将去离子水通过树脂层,置换出甲醇即可投入使用。 2、逆流洗柱:逆流洗柱是用水洗除去水离子及破碎填料,树脂装入交换柱后,用蒸留水反洗树脂层,展开率为50-70%,直至出水清晰、无气味、无细碎树脂为止,再用50%-100%乙醇10-15倍体积慢速淋洗。2、用约2倍体积的4-5%HCl溶液,以2m/h流速通过树脂层。全部通入后,浸泡4-8小时,排去酸液,用洁净水冲洗至出水呈中性。冲洗流速为10-20m/h。 3、用约2倍树脂体积的2-5%NaOH溶液,按上面进HCl的方法通入和浸泡。排去碱液,用洁净水冲洗至出水呈中性。流速同上。酸碱溶液若能重复进行2-3次,则效果更佳。经预处理后的树脂,在第一次投入运行时应适当增加再生剂用量,以保证树脂获得充分的再生。 3、水洗:水洗目的主要是除去层析柱上所附着的渣滓。 4、吸附:吸附操作自上而下(或自下而上)通液,可采用不同流速,以选取最佳条件,一般流速sV 2—8。流出液每间隔一段时间取样检测,达泄漏点

柱层析分离的实验方法和技巧

柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。 一:柱子可以分为:加压,常压,减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二:关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm ×20cm的柱子);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等。

层析柱使用方法

层析柱使用方法 层析柱使用方法柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否,对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是:在柱层析时,由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀(没有填严实),使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花,导致分离效果不好。更常见的例子是:层析柱虽然装得不错,但是由于淋洗剂选择不恰当,结果导致几十毫克产品,用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西,熟手可能只需要半个小时,而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见,这两项技术掌握与否,对于提高工作效率,减轻工作量,减少有机溶剂的使用,从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是:TLC的作用除了跟踪反应进程,检测试剂和原料纯度外,一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析: 1:装柱子(添硅胶)时,有两种方法:即湿法装柱和干法装柱,二者各有优劣。不论干法还是湿法,硅胶(固定相)的上表面一定要平整,并且硅胶(固定相)的高度一般为15cm左右,太短了可能分离效果不好,太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱:是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后,再填入柱子中,然后再加压用淋洗剂“走柱子”,本法最大的优点是一般柱子装的比较结实,没有气泡。 干法装柱:则是直接往柱子里填入硅胶,然后再轻轻敲打柱子两侧,至硅胶界面不再下降为止,然后再填入硅胶至合适高度,最后再用油泵直接抽,这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”,一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压,下面再用油泵抽,这样可以加快速度。干法装柱较方便,但最大的缺陷在于“走柱子”时,由于溶剂和硅胶之间的吸附放热(可以用手摸柱子明显感觉到),容易产生气泡,这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚,二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉,但是,一旦撤去压力,如在上样、加溶剂等操作的时候,气泡就会释放出来,严重时,整个柱子变花,样品不可能平整地通过,当然也就谈不上分离了。解决的办法是:第一、硅胶一定要天结实;第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”,一定要到柱子的下端不再发烫,恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂,防止添加溶剂的时候,使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样,添加溶剂,则没有这个必要。 2:上样也有干法和湿法之分:干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后,在加入少量硅胶,拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦,但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂(最好就是展开剂,如果展开剂的溶解度不好,则可以用一极性较大的溶剂,但必须少量)将样品溶解后,再用胶头滴管转移得到的溶液,沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后,再加入。湿法较方便,熟手一般采用此法。上样完毕后,接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同,即使两者使用的硅胶都相同,但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时,也显得极性偏大,所以要稀释一倍,但又不能稀释太多,否则成了靠扩散作用来分离,效果也不会好。 谈TLC,需要切记的是: 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时,多尝试几种比例不同,成分不同的展开剂。展开剂的极性太小,点分不开,极性太大,也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关,只有两者比较合适了,才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为:石油迷

