第七节 离子交换色谱

第七节离子交换色谱

离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。

20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交

换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。

一、离子交换色谱相关理论

(一)基本原理

离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。

图6.7-1 离子交换色谱原理

起始缓冲液中的离子；梯度缓冲液中的离子；极限缓冲液中的离子；

待分离的目标分子；▲需除去的杂质

1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平

衡色谱柱，以备下次使用

蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。

(二)基本理论

1 . 离子交换作用

离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、蛋白质形成的离子)依靠静电引力能够吸附在其表面(如图6.7-2所示)。这样，各种离子与离子交换剂结合时存在竞争关系。

无机离子与交换剂的结合能力与离子所带电荷成正比，与该离子形成的水合离子半径成反比。也就是说，离子的价态越高，结合力越强；价态相同时，原子序数越高，结合力越强。在阳离子交换剂上，常见离子结合力强弱顺序为：

Li+

图6.7-2离子交换色潜中所进行的离子

交换过程(以阳离子交换树脂为例)

在阴离子交换剂上，结合力强弱顺序为：F—

目的物与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液pH，它决定了目的物的带电状态，此外还取决于溶液中离子的种类和离子强度。起始条件，溶液中离子强度较低，上样后，目的物与交换剂之间结合能力更强，能取代离子而吸附到交换剂上;洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加了离子的竞争性结合能.力，使得样品从交换剂上解吸，这就是离子交换色谱的本质。

2. pH和离子强度I的影响

pH和离子强度I是控制蛋白质离子交换行为、分辨率、回收率等的重要因素。

pH决定了目标分子及离子交换剂的带电荷情况，因而是决定目的物是否发生吸附的最重要参数。分离时，应控制pH使得目标分子和离子交换剂带相反的电荷。一方面，离子交换剂有一个工作pH范围，在此范围内能够确保离子交换剂带充足的电荷；另一方面，溶液的pH直接决定了目标分子带电荷的种类和数量，选择适当的pH，能够保证目标分子与离子交换剂带相反电荷而被吸附，同时如果pH距离目标分子等电点过远，则造成目标分子与离子交换剂结合过于牢固而不易洗脱。

在选择操作pH时还需特别注意目标分子的pH稳定范围，若超出此范围会造成目标分子活性丧失，导致回收率下降。特别是要考虑到由于道南效应

( Donnan）的存在，离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的，离子交换剂是亲水的，其表面有一层水膜，水膜里可以看作是离子交换剂的微环境。在阳离子交换剂表面的微环境中，H+被阳离子交换基团吸引而OH—被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中低1个pH单位；而阴离子交换剂表面的微环境中，OH —被阴离子交换基团吸引而H+被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中高1

个pH单位。例如，某蛋白质在pH5时被阳离子交换剂吸附，实际上该蛋白质在交换剂表面是处在pH4的环境中，若此蛋白质在此pH条件下不稳定将会失活。大多数蛋白质在pH4以下稳定性都会下降而使回收率很低。

由于溶液中的其他离子与目标分子竞争结合到离子交换剂上，因此离子种类和离子强度I是影响月标分子结合和洗脱的另一重要因素。低离子强度下，目标分子通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上;当竞争离子浓度即离子强度I逐渐升高时，目标分子逐渐被置换下来。绝大多数目的物在

1mol/L的盐浓度下能够被洗脱，因此在探索条件阶段，人们常把洗脱盐的终浓度定为1mo1/L。事实上在溶液中盐类还常扮演稳定目的物结构的角色，另外，不同离子从交换剂上将目的物置换下来的能力是不同的，并且离子类型还会对分辨率和不同蛋白质的洗脱顺序产生影响。

3. 疏水相互作用和氢键

虽然目的物与离子交换剂发生结合主要依靠相反电荷之间的离子键，但实际上此过程中还可能存在其他的作用力，常见的就是疏水相互作用和氢键。

疏水相互作用主要出现在使用带非极性骨架的离子交换剂时，例如离子交换树脂，特别是聚苯乙烯树脂，骨架带有较强的疏水性，能与目的物分子中的一些疏水性氨基酸残基之间通过疏水相互作用结合。现代HPLC中仍有部分色谱介质以树脂为骨架。氢键主要出现在使用以亲水性高分子为骨架的离子交换剂，如以Sephadex或Sepharose为基质的离子交换剂，骨架糖链中的轻基、羧基等基团能够与目的物分子中带亲水侧链的氨基酸残基之间形成氢键。当目的物与杂质在电性质方面很接近时，这些额外的作用力在分离时起着决定性的作用，据此往往可实现分离。

4. 离子交换动力学

离子交换的发生及进行的程度即离了交换平衡取决于离子作用，而离子交换动力学则取决于离子交换剂的颗粒结构。

离子交换剂的骨架是具有网孔状结构的颗粒状凝胶，而荷电功能基团均匀分布在凝胶颗粒的表面及网孔内部，可交换分子依据分子量的不同，不同程度地进人凝胶颗粒内部，将荷电功能基团上的反离子置换下来而自身结合到离子交换剂上。

