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硅胶柱层析分离的实验原理法与技巧

硅胶柱层析分离的实验原理法与技巧
硅胶柱层析分离的实验原理法与技巧

硅胶柱层析分离的实验原理、方法与技巧

一、硅胶柱层析原理

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得

到分离,一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物

质不易被硅胶吸附,整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸

过程。

硅胶柱层析流动相

极性小的用乙酸乙酯:石油醚系统;极性较大的用甲醇:氯仿系统;极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统;拖尾可以加入少量氨

水或冰醋酸

硅胶柱层析惯用方法

1.称量。 200-300 目硅胶,称 30-70 倍于上样量;如果极难分,也可以用 100 倍量的硅胶 H。干硅胶的视密度在 0.4 左右,所以要称 40g 硅胶,用烧杯量 100ml 也可以。

2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚 /乙酸乙酯 /丙酮体系,就用石油醚拌;如果洗脱剂

是氯仿 /醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水

量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,

必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去

1% 的醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱。

3.装柱。将柱底用棉花塞紧,不必用海沙,加入约1/3 体积石油醚(氯仿),装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内。

随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚(氯仿)将其冲入

柱中。

4.压实。沉降完成后,加入更多的石油醚,用双联球或气泵加压,直至流速恒定。柱床约被压缩至 9/10 体积。无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分离度提高很多,且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面。

6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱。收集的例子:10mg 上样量,1g 硅胶 H,0.5ml 收一馏分; 1-2g 上样量,50g 硅胶(200-300 目),20-50ml 收一馏分。

7.检测。要更多地使用专用喷显剂,如果仅用紫外灯,会损失较

多产品,紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2 个数量级。

8.送谱。收集的产品旋干,在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少

或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm 左右所谓的“硅胶”峰。

二、柱层析分离的实验方法和技巧

常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以

硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。

一:柱子可以分为:加压,常压,减压

压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。

减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用

水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。

加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

二:关于柱子的尺寸

应该是粗长的最好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,

上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相

对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,

那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如

果样品层只有0.5 厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对

于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸

后也就减小了部分浪费)。

现在见到的柱子径高比一般在 1:5~ 10,书中写硅胶量是样品量

的 30~ 40 倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的

比较开(是指在所需组分 rf 在 0.2~ 0.4,杂质相差 0.1 以上),就可以

少用硅胶,用小柱子(例如 200 毫克的样品,用 2cm× 20cm 的柱子);如果相差不到 0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用

3cm 的,也可以减小淋洗剂的极性等等。

三:关于无水无氧柱

适用于对氧,水敏感,易分解的产品,可以湿柱,也可以干柱。不

过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放

出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵

循 schlenk 操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是 schlenk 操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直

接看柱子上的色带就行了。如果样品无色,只好准

备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在

哪,也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱,需要六个

schlenk ,现在只一个就能把所要的全收集到。

无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但是比硅胶要贵些。听说有个方法,就是用石英做柱子,然后用

HF254做固定相,这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里

了,没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。

四:关于湿法、干法上样

湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现,是因为硅胶对样品的吸附饱和,

而样品本身又是比较好的固体才会发生,这就应该先重结晶,得到大部分的产品后再柱分,如果不能重结晶,那就不管它了,直接过就是了,样品随着淋洗剂流动会溶解的。

有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如 DMF,DMSO 等,会随着溶剂一起走,显色是一个很长的脱尾),这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是 1:1,我觉得是越少越好,但是要保证在旋干后,不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样品没有

吸附在硅胶上)。

五:溶剂的选择

当然是最便宜,最安全,最环保的了。所以大多选用石油醚,乙酸

乙酯。文献中有写用正己烷的,太贵了,除非特别需要不要用不然银子

哗哗的,流的比淋洗剂还快,不过因为极性很小,有时还是非它不可。乙醚也可以用,但是就是容易睡觉,注意保持清醒别让溶剂流干了,

那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和硅胶的吸

附是一个放热过程,所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡,天气冷

的时候会好一些。甲醇据说能溶解部分的硅胶,所以产品如果想过元

素分析的话要留神,应该经过后继处理,比如说重结晶等。其他的溶剂

用的相对较少,要依个人的不同需要选择了。

由于某些原因,用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛),我们这里是

用10 升或25 升的塑料桶装的,就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质,其他的杂质就可想而知

了,所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以

免去这一步了,反正下面还有提纯的方法。

另外溶剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是,一般在

过柱同时进行的是减压旋蒸,石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不

同会导致极性的变化,一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较合适,正好极性越来越大了。在过完柱子后,溶剂最后回收要采用常

压,因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来,常压时就会

减少这种现象,如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。

六:关于操作问题

1、装柱

柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的,可

以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别,只要能把柱子

装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太

慢),一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。书中写的都是不

能见到气泡,我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响,一加压

气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂,甭管竖的还是横的,都会影响分离效果,

甚至作废!