硅胶柱层析的操作方法

硅胶柱层析 一、硅胶柱层析的原理 利用吸附原理,即利用硅胶对中药混合物中各种成分吸附能力的差异,而使混合物中各成分得以分离的色谱方法。 二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 1、装柱 操作要点:装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防吸附剂外漏。有干法装柱和湿法装柱两种方法 (1)干法装柱:将硅胶通过漏斗装入柱内,中间不应间断,形成一细流慢慢加入管内。也可用橡皮槌轻轻敲打柱硅胶柱使硅胶装填连续均匀、紧密。柱装好后,打开下端活塞,然后倒入洗脱剂洗脱以排尽柱内空气,并保持一定液面。(2)湿法装柱:将最初准备使用的洗脱剂装入柱内,打开下端活塞,使洗脱剂缓慢流出。然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内(或将硅胶与适量洗脱剂调成混悬液慢慢加入柱内,),硅胶依靠重力和洗脱剂的带动,在柱内自由沉降,此间要不断把流出的洗脱剂加回柱内保持一定的液面,直至把硅胶加完并在柱内沉降不再变动为止。然后在硅胶上面加一小片滤纸或少许脱脂棉。根据加样量控制洗脱剂液面至一定高度。 匀浆法:搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%的醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过

柱。 2、上样 将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中,制成体积小、浓度高的样品溶液,加入层析柱中硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂,则将样品溶于易挥发的溶剂中,并加入适量硅胶(不超过柱中硅胶全量的1/10)与其拌匀,除尽溶剂,将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶(始终保持洗脱剂有一定的液面),再覆盖一层硅胶即可。上样时注意沿着柱内壁慢慢加入,始终保持硅胶上端表面平整;上样量为硅胶的1/60~1/30。 3、洗脱 洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选,一般TLC展开时Rf 值为0.2~0.3的溶剂系统是最佳的洗脱系统,采用梯度洗脱法洗脱。先打开柱下端活塞,保持洗脱剂流速1~2滴/秒。上端不断添加洗脱剂(可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相近)。如单一溶剂洗脱效果不好,可用混合溶剂洗(一般不超过三种溶剂),通常采用梯度洗脱。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。 4、收集处理 等份收集洗脱液,每份收集量大概与所用硅胶的量相当。每份洗脱液采用薄层定性检查,合并含相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单体成分。如仍为几个单体成分的混合物,不易析出单体成分的结晶。则需要进一步层析或用其他方法分离。 注:(1)柱色谱分离能力比薄层分离能力强,效果更好,尤其对结构相似、性质接近、采用薄层难以分离的成分分离效果好。 (2) 洗柱子能不用含水的混合溶剂,就尽量不要用。

柱层析方法经验归纳汇总

1、选柱子:有玻璃柱和不锈钢柱两种,实验室常用玻璃柱。径高比一般在1:5-10。 根据吸附剂用量(体积)确定柱子大小,一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4~1/5。 柱子可以分为:加压,常压,减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。 其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。 加压柱是种比较好的方法,与常压柱类似,只是外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或小气泵。特别在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 柱子的尺寸为粗长的最好。柱子越长,相应的塔板数就越高。柱子越,上样后样品的原点就越小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。 无水无氧柱适用于对氧、水敏感,易分解的产品。可以湿柱,也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱

和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的物质,小心不为过。因为分离的物质比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝有碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但比硅胶要贵些。听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过。 2、选择吸附剂:200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;如果极难分,也可以用100倍量的硅胶。干硅胶的视密度在左右,所以要称40 g硅胶,用烧杯量100 ml也可以。 书中写硅胶量是样品量的30-40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在,杂质相差以上),就可以少用硅胶。 用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。 常用吸附剂的种类:氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙(镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。

柱层析知识总结

柱层析知识总结 柱层析 利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类,依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题,其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。 1.吸附柱层析的器材 (1)层析柱 实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式:一是下部带有活塞的玻璃管,活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的,这样可以不涂真空油脂,以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞,则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细,套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的,普通橡皮管一般不可充作此用,因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀,而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的,所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速,此外,薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点,应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的,两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧,另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长,下端拉细了的玻璃管内,使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气,薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。 层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定,其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定,一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长,分离效果好,但可分离的量小,且分离所需时间长;柱身短粗,分离效果较差,但一次可以分离较多的样品,且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离,宜选用细长的柱子,如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物,则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱,直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。 (2)吸附剂 柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30~50倍,对于难以分离的混合物,吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素,最后用实验方法选择和确定。 市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后,用蒸馏水洗到其浸出液的pH值为4,适用于分离酸性物质;碱性氧化铝浸出液的pH值为9~10,用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应pH值为7.5,适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分,可适用于各类有机物的分离。 柱层析所用氧化铝的粒度一般为100~150目,硅胶为60~100目,如果颗粒太小,淋洗剂在其中流动太慢,甚至流不出来。 氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好,要用实验方法确定,而不是盲目选择高的活性级别,最常使用的是Ⅱ~Ⅲ级。如果吸附剂活性太低,分离效果不好,可通过“活化”来提高其活性。所谓“活化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分,提高其吸附活性的过程。通常是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。“活化”的温度和时间应根据分离需要而定。氧化铝一般在200℃恒温4h,硅胶在105~110℃恒温0.5~1h。“活化”完毕,切断电源,待温度降至接近室温时,从烘箱中取出放进干燥器中备用。有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好,可将吸附剂放在空气中让其吸收一些水分,分离效果反而好一些。 此外,一些天然产物带有多种官能团,对微弱的酸碱性都很敏感,则可用纤维素、淀粉或糖类作吸附剂。活性碳是