从动力学角度分析，整个过程可分为5个步骤(图6.7-3）。①可交换分子在溶液中经扩散到达凝胶颗粒表面。亲水性的凝胶和水分子形成氢键，从而在凝胶表面束缚了一层结合水构成水膜，水膜的厚度取决于凝胶的亲水性强弱、色谱时流速的快慢，亲水性越强、流速越慢，水膜越厚，反之水膜越薄。可交换分子通过扩散穿过水膜到达凝胶表面的过程称为膜扩散，速度取决于水膜两侧可交换分子的浓度差。②可交换分子进入凝胶颗粒网孔，并到达发生交换的位置，此过程称为粒子扩散，其速度取决于凝胶颗粒网孔大小(交联度)、交换剂功能基团种类、可交换分子大小和带电荷数等多种因素。③可交换分子取代交换剂上的反离于

图6.7-3 离子交换动力学示意

(以阳离子交换剂为例)

而发生离于交换。④被置换下来的反离子扩散到达凝胶颗粒表面，也即粒子扩散，方向与步骤②相反。⑤反离子通过扩散穿过水膜到达溶液中，即膜扩散，方向与步骤①相反。

根据电荷平衡的原则，一定时间内，一个带电分子进人凝胶颗粒，就有与该分子所带净电荷数相当数量的反离子扩散出凝胶颗粒。上述5个步骤实际上就是膜扩散、粒子扩散和交换反应3个过程。其中交换反应通常速率比较快，而膜扩散和粒子扩散速率较慢，当溶液中可交换分子浓度较低时，膜扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤；当溶液中可交换分子浓度较高时，粒子扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤。灌注色谱动力学角度分析，就是通过独有的二元孔网络结构，可使粒子扩散速率大大提高，从而使整个过程效率提高。

(三) 离子交换的分辨率

同其他色谱分离一样，离子交换的效果常用两个目标峰的分辨率(Rs)来描述。

一个纯化系统能够达到的分辨率取决于该系统的选择性、效率和容量，这是柱色谱中的3个最重要的参数。Rs 的解析表达式为:

k

1k a 1-a 41s '+'?=N R （6.7-1） 式中 a ——选择性

N ——柱效率

k ＇——容量因子

1. 容量因子

容量因子k ＇又称保留因子，是色谱分离中常用的组分保留值表示法。 0000/t /t t k V V V R R -=-='）（ （6.7-2） 式中 t R 和V R ——溶质的保留时间和保留体积

t 0和V 0——非滞留组分的保留时间和保留体积

一般来说，容量因子k ＇的取值与可交换分子在固定相(离子交换剂)和流动相(缓冲液)中的分配性质、色谱温度及固定相和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。

2. 柱效率

柱效率用在特定实验条件下色谱柱的理论塔板数N 来表示，通常表示为每米色谱床所包含的理论塔板数，其计算公式:

2

h 54.5???? ???=W V N R （6.7-3） 式中 V R ——洗脱峰的洗脱体积

W h ——洗脱峰半峰高（h 1/2）时对应的峰宽

柱效率下降会导致色谱时区带变宽，也就是洗脱峰的峰宽变大口导致区带变宽的原因之一是可交换分子在色谱柱床中发生纵向扩散，采用尺寸较小的凝胶颗粒作为离子交换剂的基质，可有效减小能够发生纵向扩散的距离，从而大大提高柱效率。现代离子交换色谱介质中有些是以很小的颗粒作为基质的(小于3μm ），它们有非常高的柱效率，但它们往往是非孔型的，可交换分子只能结合在其表面，因而此种离子交换剂的交换容量会下降。另外，随着基质颗粒的减小，色谱分离时产生的背景压力会增大，不利于进行快速、大规模的色谱。除基质颗粒大小外，实验技术是影响柱效率的另一重要因素，色谱柱床面不平整，柱床内有气泡等都

会导致柱效率下降。因此色谱过程中操作条件的控制对色谱效果影响很大。

3.选择性

选择性是一个系统分离不同蛋白峰的能力，习惯用相对保留值a 来表示，a 定义为：

1201021

2k k a R R R R V V V V V V ≈--=''= (6.7-4） 式中 k 1＇和k 2＇——洗脱峰1和2的容量因子

V R1和V R2——洗脱峰1和2的洗脱体积

V 0 ——非滞留组分的洗脱体积

从对分辨率的影响上来看，好的选择性往往比高的柱效率更为重要(图6.7-4)。

图6.7-4 选择性和柱效率对分辨率的影响 影响到离子交换色谱时选择性的因素包括：离子交换剂上功能基团的性质和数量，pH 和离子强度等实验条件。由于上述实验条件是容易调控的，因而人们更乐于通过控制实验条件来提高选择性，从而获得好的分辨率。