2、加样

用少量的溶剂溶样品加样,加完后将下面的活塞打开,待溶剂层下降至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如此两三次,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂,一开始不要加压,等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2~4cm 就够了),再加压,这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。

3、淋洗剂的选择

感觉上要使所需点在 rf0.2 ~0.3 左右的比较好。不要认为在板上爬高了

分的比较开,过柱子就用那种极性,如果 rf 在 0.6,即使相差 0.2 也不

容易在柱子上分开,因为柱子是一个多次爬板的状态,可以通过公式

的比较: 0.6/0.8 一次的分离度,肯定不如( 0.2/0.3 )的三次方或四次

方大。

4、样品的收集

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话,就不容易流出。这样就会发生,后面的点先出,而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外,收集的试管大小要以样品量而定,特别是小量样品,如果用大试管,

可能一根就收到了三个样品, wuwu 。如果都用小试管那工作量又太

大。

5、最后的处理

柱分后的产品,由于使用了大量的溶剂,其中的杂质也会累积到产品中,所以如果想送分析,最好用少量的溶剂洗涤一下,因为大部分的杂质是溶在溶剂里的,一洗基本就没了,必要时进行重结晶。

另外,再过柱的时候,有时会出现气泡,一是和使用的溶剂有关,如果是易挥发的溶剂,如乙醚、二氯甲烷等,在室温稍高的情况下,很

容易出现这种现象,因此,在室温高的时候,可以选择沸点较高,

挥发相对小的溶剂。还有,使用混合溶剂时,使用的两种溶剂的沸点

应该相差不大,如:乙酸乙酯和石油醚(60~90), 而乙醚却要选择30

-60 的石油醚。二是:不论是用带砂板的还是塞棉花的,在装柱之前,都要将空气用加压的方法将空气排干,这样就可避免柱中有空气!

硅胶吸附柱色谱技术实际应用

硅胶吸附柱色谱技术实际应用 2009-10-11 23:36:02| 分类:化工交流|字号订阅 色谱法,又称层析法.是一种以分配平衡为机理的分配方法.色谱体系包含两个相,一个是固定相,一个是流动相.当两相相对运动时,反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异,最后达到彼此分离的目的. 色谱法从发明到现在已有八十多年的历史.它是纯化和分离有机或无机物的一种方法. 色谱法按固定相的状态可分为柱色谱.平板色谱和棒色谱三种而实验室中最常用的是柱层析和薄层层析,以及它们之间的配合应用.[1] 柱层析[2] 1 吸附色谱地原理 在一定条件下,硅胶与被分离物质之间产生作用,这种作用主要是物理和化学作用两种.物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的范德华力.化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用. 2操作步骤 2.1 硅胶准备[3] 硅胶一般选用250-400目(即40-63μm直径的硅胶颗粒),根据ΔRf选用硅胶的用量. 2.2 实验仪器准备 一支玻璃色谱柱,一个铁架台,烧杯,锥形瓶,径口直径较大的玻璃漏斗,一支玻璃棒, 2.3 装柱[4] 2.3.1 吸附剂的加入 ①干法:将吸附剂一次加入色谱管,振动管壁使其均匀下沉,然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相,或将色谱管下端出口加活塞,加入适量的流动相,旋开活塞使流动相缓缓滴出,然后自管顶缓缓加入吸附剂,使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。

②湿法:将吸附剂与流动相混合,搅拌以除去空气泡,徐徐倾入色谱管中,然后再加入流动相,将附着于管壁的吸附剂洗下,使色谱柱表面平整。俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下,液面将柱表面相平时,即加试样溶液. 2.3.2试样的加入 ①将试样溶于层析时使用的流动相中,再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽后使呈松散状;将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解,可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。 2.4洗脱 [5] 除另有规定外,通常按流动相洗脱能力大小,递增变换流动相的品种和比例,分别分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不再含有时,再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。 2.5 检测 2.5.1 初步检测 当冲洗溶剂流出一定量后,可对流出液进行初步检测,并且将锥形瓶更换成小试管进行收集.一般只进行初步的快捷检测,因此通常是取一小薄层板,用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块,并安一定的次序编号.取一根内径为 0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液,点于薄层板的一个小格内,待半点干后,然后用物理的或化学的方法检测. 2.5.2 正式检测 ①点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样,如果冲洗溶液太稀,浓度太小,可先浓缩.点样的容器一般用玻璃毛细管,点样斑点的直径一般为 3-5mm. ②展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上行展开. ③展开剂:实用冲洗溶液. ④显色:一般常用物理检测法和化学检测法.物理检测法中首先有紫外光法,紫外光常用两种波长(254nm与365nm).其次是碘蒸气显色法.化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾.显色剂有通用显色剂和专用显色剂.通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,喷雾后,有的化合物立即反应,但多数化合物需加热后经历数分钟才显色,不同化合物的反应不同,所以颜色也往往不同.专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂,利用化合物本身的特有性质,或