柱层析的操作步骤和注意事项

柱层析技术 常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相 的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望 能有所帮助。 柱子可以分为:加压,常压,减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所 以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分 离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝聚),以及有些比较易分解的东西可能得 不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过 减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念 头了。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力 的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。非凡是在轻易分解 的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得 加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。 柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是 样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想假如柱子十厘米,而样品就有二 厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而假如样品层只 有0.5厘米,那么各组分就比较轻易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多 的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说, 不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选

层析柱知识

柱层析 利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类,依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题,其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。 1.吸附柱层析的器材 (1)层析柱 实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式:一是下部带有活塞的玻璃管,活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的,这样可以不涂真空油脂,以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞,则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细,套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的,普通橡皮管一般不可充作此用,因为橡皮易被氯仿、苯、THF 等溶剂溶胀,而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的,所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速,此外,薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点,应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的,两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧,另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长,下端拉细了的玻璃管内,使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气,薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。 层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定,其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定,一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长,分离效果好,但可分离的量小,且分离所需时间长;柱身短粗,分离效果较差,但一次可以分离较多的样品,且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离,宜选用细长的柱子,如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物,则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱,直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。 (2)吸附剂 柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30~50倍,对于难以分离的混合物,吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素,最后用实验方法选择和确定。 市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后,用蒸馏水洗到其浸出液的pH值为4,适用于分离酸性物质;碱性氧化铝浸出液的pH值为9~10,用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应pH值为7.5,适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分,可适用于各类有机物的分离。 柱层析所用氧化铝的粒度一般为100~150目,硅胶为60~100目,如果颗粒太小,淋洗剂在其中流动太慢,甚至流不出来。 氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好,要用实验方法确定,而不是盲目选择高的活性级别,最常使用的是Ⅱ~Ⅲ级。如果吸附剂活性太低,分离效果不好,

详细柱层析技巧

详细柱层析技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。 柱子可以分为:加压,常压,减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。 柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质相差0.1

快速柱层析技巧

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柱层析的实验方法和技巧

柱层析分离技术及其实验技巧 一、胶柱层析(正、反相柱层析)——根据物质的极性不同进行分离 根据固定相和流动相之间的极性不同,硅胶柱层析可以分为:正相柱层析、反相柱层析。 通常把固定相极性大于流动相极性的柱色谱方法称为正相柱层析,常用的流动相为有机溶剂,如石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等。较适宜分离化合物为低级性、中等极性化合物。 而把固定相极性小于流动相极性的柱色谱方法称为反相柱层析,常用的流动相为甲醇、水等极性溶剂。较适宜分离极性较高的化合物。 二、凝胶层析——根据物质的分子大小进行分离 凝胶层析又称为凝胶过滤、分子筛层析等,是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相,根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。常用的凝胶是葡聚糖凝胶(Sephadex),如Sephadex LH-20。 三、柱层析实验操作 3. 1层析柱的选择 这与样品的处理量、分离难度、所用的基质和分离目的有关。以基质是硅胶为例,当样品量较多,分离难度较大(相邻组分的△R较小,相差不到0.1)时,需选用较粗大的柱子以填充较多的硅胶。柱子长,相应的塔板数就高;柱子粗,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对地减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有两厘米,那么分离的难度可想而知,而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在0.2~0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子。