根据前面所述Rs 的解析表达式可知，为了提高一个分离过程的分辨率R S 以达到满意的分离效果，必须满足以下条件：①a>1，当V R1-V R2时a=1，此时两峰完全重叠，分辨率为0，,a 值越大，两洗脱峰相距越远，分辨率越高；②N 尽可能大，理论塔板数越大，柱效率越高，分辨率也越高；③k ＇≠0，,根据k ＇的计算公式，当两种蛋白的洗脱体积V R1和V R2均等于非滞留组分的洗脱体积V 0时k ＇﹦0，此时无法实现分离，分辨率为0，选择合适的色谱条件，使得至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满足k ＇≠0，增加k ＇的值将提高分辨率Rs ，有利于分离。

二、离子交换色谱介质(离子交换剂)

离子交换剂是离子交换色谱的基础，它们决定着分离过程的分辨率，同时还决定着分离的规模和成本，现代离子交换技术的进步得益于优质高效离子交换剂的研制和应用。

(一)基本结构

离子交换剂由水不溶性基质和共价结合在基质上的带电功能基团组成，带电功能基团上还结合有可移动的与功能基团带相反电荷的反离子(又称平衡离子)。反离子可被带同种电荷的其他离子取代而发生可逆的离子交换，此过程中基质的性质不发生改变。

离子交换剂所带功能基团分为酸性基团和碱性基团两类，其中带酸性功能基团的离子交换剂在工作pH范围内解离放出质子而带有负电荷，能够结合溶液中带正电荷的离子(阳离子)，因此被称为阳离子交换剂；而带碱性功能基团的离子交换剂在工作pH范围内结合质子而带有正电荷，能够结合溶液中带负电荷的离子〔阴离子)，因此被称为阴离子交换剂。

基质是一类水不溶性的化合物，理想的墓质应当满足以下条件：①有较强的机械稳定性，能适合高流速的需要；②具有亲水性，至少在颗粒表面应当是亲水性的；③高化学稳定性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便色谱前后的清洗和消毒灭菌；④高的交换容量，以满足分离较大规模样品的需要；⑤球形，颗粒直径均匀；⑥价格尽可能便宜以降低分离成本。

(二)功能基团和酸碱性质

带电功能基团决定了离子交换剂的基本性质，功能基团的类型决定了离子交换剂的类型和强弱，它们的总量和有效数量决定了离子交换剂的总交换容量和有效交换容量。

根据功能基团是酸性基团还是碱性基团，离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。此外，根据功能基团的解离性质，离子交换剂还可分为强型离子交换剂和弱型离子交换剂，强弱并不是指可交换分子与交换剂结合的牢固程度，而取决于带电功能基团的pKa值。强型离子交换剂带有强酸性或强碱性功能基团，其pKa值很低或很高，远离中性，因此解离程度大，在很宽的pH范围内都处于完全解离状态；弱型离子交换剂则带有弱酸性或弱碱性功能基团，其pKa值与强型交换剂相比靠近中性，工作pH范围较窄，超出此范围会造成解离程度下降，

带电荷数量明显减少。当色谱pH远离pKa时，无论是强型还是弱型离子交换剂都能牢固吸附可交换分子。结合上述两种分类方法，离子交换剂可以分为强酸型(强阳)、强碱型(强阴)、弱酸型(弱阳)和弱碱型(弱阴)四种。

表6.7-1列出了较为常用的离子交换功能基团的名称和种类。强酸型离子交换剂中最常用的是磺基，弱酸型最常用的是羧基，强碱型最常用的是季铵基，弱碱型最常用的是氨基。除了磷酸基外，其他功能基团一般都只带单个正电荷或负电荷。

表6.7-1 常见的离子交换功能基团

(三) 离子交换剂的部分性质

1. 粒度

用于生化分离的离子交换剂的颗粒直径一般都在3~300μm林二范围内。基质颗粒大小直接关系到分离效果，细颗粒的介质常适用于分析型分离，大颗粒介质适合于制备型分离。除颗粒大小外，基质颗粒的均匀程度对分离效果的影响也很大，颗粒直径越均一，分离效果越好。

2. 交联度和网孔结构

离子交换剂的基质是通过交联剂将线型大分子交联形成网孔状颗粒。不同的离子交换剂使用不同的离子交联剂，例如，聚苯乙烯树脂使用二乙烯苯作为交联剂，葡聚糖和纤维素交换剂使用环氧教丙烷作为交联剂，琼脂糖交换剂使用二嗅丙醇作为交联剂。交联度的大小影响着离子交换剂的很多特性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、交换容量等。一般交联度越高，网孔的孔径越小，交联度越低，网孔孔径越大。离子交换常用介质具有网孔状结构，色谱分离时往往具有分子筛和离子交换双重功效。