色谱法分类

一、胶囊色谱(Micellar Chromatography,MC) 又称拟相液相色谱或假相液相色谱(Pseudophase LC),是一种新型的液相色谱技术。特点是应用含有高于临界胶囊浓度的表面活性剂溶液作为流动相。所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(Critical MicelleConcentration,CMC)时形成的分子聚合体。通常每只胶囊由n个(一般为25~160个)表面活性剂单体分子组成,其形状为球形或椭圆球形。在CMC值以上的一个较大浓度范围内,胶囊溶液的某些物理性质(如表面张力、电导等等)以及胶囊本身的大小是不变的。构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。通常有正相与反相两种胶囊溶液。前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊;后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同,并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析,是一种安全、无毒、经济的优越技术。 (一)原理:胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenous system)。在胶囊色谱中,分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用;同时定量地指出分离组分的容量因子k’的倒数值与胶囊浓度成正比,一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。 (二)方法特点:与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系,而常规流动相是一种均相体系。特点:1、高度的选择性:因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用,只要通过流动相中胶囊浓度的改变,就可使分离选择性获得改善和提高。此外,通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。 2、便于梯度洗脱:由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时,溶液中仅胶囊的浓度发生改变,而表面活性剂单体分子的浓度不变,不影响流动相与固定相的平衡过程,因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间,并减少了流动相的消耗,适用于常规。 3、提高检测灵敏度:胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度,从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。 4、因分离组分不易分出,故缺点是柱效低且不适于制备分离。 (三)常用表面活性剂:常用的阳离子表面活性剂主要有:溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyltrimethylammoniumbromideor chloride,CTMAD或CTMAC);阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS);非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。 二、手性分离色谱(ChiralSeparationChromatography,CSC) 是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异,有必要对某些手性药物进行对映体的纯度检查。 (一)原理和方法:对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外,其理化性质是完全相同的,因而难以分离。传统方法(分步结晶法、酶消化法等)有很大局限性,特别是难以进行微量分离和测定。60年代前后,TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分不多的化合物,且需要较复杂的样品处理步骤,制备分离也难以进行。80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。 HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径:间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。

层析柱装柱流程

层析柱装柱流程标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

层析柱装柱流程 装柱材料 层析柱:BXK层析柱装柱仪器:?KTA 装柱器 装柱溶液 20%乙醇 匀浆的准备 精确计算所需介质的量(这对固定柱高的层析柱尤其重要)。1L填充柱所需的介质量大约是1.15L自然沉淀匀浆的量,于干净烧杯中,取 100%沉降胶(静止放置一天以上,倾去20%乙醇后的胶为100%沉降胶)与等体积20%乙醇混合备用。 安装层析柱 1.?检测层析柱的各个部件,确保干净、完整,拧上下端堵头,拧紧膨胀圈,然后 将层析柱垂直固定在铁架台上。 2.?将装柱器安装在层析柱上端。 3.?往层析柱中加入适量的20%乙醇,打开下端口,重力流,排除下筛网中滞留的气 泡,在液面低至1-2cm高度时关闭层析柱下端出口。 装柱 1.?用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将摇匀的介质加入到层析柱中,这可以减少气泡 的产生。迅速用20%乙醇填满柱子和装柱器,装上装柱器盖子,连接到?KTA 上。 2.?打开层析柱下端,开始以30cm/h流速装柱,直至柱床界面平稳。停止装柱。 3.?打开装柱器盖子,用虹吸法去除界面上端的液体,去掉装柱器,然后小心的用 20%乙醇封满柱子剩余部分。 4.?将上端转接头一端连上?KTA,打开机器,以装柱流速用装柱液排出转接头管路 中及筛板中残留的气泡,然后将转接头另一端装到层析柱上,使转接头下端刚好接触胶界面。(装柱流速约为70-100%的最大流速) 5.?拧紧膨胀圈,继续用装柱流速压柱,至少保持3个柱体积,以界面不变为主, 在界面处做上记号。

6.?关闭泵,并关闭柱子下端出口,使层析柱上端和泵断开(转接器上接口是打开 的),略拧松膨胀圈,缓慢向下转动调节杆,到记号处停止,然后再拧紧膨胀圈,关闭上接口。 7. 检测柱效

硅胶柱层析色谱基本知识汇总

硅胶柱层析色谱基本知识汇总 1.充填法:湿法和干法 湿法:将硅胶和展开剂溶剂配成悬浊液(Slurry)装柱。 干法:在柱子中装入干硅胶填实,再加入展开剂流过浸润硅胶。 在柱子中装入硅胶固定相虽然有这两种不同的办法,但是只要手法得当,把硅胶填充实,两种装法的分离效果没有明显区别。 2.分离效果和流动向的极性 硅胶柱的分离效果与和他相同固定相的TLC一致,洗脱(展开)距离变长,分离效果(△Rf)变好。也就是说,固定相长度越长,分离效果越好。另外,流动相极性越小,产物流出的速度越慢 3.open column chromatography和Flash chromatography open column也称常压柱,是通过重力使展开剂流出,Flash chromatography是由空气泵将流动相加压流出。 4.经验?理论? 最开始过柱子的人,成败可能确实取决于个人运气和手法吧?个人觉得经验和理论都很有必要。 那么这里就给大家介绍一下Still的flash chromatography的要点吧。 1.TLC上想要物质的点的Rf= 0.35~0.45的展开剂来洗脱效果最佳。 2. 参照列表中,柱子的尺寸和所需的溶剂量。(ref: 2a, Table 1 ) 3.固定相(Silica gel)的长度(高度)在15cm(或以下)的话可以用干法装柱,流动相全部加入,浸润硅胶,此过程反复1~2次。 4.粗产物用展开剂或者更小极性的溶剂溶解,打开柱子下方活塞,轻轻上样。