3. 2流动相的选择 在柱层析分离中流动相(淋洗剂)的选择尤为关键,直接影响到柱层析的分离效果,如果选择不当常常导致几十毫克样品,用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离,甚至不能分离。 以硅胶柱为例,具体选择哪种流动相以及流动相的极性,多是通过薄层色谱(TLC)来确定。一般来说流动相采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。 由于层析柱和薄层板不同,即使两者使用的硅胶都相同,但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时,也显得极性偏大,所以要稀释一倍,但又不能稀释太多,否则成了靠扩散作用来分离,效果也不会好。在用TLC选择流动相时一般先根据文献中报道的该中植物分离用什么样的流动相,就首先尝试使用该类展开剂,然后不断尝试比例,直到找到一个分离效果好的展开剂。很多时候,展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到最佳效果,一般把两种溶剂混合时,采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂,如果有分开的迹象,再调整比例,达到最佳效果,如果没有分开的迹象,最好是换溶剂。 此外在采用TLC选择洗脱剂时还应注意: 第一,某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时,多尝试几种比例不同,成分不同的展开剂。展开剂的极性太小,点分不开;极性太大,也分不开。 第二,点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点了。但也不能太淡,否则含量较少的成分可能斑点模糊或不显出斑点。点样时还应避免损伤薄层。 第三,薄层板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关,只有两者比较合适了,才能有一个较好的分离效果。 在选择流动相时还应考虑到经济效益和环保。所以大多选用石油醚,乙酸乙酯。氯仿也是一种常用溶剂,但是要注意其毒性较大,所以要保持实验室通风良好。二氯甲烷也有用,但是它和硅胶的吸附是一个放热过程,所以夏天的时候经

柱层析实验操作规程及流程

一.实验目的 1.了解柱层析的基本原理。 2.掌握柱层析的操作技术。 二.实验原理 层析法是一种物理分离方法。柱层析法是层析方法中的一个类型, 分为吸附柱层析法和分配柱层析法。本实验仅介绍吸附柱层析法。 吸附柱层析法是分离、纯化和鉴定有机物的重要方法。它是根据 混合物中各组分的分子结构和性质(极性)来选择合适的吸附剂和洗 脱剂,从而利用吸附剂对各组分吸附能力 的不同及各组分在洗脱剂中的溶解性能 不同达到分离目的。吸附柱层析法通常是 在玻璃层析柱中装入表面积很大、经过活 化的多孔性或粉状固体吸附剂(常用的吸 附剂有氧化铝、硅胶等)。当混合物溶液 流过吸附柱时,各组分同时被吸附在柱的 上端,然后从柱顶不断加入溶剂(洗脱剂) 洗脱。由于不同化合物吸附能力不同,从 而随着溶剂下移的速度不同,于是混合物 中各组分按吸附剂对它们所吸附的强弱 顺序在柱中自上而下形成了若干色带,如图1所示。 在洗脱过程中,柱中连续不断地发生吸附和溶解的交替现象。被吸附的组分被溶解吸出来,随着溶剂向下移动,又遇到新的吸附剂颗粒,把组分从溶液中吸附出来,而继续流下的新溶剂又使组分溶解而向下移动,这样经过适当时间移动后,各种组分就可以完全分开,继续用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出,再继续加溶剂直至各组分依次全部由柱中洗出为止,分别收集各组分。 三.材料 1.仪器 层析柱,烧杯,铁架台,长玻棒,小量筒,脱脂棉。 2.药品 硅胶 ,丙酮 ,石油醚。 3. 材料:菠菜叶。 四.方法 1.装柱 取一支洁净干燥的层析柱玻管,自柱口塞入少许脱脂棉并用长玻棒推至柱底压平(塞时不宜太紧)。然后用漏斗从柱口小心装入约5g 硅胶(100~160目)(四分之三高度,干法装柱),边装边用手指敲打层析柱,使填装紧密均匀。再在柱顶加入一薄层脱脂棉花(约0.5cm 厚)。将此层析柱固定在铁架台上。 2.加样 称取研磨研细的菠菜叶2.0~3.0g 于25mL 烧杯中,量取10mL 石油醚:丙酮=1:1(体积比)的混合液溶解浸泡,用封口薄膜封住杯口,浸泡10min,倒出浸出液静置分层,用刻度胶头滴管吸取1.0mL 上样分析,注意上样应沿管壁。(注意:胶头刻度滴管应是干燥的) 3.洗脱、分离 慢慢加入石油醚:丙酮=95:5(体积比)的洗脱液约 10mL

柱层析技巧

详细柱层析技巧一 常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。 柱子的分类 柱子可以分为:加压,常压,减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 ' 现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分R f在~,杂质相差以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×20cm的柱子);如果相差不到,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等。 无水无氧柱 它适用于对氧,水敏感,易分解的产品。 可以湿柱,也可以干柱。不过在上样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是

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