3.电荷密度

电荷密度是指恭质颗粒上单位表面积的取代基(功能基团)的数量，它决定着

离子交换剂的交换容量、膨胀度等性质。对小分子进行离子交换时，离子与功能基团按1∶1的物质的量之比结合，交换剂上功能基团密度越大，工作能力越强，高电荷密度的离子交换剂具有优势。但蛋白质类大分子进行离子交换色谱时，决定交换容量方面，交联度比电荷密度重要得多。如果基质颗粒孔径太小以致蛋白质分子不能进人颗粒网孔。即使颗粒表面电荷密度很大，

图6.7-5 离子交换剂的膨胀度与交换剂类型和溶液离子强度的关系测定条件：色讲柱：15mm×30mm；操作压力30cm H2O（1cm H2O=98.0665Pa）（a）和(b)为pH7.6 的Tris HCl缓冲液，(c)和（d）为pH4.3的醋酸缓冲液；离子强度

用NaCl进行调节

交换容量也不高。此外，蛋白质类分子带电荷数量往往较多，与交换剂上功能基团结合不是1:1的物质的量之比关系，而是多点结合，过高的电荷密度会导致蛋白质在离子交换剂上结合过于牢固而难以洗脱，极易造成蛋白质变性，回收率下降。因此，适合蛋白质类分子离子交换的介质电荷密度往往较低。

4. 膨胀度

又称吸水值，是指当干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度，通常用每克干胶吸水膨胀后的体积(mL)来表示。影响离子交换剂膨胀度的因素如下。

①基质种类。一般来说，具亲水性基质的离子交换剂膨胀度要大大高于具有疏水性基质的离子交换剂，前者膨胀度可达到60mL/g干胶，而后者有时在溶液中体积变化非常小。

②交联度。无论是哪一类离子交换剂，其膨胀度都随着交联度的增加而下降。图6.7-5显示了4种基于交联葡聚糖凝胶Sephadex的离子交换剂在不同交联度下的膨胀度情况，由于Sephadex G -25交联度高于Sephadex G-50 ,所以相应的Sephadex A-50和Sephadex C-50交换剂膨胀度分别高于Sephadex A-25 和Sephadex C-50。

③带电基团的强弱。在相同交联度的情况下，Sephadex A-50和Sephadex C-50系列的离子交换剂比它们的基质Sephadex G-50膨胀度大得多，原因在于功能基团带同种电荷，相互排斥而扩展了凝胶颗粒的体积，同样的道理，强酸型和强碱型离子交换剂由于带电荷数量多于相应的弱酸型和弱碱型离子交换剂，其膨胀度相应地也比后者高。

图6.7-6 离子交换剂的膨胀度与溶液pH的关系测定条件：色谱柱15mrn×300mm；操作压力：30cm H2O（1cm H2O=98.0665Pa）；（a）和(b)使用咪唑-乙二胺缓冲液，（c）和（d）使用磷酸缓冲液；离子强度均为0.5mol/L

④溶液的离子强度和pH对于某种特定的离子交换剂，膨胀度不是常数，

其数值受到溶液离子强度和pH值的影响，特别是交联度较小的交换剂，其结构强度不如交联度较大的交换剂，其膨胀度更易受上述因素影响(见图6.7-6）。

应当指出，让离子交换剂在具有一定离子强度的缓冲液中充分膨胀，可以使颗粒网孔增大并保持孔径稳定，这对于交换剂的交换容量和分离效果都是有帮助的，所以离子交换剂使用前要进行预溶胀。

5. 交换容量

交换容量是指离子交换剂能够结合溶液中可交换离子的能力，通常分为总交换容量和有效交换容量。总交换容量又称总离子容量，用每克干介质或每毫升湿胶包含的带电功能基团的数量来表示，其数值的大小取决于离子交换剂的取代程度也就是电荷密度。总交换容量可以通过酸碱滴定的方法来测定，也就是利用交换剂上的酸性或碱性基团同已知浓度的酸碱发生反应，利用物质的量关系算出交换剂上功能基团的数量。也可使得离子交换剂和某种小的离子之间发生完全交换，然后通过侧定该离子的含量算出总交换容量。

总交换容量并不反映交换剂对可交换分子的结合情况，因为交换剂所能结合某种分子的数与该分子的大小、交换剂的网孔结构及所选择的实验条件等多种因素有关口因此，人们提出了有效交换容量的概念，指每克千介质或每毫升湿胶在一定的实验条件下吸附某种分子的实际容量。由于有效容量是一个变值，在说明其数值时应当同时指出实验条件，比如pH和离子强度。表6.7-2列出了几种常用的基于Sephadex的离子交换剂的总交换容量和对特定蛋白质的有效容量。

表6.7-2 几种常用离子交换剂的总交换容量①

有效交换容量中又分出静态容量和动态容量的概念，这是由于色谱分离过程中的流速对有效容量的影响较大。静态容量是指在流速为零，蛋白质有充足的时间从流动相扩散到固定相并吸附在交换剂上，此时离子交换剂对蛋白质的吸附可