5.在不破坏硅胶表面平整的情况下,加入流动相,并用试管接取。 6. 能接20根试管的话,可以用TLC检测6~20根试管里有没有所要物质,当然如果接到20根还有,只能继续直到没有物质流出。 7.把相同的产物合并,然后旋蒸除溶剂。 5.其他主观经验 Rf= 0.45时,8±2根试管附近;Rf= 0.35时,13±2根附近会开始有目标化合物的点。 △Rf= ~0.05时,固定相高是22cm左右,Rf= 0.3的话,25±2根就会有目标化合物点流出。 原文中5 cm / min程度的速度使流动相流动,速度提高分离效果也不会有太大变化。 Flash chromatography中加压后会导致柱子硅胶填充更紧实,流速变慢,尤其是湿法装柱,这一点要注意,所以必要的时候也可以用干法装柱。

硅胶层析柱的填装方法

硅胶层析柱的填装方法 硅胶层析柱所用的硅胶是试剂级,100-200目,在实验前将10g左右的硅胶放在托盘中,130℃真空干燥箱内活化16h,活化后放在干燥器中冷却,待用。 将无水硫酸钠盛装在托盘中,在450℃马弗炉中活化2h,后取出放在干燥器中冷却,待用。 一、装柱过程: 1、取40ml烧杯4个,100ml量筒2个(分别倒取二氯甲烷100ml,正己烷90ml),40cm玻璃棒1个,250ml烧杯1个(盛装废液用),铁架台1个,层析柱1个(长350mm,内径20mm),不锈钢铁勺1个,20ml注射器(带针头)2个(以上仪器均干净)。 2、拌硅胶。将活化过的硅胶倒入40ml烧杯中,用另一个20ml烧杯盛取二氯甲烷并缓慢倒入硅胶中,同时用玻璃棒不断搅拌,赶走硅胶中的气泡。 3、倒硅胶。用少量二氯甲烷淋洗层析柱,玻璃棒引流;之后将上述拌好的硅胶沿着玻璃棒倒入层析柱,倒完后缓慢抽出玻璃棒。 4、敲柱子。用橡皮管敲击柱子,赶走层析柱硅胶中的气泡,然后打开活塞,流出洗脱液,让硅胶自然沉降;在此期间,用不锈钢小勺舀取一勺无水硫酸钠,倒入层析柱中;等到柱子快干是关闭活塞(二氯甲烷的液面在无水硫酸钠的表面以上)。 5、走柱子。柱子装好后用20ml二氯甲烷冲洗层析柱2次,注意用玻璃棒引流,缓慢倒下二氯甲烷,并打开活塞,使洗脱液缓慢流下,确保液面保持在硫酸钠表面以上,不能流干;再用40ml正己烷冲洗层析柱,待液面在硫酸钠以上些许时关闭活塞。 6、层析柱至此装好,待用。 二、样品走柱子过程: 1、将样品液转移到装好的层析柱中后,用1-2ml正己烷清洗鸡心瓶,并转移到层析柱内,流出液弃去。 2、用25ml正己烷洗脱层析柱,弃去流出液,关闭活塞。 3、将盛装废液的烧杯移去,将K-D浓缩瓶接在层析柱下,再用30ml二氯甲烷/正己烷淋洗液(体积比2:3)洗脱层析柱,以2-5ml/min流速接收流出液于K-D 浓缩瓶中。 仪器名称规格数量 烧杯40ml 4个250ml 1个 量筒100ml 2个玻璃棒40cm 1个铁架台1个层析柱350mm×20mm 1个不锈钢小勺1个注射器20ml 2个

层析柱使用说明书

目录 一产品介绍 (2) 二产品特点 (2) 三技术参数 (2) 四操作说明 (2) 五操作注意事项 (4) 六售后服务承诺 (5) 七合格证 (5) 八随机附件 (6)

一产品介绍: 层析过程是采用特殊的吸附剂,从植物提取液中选择性地吸附其中的有效部分,去除无效成分的一种分离纯化新工艺。可以解决植提生产中所面临的剂量大、产品吸潮和重金属残留等实际问题。经层析技术处理后所得到的精制物,可使有效成分高度富集,杂质少,提取得率仅为原生物的2~5%,而一般水煮法为30%左右,醇沉法为15%左右;可有效地去除吸潮成分,并增强产品的稳定性;可有效地去除重金属。层析分离工艺所得提取物体积小,不吸潮,容易制成外型美观的各种剂型,尤其适用于颗粒剂、胶囊剂、片剂等的生产。该技术将是对中药提取工艺影响最大、带动面最广的技术进步之一。用于生物工程、制药工业、精细化工领域的分离纯化设计制造的工业制备,具有分辨高、选择性好、流动连续、效率高、处理稳定、样品可多可少、易于操作的特点,适用于含量少的复杂高分子物质的分离纯化,是中草药、化学合成药及生物活性物质有效成分分离提纯的核心设备。 二产品特点: ①合理的高径比,精密的进出口流体分布装置,保证层析柱装填效果和填 料再生效果,为高效分离提供了保障。 ②产品采用不锈钢材料,并进行内外抛光,耐腐蚀、使用寿命长、硬度高、 运输安全,质量有保障。 ③本设备确保无污染、效率高、操作方便等。 三技术参数