以达到饱和，对应的结合容量即为静态容量。在流速很低时测出的有效容量近似于静态容量。而当色谱流速增大后，蛋白质来不及使离子交换剂达到完全饱和，这种在特定流速F测出的有效容量为动态容量，它在数值上总是小丁静态容量。

某种离子交换剂对特定蛋白质的静态容量的测定可采用试管小样法。具体操作如下取若于支试管，分别往其中加入相同体积的已经用起始缓冲液平衡好的离子交换剂，再分别加入一系列不同浓度的蛋白质溶液，混合振荡确保充分吸附，然后分析上清液中是否含有蛋白质成分，根据能使上清液中无蛋白质的最大蛋白质浓度可以计算出每毫升离子交换剂所能吸附的蛋白质的上限，此即为静态容量。

测定动态容量则必须在色谱条件下进行。取一定体积的离子交换剂装柱，用起始缓冲液平衡，在特定的流速下加样至色谱柱上端，注意样品应当溶于起始缓冲液，浓度在1~5mg/mL。为确保离子交换剂满负荷吸附蛋白质，应不停地加样直至紫外检测器测出有蛋白质从柱下端流出，并且检测器上吸光度的读数达到最大值的一半（不含蛋白质的起始缓冲液吸光度为0，样品蛋白质溶液为100%)。停止加样，用起始缓冲液将不能吸附的蛋白质继续洗出，使柱下端流出液的吸光度回到0附近，此时柱内的离子交换剂处于此流速下的最大吸附状态，而柱内液体中又不含不被吸附的蛋自质。改变缓冲液条件。使得蛋白质从色谱柱上解吸，收集洗脱液测定出其中的总蛋白，除以离子交换剂体积后可算出该交换剂在此流速下的动态容量。

(四) 离子交换剂的类型

1.离了交换树脂

树脂是一类通过化学方法合成的具有特殊网状结构的不溶性高分子化合物，网状结构的形成往往通过单体聚合时加人一定比例的交联剂来实现。树脂本身又分为好多种类，最常见的包括聚苯乙烯树脂、聚异丁烯酸树脂、聚丙烯酸树脂、酚醛树脂等。再通过化学方法往树脂骨架上引人功能基团就得到离子交换树脂。离子交换树脂种类很多，不同的生产厂家生产的离子交换树脂所标称的型号和名称各不相同，但有的在性能上是非常相似的。

前面已经提到，由于树脂孔径过小，大分子无法进人颗粒内部造成有效交换容量太小，以及电荷密度太高，会使大分子结合过于牢固而不易洗脱。尽管离子

交换树脂在脱盐、小分子的氨基酸及短肤的分离中有着非常广泛的应用，但通常不用于蛋白质类大分子的色谱。

2. 离子交换纤维素

基于纤维素的离子交换剂是最早用于分离蛋白质类大分子的离子交换剂之一，于1954年由Peterson和Sober最先报道，在当时蛋白质的色谱领域是一个重大突破，而这类交换剂至今仍在广泛使用。纤维素离子交换剂的特点是表面积大，开放性的骨架允许大分子自由通过，同时对大分子的交换容量较大。纤维素的亲水性结构使其表面结合着4倍于自身质量的结合水，形成的交换剂.与蛋白质之间结合时离子键以外的作用力，如疏水相互作用等很低，这使得色谱分离时洗脱很方便，并且蛋白质活性的回收率高。

离子交换纤维素存在着纤维状和微粒状两种不同的物理形态。纤维状的交换剂是将纤维素直接衍生化，连接上功能基团而形成的。纤维素分子是由葡萄糖通过β(1→4）糖苷键连接形成的大分子，天然状态下相邻的多糖链之间形成数量巨大的氢键，从而在这些区域形成微晶结构。微晶区域周围又散布着非晶型〔无定形)区域。微粒状的交换剂是将纤维素进行部分酸水解，除去了大部分非晶型区域后经衍生化形成的，这样的处理使交换剂的外水空间增大，结构也更为牢固，并且电荷分布更均匀。

英国的Whatman公司是最早生产离子交换纤维素的企业之一，产品种类较多，如表6.7-3所示.其中DEA E-纤维素和CM-纤维素属于常规生化分离中最常用的介质类型。

表6.7-3 Whatman公司离子交换纤维素

Pharmacia公司生产的DEAE-Sephacel是另一种常用的纤维素离子交换剂。它先将微晶纤维素的微晶区解体，然后再重新形成珠状结构的凝胶，颗粒直径在

40~160μm。维持交换剂结构的主要作用力还是纤维素分子间的氢键。此外还通过环氧氯丙烷交联强化凝胶结构，在此基础上再连上功能基团。DEAE-Sephacel 的一些特点见表6.7-4。

表6.7-4 Pharmacia公司的DEAE-Sephacel离子交换剂

3. 离子交换葡聚糖

离子交换葡聚糖是Pharmacia公司以两种交联葡聚糖凝胶Sephadex G -25和Sephadex G -50为基质，连接上4种不同的功能基团后形成的离子交换剂。这类交换剂的型号中分别用字母A和C代表阴离子交换剂和阳离子交换剂，用数字25或50代表其基质是Sephadex G- 25或Sephadex G-50。

Sephadex具有亲水性和很低的非特异性吸附的性质，因而很适合作为离子交换剂的基质，由于这种基质具有分子筛效应，使得这类交换剂分离大分子时同时具有离子交换作用和分子筛效应。葡聚糖离子交换剂在交换容量方面要明显大于纤维素离子交换剂。对于相对分子质量小于30000的蛋白质，以Sephadex G -25为基质的Sephadex A -25和Sephadex C-25比以Sephadex G -50为基质的Sephadex A -50和Sephadex C -50。有着更大的交换容量；而对于相对分子质量在30000~100000的蛋白质，Sephadex A-50和Sephadex C-50由于凝胶颗粒网孔孔径较大.其交换容量要明显大于Sephadex A -25和Sephadex C-25；若蛋白质的相对分子质量大于100000，对于25系列和50系列的交换剂，分子的交换与结合都仅发生在颗粒表面，25系列的葡聚糖交换剂因总交换容量高而表现出优势。交联度较小的50系列的葡聚糖交换剂，其膨胀度大于25系列，并受离子强度和pH的影响。当离子强度由0.01mol/L，增加到0.5mol/L时，一根DEAE--Sephadex A -50A 或Sephadex C -50色谱柱的体积会缩小至原来的一半。体积变化跨度过大时，样品有陷人网格的危险，应尽量避免。

4.离子交换琼脂糖

这是一类在交联琼脂糖凝胶的基础上连上功能基团形成的离子交换剂，这类凝胶比葡聚糖凝胶更显多孔结构，由于其孔径稍大，对于相对分子质量在106以内的球状蛋白质表现出很好的交换容量。琼脂糖离子交换剂的多糖链排列成束，不同程度的交联使得束状结构进一步强化，因此该介质表现牢固，体积(膨胀度)随离子强度或pH的变化改变很小。离子交换琼脂糖常用的有Pharrnacia。公司的Sepharose系列和Bio-Rad公司的Bio-Gel A系列。

Pharrnacia公司的Sepharose离子交换剂又包括了Sepharose CL-6B、Sepharose High Performance （Sepharose HP）、Sepharose Fast Flow （Sepharose FF）、Sepharose Big Beads （Sepharose BB）等系列。

Sepharose CL-6B系列是由交联琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B引人功能基团而来的，属于大孔型珠状离子交换剂，这类离子交换剂有较好的分辨率，较高的交换容量，适合于各类大分子的分离。使用时具体特性可仔细查阅商品说明。

Sepharose High Performance 是基于高度交联琼脂糖的颗粒状交换剂，凝胶颗粒粒径平均为34μm，高的交联度赋予该色谱介质极好的物理稳定性，其体积不随pH和离子强度而改变，小的粒度使该色谱介质具有很高的效率和选择性，因此在色谱时有很高的分辨率，是Sepharose系列中颗粒最细、分辨率最高、化学稳定性最好的一类。该系列主要有Q Sepharose High Performance 和

SP-Sepharose High Performance 两种色谱介质，都属于强离子交换剂。Pharrmacia还将Sepharose High Performance 色谱介质填充成预装柱出售，商品名为HiTrap、HiLoad和BioPilot，其柱尺寸顺序增大，分别满足从实验室到小规模生产等不同规模分离的要求。

Sepharose Fast Flow是基于高度交联琼脂糖的颗粒状交换剂，其凝胶颗粒粒径要大于Sepharose High Performance 系列，平均为90μm，这使得它比后者具有更好的流速性能，其线性流速最大可达750cm/h,适合大规模分离纯化的要求。Sepharose Fast Flow系列常见的包括4种介质，覆盖了强阴、强阳、弱阴、弱阳4种类型。Pharmacia。也将Sepharose Fast Flow预装成HiLoad柱出售。

Sepharose Big Beads同样是基于高度交联琼脂糖的颗粒状交换剂，其凝胶颗粒粒径更大，平均为200μrn，大的粒度赋予该介质极好的流速特性，即使在分离勃性样品时仍能保持高的流速，因此非常适合大规模分离使用。该系列主要有

Q-Sepharose Big Beads和SP-Sepharose Big Beads两种色谱介质，都属于强离子交换剂。

Bio-Rad公司开发的Bio-Gel A系列是基于4%交联琼脂糖的离子交换剂，主要有DEAE Bio-Gel A和CM Bio-Gel A两种，它们同样具有物化稳定性高、回收率低等特点。