四操作说明 层析操作流程一般为:预处理,逆流洗柱,水洗,吸附,解吸、再生等工艺。 1、预处理:在吸附树脂的生产过程中,一般均采用工业级原料,产品没有经过进一步纯化处理,因此树脂内部往往残留少量单体,致孔剂和其他有机杂质,所以在使用之前必须进行预处理。 吸附树脂预处理方法如下: (1)将准备装柱使用的新树脂,用2倍左右体积的甲醇或其他水溶性溶剂(如乙醇、丙酮)浸泡2小时,并不时搅动,使树脂充分溶胀。 (2)、将已充分溶胀的吸附树脂装柱,以每小时3至4倍床体积的流速,将5至8倍的甲醇或其他水溶性的溶剂(如乙醇、丙酮)通过树脂层,至流出液加水稀释不变混。 (3)、甲醇处理后,以每小时6至8倍床体积的流速将去离子水通过树脂层,置换出甲醇即可投入使用。 2、逆流洗柱:逆流洗柱是用水洗除去水离子及破碎填料,树脂装入交换柱后,用蒸留水反洗树脂层,展开率为50-70%,直至出水清晰、无气味、无细碎树脂为止,再用50%-100%乙醇10-15倍体积慢速淋洗。2、用约2倍体积的4-5%HCl溶液,以2m/h流速通过树脂层。全部通入后,浸泡4-8小时,排去酸液,用洁净水冲洗至出水呈中性。冲洗流速为10-20m/h。 3、用约2倍树脂体积的2-5%NaOH溶液,按上面进HCl的方法通入和浸泡。排去碱液,用洁净水冲洗至出水呈中性。流速同上。酸碱溶液若能重复进行2-3次,则效果更佳。经预处理后的树脂,在第一次投入运行时应适当增加再生剂用量,以保证树脂获得充分的再生。 3、水洗:水洗目的主要是除去层析柱上所附着的渣滓。 4、吸附:吸附操作自上而下(或自下而上)通液,可采用不同流速,以选取最佳条件,一般流速sV 2—8。流出液每间隔一段时间取样检测,达泄漏点

色谱法的分类及其原理

色谱法的分类及其原理 (一)按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 (二)按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) :柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱,试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法(paper chromatography):纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体,把试样点在滤纸上,然后用溶剂展开,各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现,根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) :薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层,然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 (三)按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同,又可将其分为:

1、吸附色谱法:利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物(例如,分离醇类与芳香烃)。 2、分配色谱法:利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法:利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法,利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离,而且广泛地应用于有机和生物物质,如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法:是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法,体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻,较早的淋洗出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。这样,样品分子基本按其分子大小先后排阻,从柱中流出。被广泛应用于大分子分级,即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法:相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相,利用与固定相不同程度的亲和性,使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质(或抑制剂)、抗原与抗体,激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用,使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物,

层析柱使用方法

层析柱使用方法 层析柱使用方法柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否,对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是:在柱层析时,由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀(没有填严实),使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花,导致分离效果不好。更常见的例子是:层析柱虽然装得不错,但是由于淋洗剂选择不恰当,结果导致几十毫克产品,用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西,熟手可能只需要半个小时,而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见,这两项技术掌握与否,对于提高工作效率,减轻工作量,减少有机溶剂的使用,从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是:TLC的作用除了跟踪反应进程,检测试剂和原料纯度外,一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析: 1:装柱子(添硅胶)时,有两种方法:即湿法装柱和干法装柱,二者各有优劣。不论干法还是湿法,硅胶(固定相)的上表面一定要平整,并且硅胶(固定相)的高度一般为15cm左右,太短了可能分离效果不好,太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱:是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后,再填入柱子中,然后再加压用淋洗剂“走柱子”,本法最大的优点是一般柱子装的比较结实,没有气泡。 干法装柱:则是直接往柱子里填入硅胶,然后再轻轻敲打柱子两侧,至硅胶界面不再下降为止,然后再填入硅胶至合适高度,最后再用油泵直接抽,这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”,一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压,下面再用油泵抽,这样可以加快速度。干法装柱较方便,但最大的缺陷在于“走柱子”时,由于溶剂和硅胶之间的吸附放热(可以用手摸柱子明显感觉到),容易产生气泡,这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚,二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉,但是,一旦撤去压力,如在上样、加溶剂等操作的时候,气泡就会释放出来,严重时,整个柱子变花,样品不可能平整地通过,当然也就谈不上分离了。解决的办法是:第一、硅胶一定要天结实;第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”,一定要到柱子的下端不再发烫,恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂,防止添加溶剂的时候,使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样,添加溶剂,则没有这个必要。 2:上样也有干法和湿法之分:干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后,在加入少量硅胶,拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦,但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂(最好就是展开剂,如果展开剂的溶解度不好,则可以用一极性较大的溶剂,但必须少量)将样品溶解后,再用胶头滴管转移得到的溶液,沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后,再加入。湿法较方便,熟手一般采用此法。上样完毕后,接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同,即使两者使用的硅胶都相同,但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时,也显得极性偏大,所以要稀释一倍,但又不能稀释太多,否则成了靠扩散作用来分离,效果也不会好。 谈TLC,需要切记的是: 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时,多尝试几种比例不同,成分不同的展开剂。展开剂的极性太小,点分不开,极性太大,也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关,只有两者比较合适了,才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为:石油迷