5. 高效离子交换剂

高效离子交换剂指的是在中压色谱或高压色谱中使用的粒度较小而有一定的硬度，分辨率很高的一类离子交换剂，其中包含了很多种类。

Pharmacia公司的SOURCE系列离子交换剂是在聚苯乙烯一二乙烯苯的表面连接上亲水基团后再结合功能基团而形成的。聚苯乙烯一二乙烯苯的刚性结构确保了该交换剂有很高的硬度，能够承受非常高的流速，使分离时间大大缩短；亲水的表面极大地降低了蛋白质和基质之间出现疏水相互作用的可能性，非特异性吸附很低，因此蛋白质活性的回收率很高。SOURCE系有两种不同的基质粒度，15μm和30μm，分别称为SOURCE15和SOURCE30，小的粒度赋予该介质很高的分辨率。基质大而均一的孔径赋予其很大的表面积，在从小肽、寡核苷酸到大分子蛋白质的很大的分子范围内都表现出好的交换容量和分辨率。SOURCE系列交换剂所连接的功能基团主要有Q和S两种。RESC}UR;}柱出售。Pharmacia 公司已将SOURCE系列离子交换剂预装成RESOURCE柱出售。

MonoBeads系列离子交换剂是Pharmacia公司开发的又一类高效离子交换介质。其基质成分与SOURCE系列类似，也是聚苯乙烯二乙烯苯的结构连上亲水基团形成亲水表面。MonoBeads系列.的基质粒度比SOURCE系列更小，仅为10μm，并且粒径分布非常均匀，误差仅为±0.5μm，MonoBeads的名称就由此而来。高硬度、单分散性的特点使该色谱介质能够在很高的流速下使用，并且不会造成背景压力过高；小而精细的粒度赋予该色谱介质极高的效率，所有预装的MonoBeads色谱柱每米的理论塔板数都在25000左右；由于没有非特异性的吸附作用，该色谱介质对蛋白质总量和活性的回收率都很高。MonoBeads系列离子交换剂主要包括MonoQ和MonoS两种类型.它们都已制成预装柱出售。

高效离子交换剂的种类还有很多，比如Toso-Haas公司的DEAE-3-SW和CM-3-SW，它们采用的基质是二氧化硅，外面覆盖带有功能基团的亲水层；

Bio-Rad公司的DEAE-5-PW和CW-5PW，采用基质为合成高分子有机聚合物等。尽管适用于中高压色谱的高效离子交换剂种类众多，但实验表明有着相同功能基团、孔结构和颗粒尺寸的交换剂的色谱行为是非常相似的。

与常规离子交换色谱介质相比，高效色谱介质的分辨率有很大的提高，能够取得令人满意的纯化效果，其缺点是色谱介质的成本更高，处理样品的数量较小，不适合于大规模的制备。事实上，高效色谱介质一般不用于对粗提取物进行分离纯化，因为其容量十分有限并且粗提取物中大量的杂质容易污染高效色谱介质口在对粗提取物进行了初步的纯化操作，去除了大部分杂质后，高效色谱介质由于其高分辨率，在进一步纯化和最后的精制阶段是十分有用的。

6. 非孔型离子交换剂

在离子交换剂的研制过程中，人们为了获得高的有效交换容量趋向于开发大孔型的色谱介质，然而在高效液相色谱中，现在又开发出一些非孔型离子交换剂，用这类色谱介质进行色谱分离时，所有的结合都发生在颗粒的表面，由于蛋白质在流动相和固定相间的扩散距离很小，分离过程可以很快完成，又由于该色谱介质的粒度非常小，因此分辨率非常高。实际上，这类色谱介质是在牺牲了容量的前提下，可以在比网孔型介质分离速度快5~6倍的基础上获得比后者更高的分辨率。所以这类色谱介质适合于在纯化阶段的后期进行分析型或微量制备型的分离纯化。

Pharmacia公司的MiniBeads系列离子交换剂就属于这类色谱介质，其基质为非孔型亲水性聚合物，颗粒直径很小，仅为3μm，MiniBeads的名称也由此而来，并且颗粒非常均匀，具有单分散性的特点，这使得色谱介质在高流速下仍能保持较低的背景压力。MiniBeads系列的交换剂有两种：Mini Q和Mini S，Pharmacia公司将其制成预装柱Mini Q PC3.2/3和Mini S PC3.2/3后出售。

7. 其他离子交换剂

Toso-Haas公司的Toyopearl系列离子交换剂是以聚乙烯醇Toyopearl凝胶作为基质，连接上不同功能基团后形成的，目前商品化的仅有DEAE-Toyopearl 和CM-Toyopearl两种。Toyopearl为多孔型三维网状结构，含有丰富的羟基，骨架表现为高度亲水性，衍生而成的离子交换剂结构牢固，稳定性较好，pH和离子强度对体积影响不大。