离子交换层析柱的装填及处理

离子交换层析柱的装填及处理 一、原理: 有些高分子物质含有一些可以分离的基因,例如-SO3H,-COOH等,因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如:R-SO3H+M+ R-S3M+H+ 或R-NH3OH+CL-— R-NH3CL+OH -这类高分子物质通称离子交换剂,其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同,因此在洗提过程中,不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同,最后得到分离。 二、目的与要求: 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱,选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置: 玻璃层析柱:长19cm,内径1、2cm,3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型(或721型)分光光度计。

四、试剂与药品: 树脂:Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液:0、45N,PH5、3柠檬酸缓冲液,取285g柠檬酸 (C6O7H8?H2O);186g97℅NaOH;105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液:0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂:显色剂列出两种可任选一种。 显色剂(Ⅰ)茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚,再加入0、85 ml TiCL3(15%)显色剂(Ⅱ):茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚,配成5%(W/V)浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时, A、B两溶液在前一天合并,配好的溶液仅能在1-2天内使用,过时失效须重配。 五、方法与步骤: 1、树脂的处理: 关于市售新树脂的处理见 7、,本实验采用处理好的树脂。 2、装柱:将层析柱垂直装好,关闭柱底出口,在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。

硅胶柱层析的操作方法

硅胶柱层析 一、硅胶柱层析的原理 利用吸附原理,即利用硅胶对中药混合物中各种成分吸附能力的差异,而使混合物中各成分得以分离的色谱方法。 二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 1、装柱 操作要点:装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防吸附剂外漏。有干法装柱和湿法装柱两种方法 (1)干法装柱:将硅胶通过漏斗装入柱内,中间不应间断,形成一细流慢慢加入管内。也可用橡皮槌轻轻敲打柱硅胶柱使硅胶装填连续均匀、紧密。柱装好后,打开下端活塞,然后倒入洗脱剂洗脱以排尽柱内空气,并保持一定液面。(2)湿法装柱:将最初准备使用的洗脱剂装入柱内,打开下端活塞,使洗脱剂缓慢流出。然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内(或将硅胶与适量洗脱剂调成混悬液慢慢加入柱内,),硅胶依靠重力和洗脱剂的带动,在柱内自由沉降,此间要不断把流出的洗脱剂加回柱内保持一定的液面,直至把硅胶加完并在柱内沉降不再变动为止。然后在硅胶上面加一小片滤纸或少许脱脂棉。根据加样量控制洗脱剂液面至一定高度。 匀浆法:搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%的醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过

柱。 2、上样 将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中,制成体积小、浓度高的样品溶液,加入层析柱中硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂,则将样品溶于易挥发的溶剂中,并加入适量硅胶(不超过柱中硅胶全量的1/10)与其拌匀,除尽溶剂,将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶(始终保持洗脱剂有一定的液面),再覆盖一层硅胶即可。上样时注意沿着柱内壁慢慢加入,始终保持硅胶上端表面平整;上样量为硅胶的1/60~1/30。 3、洗脱 洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选,一般TLC展开时Rf 值为0.2~0.3的溶剂系统是最佳的洗脱系统,采用梯度洗脱法洗脱。先打开柱下端活塞,保持洗脱剂流速1~2滴/秒。上端不断添加洗脱剂(可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相近)。如单一溶剂洗脱效果不好,可用混合溶剂洗(一般不超过三种溶剂),通常采用梯度洗脱。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。 4、收集处理 等份收集洗脱液,每份收集量大概与所用硅胶的量相当。每份洗脱液采用薄层定性检查,合并含相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单体成分。如仍为几个单体成分的混合物,不易析出单体成分的结晶。则需要进一步层析或用其他方法分离。 注:(1)柱色谱分离能力比薄层分离能力强,效果更好,尤其对结构相似、性质接近、采用薄层难以分离的成分分离效果好。 (2) 洗柱子能不用含水的混合溶剂,就尽量不要用。

硅胶柱层析一些心得

常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分离的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。 1.吸附剂 常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等:吸附剂一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。对吸附剂来说粒子小、表面积大,吸附能力就高,但是颗粒小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性和碱性3种。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后,用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液pH为4,用于分离酸性物质;中性氧化铝的pH约为7.5,用于分离中性物质;碱性氧化铝的pH约为10,用于胺或其它碱性化合物的分离。 因硅胶略带酸性,只能用于对酸不敏感的化合物的分离。常用300-400目的柱硅胶或H 硅胶。若化合物的R f值相差较大,则可考虑使用200-300目硅胶以加快层析速度。 另:因吸附剂的比表面较大,天气潮湿时或长期放置中吸附的水分会对分离效果产生极大的影响(相当于大大增加了固定相的极性导致样品分不开),因此应将吸附剂放入90~100度烘箱内烘2小时后,取出在干燥器中冷却后再使用。使用的硅胶,不用时一定要密封,防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面,或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。 2.溶质的结构与吸附能力的关系 化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强,氧化铝对各种化合物的吸附性按以下次序递减: 酸和碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃 3.柱子可以分为:加压,常压,减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球是常用的手动加压的方法。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 体会:过柱时是否加压要具体分析,通常情况下直径比较粗的柱子用常压即可,因其横截面积的缘故淋洗剂的流速已足够快。通常控制柱子下端液体流速大约在0.5~1滴每秒的范围比较合适。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。一般不推荐使用。 4.柱子的尺寸 从理论上讲应该是粗长的好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了。

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为:液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法(液-固吸附色谱法) 固定相是固体吸附剂,它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂:一些多孔的固体颗粒物质,其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后,在随载液流动的过程中,发生如下交换反应: X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相) 其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为: K值较小:溶剂分子吸附力很强,被吸附的溶质分子很少,先流出色谱柱。 K值较大:表示该组分分子的吸附能力较强,后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡,就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂:薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律:对于固定相而言,非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱,分配比k较小,保留时间较短;但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强,分配比k大,保留时间长。 对流动相的基本要求: 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相:甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不;数量官能团的有机化合物,以及有机化合物的不同的异构体;但液-固色谱法不宜用于分离同系物,因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法(液-液分配色谱法) 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时,在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较快;在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较慢,从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同,均服从分配定律:K=C固/C液 K值大的组分,保留时间长,后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相,非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相,极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相。

离子交换层析柱的装填及处理

一、原理: 有些高分子物质含有一些可以分离的基因,例如-SO3H,-COOH等,因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如: R-SO3H+M+ ————R-S3M+H+ 或R-NH3OH+CL-—————R-NH3CL+OH- 这类高分子物质通称离子交换剂,其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同,因此在洗提过程中,不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同,最后得到分离。 二、目的与要求: 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱,选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置: 玻璃层析柱:长19cm,内径1.2cm,3# 砂芯。 HL-2型恒流泵。 HD-4型电脑核酸蛋白检测仪。 BS-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型(或721型)分光光度计。 四、试剂与药品: 树脂:Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液:0.45N,PH5.3柠檬酸缓冲液,取285g柠檬酸(C6O7H8?H2O);186g 97℅NaOH;105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液:0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。 显色剂:显色剂列出两种可任选一种。 显色剂(Ⅰ)茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚,再加入0.85 ml TiCL3(15%) 显色剂(Ⅱ):茚三酮-KCN溶液。 0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚,配成5%(W/V)浓度的溶液。 B、将2.5ml 0.01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时,A、B两溶液在前一天合并,配好的溶液仅能在1-2天内使用,过时失效须重配。 五、方法与步骤: 1、树脂的处理: 关于市售新树脂的处理见7、,本实验采用处理好的树脂。 2、装柱:将层析柱垂直装好,关闭柱底出口,在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。将经处理已成钠型的树脂置于烧杯中,加进1倍体积的柠檬酸缓冲液,搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满。倒时不要太快,以免产生泡沫。待树脂在柱底逐渐沉积至约1cm高时,用吸管吸去柱内上层所出现的清液,慢慢打开柱底出口,继续加注树脂悬液直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败,另外树脂悬浮液的温度要相对恒定(特别是

硅胶柱层析

硅胶柱层析 硅胶柱层析 硅胶柱层析原理 硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离,一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附,整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。 硅胶柱层析流动相 极性小的用乙酸乙酯:石油醚系统;极性较大的用甲醇:氯仿系统;极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸系统;拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅胶柱层析惯用方法 1.称量。200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;如果极难分,也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml也可以。 2.搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%的醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱。 3.装柱。将柱底用棉花塞紧,不必用海沙,加入约1/3体积石油醚(氯仿),装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。 4.压实。沉降完成后,加入更多的石油醚,用双联球或气泵加压,直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分离度提高很多,且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。 5.上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面。 6.过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱。收集的例子:10mg上样量,1g硅胶H,0.5ml收一馏分;1-2g上样量,50g硅胶(200-300目),20-50ml收一馏分。 7.检测。要更多地使用专用喷显剂,如果仅用紫外灯,会损失较多产品,紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。 8.送谱。收集的产品旋干,在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。 操作

BPG层析柱规范标准装柱经过流程规范标准

操 作 标 准 目的:为了使BPG300层析柱装柱过程可重复,并能够得到较好的柱效,故建立此操作规范。 范围:配合?KTA process 系统进行有效的蛋白质纯化操作。 责任人:层析工序操作人员 标准操作程序: 1 基本术语概念 填料因子(Packing Factor, PF ):指在在装柱过程中,用低流速(如60cm/h )对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度 GEHC 生产的各种常见填料的PF 参见《GEHC AxiChrom 300-1000 columns User Manual 28-9562-89 Edition AA 》; 线性流速(linear flow rate ):单位时间内液体流经的直线距离,常用cm/h 表示; 体积流速(volume flow rate ):单位时间内液体流经的空间容积,常用

ml/min表示; 2 准备工作 2.1 检查层析柱的完整性,所带配件,是否水平(用水平仪矫正),是否清洁(如有污染应进行清洗)。 2.2 确定所用填料及其特性、浓度等 以DEAE Sepharose Fast Flow填料为例,其填料因子(PF)为1.15,新填料(slurry)浓度为75%(保存于20%乙醇中),耐压3bar。 2.3 确定放大后的工艺参数 以XX生化制药股份有限公司的放大工艺为例, 中试工艺参数: 柱高h=10cm;体积流速v1=3ml/min;柱内径d=1.6cm. 即,线性流速v2=v1/s柱=3/(3.14×0.82) cm/min=1.5 cm/min; 样品与填料接触时间t=h/v2=10/1.5min=6.67min; 在工艺的线性放大中h、v2和t均不变,则可保证样品出峰的位置(洗脱时间)和形状不变。 使用BPG300层析柱进行放大的工艺参数: 装柱体积V柱= S柱h=3.14×1.52×1L=7L; 装柱需要slurry体积V slurry=V柱×PF/C slurry 以DEAE Sepharose Fast Flow为填料, 则,V slurry=7×1.15/0.75L=10.73L; 装入柱中的slurry高度L slurry=V slurry/S柱=10.73/(3.14×1.52)dm=1.52dm=15.2cm. 3管路安装 3.1 层析柱管道和配件安装 3.1.1卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈,旋松密封调节器,用纯水或20%乙醇 充分浸润柱内壁和柱头O型圈;

硅胶柱层析选择洗脱剂的原则

展开剂的极性规律 单一溶剂的极性大小顺序为: 石油醚(小)→环己烷→四氯化碳→三氯乙烯→苯→甲苯→二氯甲烷→氯仿→乙醚→乙酸乙酯→乙酸甲酯→丙酮→正丙醇→甲醇→吡啶→乙酸(大) 混合溶剂的极性顺序: 苯∶氯仿(1+1)→ 环己烷∶乙酸乙酯(8+2)→氯仿∶丙酮(95+5)→苯∶丙酮(9+1)→苯∶乙酸乙酯(8+2)→氯仿∶乙醚(9+1)→苯∶甲醇(95+5)→苯∶乙醚(6+4)→环己烷∶乙酸乙酯(1+1)→氯仿∶乙醚(8+2)→氯仿∶甲醇(99+1)→苯∶甲醇(9+1)→氯仿∶丙酮(85+15)→苯∶乙醚(4+6)→苯∶乙酸乙酯(1+1)→氯仿∶甲醇(95+5)→氯仿∶丙酮(7+3)→苯∶乙酸乙酯(3+7)→苯∶乙醚(1+9)→乙醚∶甲醇(99+1)→乙酸乙酯∶甲醇(99+1)→苯∶丙酮(1+1)→氯仿∶甲醇(9+1) 选择展开剂,要依据溶剂极性和他们的混溶性,溶剂对被分析物的溶解性,以及被分析物的结构。这里只讨论药典里通常使用的以硅胶为固定相主体的正相薄层,也不考虑板的活性。 列出溶剂极性参数表,方便以下比较展开剂。环已烷 :-0.2、石油醚(Ⅰ类,30~60℃)、石油醚(Ⅱ类,60~90℃)、正已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、异丙醇:3.9、正丁醇:3.9 、四氢呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、 水:10.2 。 关于溶剂混溶性,一般根据相似相溶原则,需要注意,极性相差大的不混溶,比如正己烷与甲醇。多元展开剂,主体的两种溶剂不能混溶,就需要通过第三种溶剂来调和。比如:石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、环已烷和甲醇、水之类的。 一般正相色谱,固定相为极性,被分析物质的极性越大,需要极性更大的展开剂。 了解被分析物的极性可以通过分析其结构获得,很难获得它的极性指数。物质分子化学结构中,通常由较极性部分和非极性部分两部分。例如下面以苯丙烷为极性小部分,随着极性基团部分的增加,总体的极性就增加,展开剂极性也增加了。 ,依次为肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、绿原酸。 相应展开剂分别为:正己烷—乙醚—冰醋酸 (50.1)、苯-冰醋酸-甲醇(303)、氯仿-甲醇-甲酸(9 0.5)、石油醚-乙酸乙酯-甲酸(3 1)、醋酸

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