Parath等人制备了兼性离子交换剂，在基质上连接如β-丙氨酸、对氨基苯磺酸、精氨酸等偶极离子，由于在兼性离子周围电场电压下降快于单位电荷，所以蛋白质从这类色谱介质上解吸更为容易。蛋白质也以兼性离子形式存在，其所带正负电荷都能与交换剂结合，而缓冲液中的阴离了、阳离子也都能与蛋白质竞争结合位点。与通常的交换剂相比，蛋白质在兼性离子交换剂上结合时将有着一定的定向形式，这与蛋白质分子表面的电荷分布又是直接相关的。因此，用通常的离子交换剂不能得到很好的分离效果时，采用兼性离子交换剂有时能取得意外的良好效果。

离子交换剂是离子交换技术的关键所在，其本身的研制和开发仍在不断进行之中，它们是推动生化分离技术不断进步的一个重要方面。

三、离子交换色谱实验技术

(一) 离子交换色谱条件的确定

离子交换色谱条件的选择主要包括离于交换剂的选择、色谱柱的尺寸、起始缓冲液的种类、pH和离子强度、洗脱缓冲液的pH和离子强度等。

1. 离子交换剂的选择

离子交换剂的种类很多，没有一种离子交换剂能够适合各种不同的分离要求，必须根据分离的实际情况，选择适合的离子交换剂，这中间包含了选择适合的基质和功能基团。选择离子交换剂主要的依据包括分离的规模、分离的模式、目标蛋白质分子人小、等电点和化学稳定性等性质。

对于分析型分离和实验室小规模制备型分离，一般采用常规的柱色谱技术；而对于大规模工业化分离，有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式可供选择。在大规模分离中采用柱色谱一般在分离的中后期，此时大多数杂质已经被除去，选用柱色谱可获得良好的分离效果，因此色谱介质的流速特性和交换容量应当作为重要参数。

为了能满足快速分离的要求，所选择的色谱介质应当能够在承受高的流速的前提下有着较低的背景压力。由于样品的数量大，高的有效交换容量是必需的，因此色谱介质应当具有大孔型的结构和较高的取代程度。此外，该色谱介质还必须能够满足原位清洗(CIP)的要求，对于大规模的色谱柱，每次分离后将色谱介质倒出清洗和再生，然后重新装柱将是难以想象的。在这类分离中，基于交联琼

脂糖的离子交换剂是比较合适的。

其次是这步离子交换在整个目标分子的纯化所处的阶段及所要求的分辨率。在预处理和初分级阶段，离子交换的目的是提取和浓缩目标分子，而在细分级和最后精制阶段，离子交换的目的应当是除去样品中混有的杂质，获得单一组分。一般来说，考察色谱操作优劣的指标包括分辨率、速度、容量和回收率，但在优化其中的某个指标时，其他指标往往会发生不利的变化，尽善尽美是达不到的，人们所追求的目标就是根据分离所处的阶段，对其中一到两个指标进行优化，其余的指标是次要的，只作一定的参考。

接着应考虑目的物的分子大小和离子交换剂的有效交换容量。离子交换剂的取代程度决定了其总交换容量，而对于某种分子的有效交换容量，还取决于这种分子是否能够达到功能基团的表面并发生结合，在此过程中基质网孔的孔径起着决定性的作用。如果目标分子不能进入离子交换剂的网孔结构，而只是与基质颗粒表面的功能基团结合，将会大大降低有效交换容量。因此，在分离分子量较大的目标分子时，需要采用孔径尺寸较大的基质，在各种离子交换剂中，基于纤维素和琼脂糖的交换剂所形成的孔径是最大的，一般目的物分子量通常都低于它们的排阻极限。在分离分子量较小的目的物时，网孔较小的色谱介质具有一定的优势，基于交联葡聚糖的交换剂属于此类。

以上考虑主要针对离子交换剂基质的选择，而在确定所选用的基质后，选择何种功能基团是另一个关键所在，这主要取决于目标分子的电性质和pH稳定性。

以蛋白质为例，在最理想的状态下，待分离样品中目标蛋白和主要杂质蛋白的等电点p I及电荷随pH的变化情况已经有所了解(可通过绘制蛋自质滴定曲线来实现)，则功能基团很容易确定。如图6.7-7所示，假定图中实线代表目标蛋白的滴定曲线，虚线代表样品中主要杂蛋白的滴定曲线，.那么可以获得如下信息：目标蛋自的p I=7.0，pH<7将带净的正电荷，而pH> 7将带净的负电荷；主要杂蛋白p I=8.2，pH<8.2将带净的正电荷，而pH>8.2将带净的负电荷；图中两条曲线在pH9.0时纵坐标(两种蛋白质的电荷)差异最大，当然pH进一步增大这种差异还可能进一步增大，但随pH的增大，蛋白质的稳定性会迅速下降，导致活性的回收率下降，而道南效应会进一步增强蛋白质的变性，所以在蛋白质的离子交

离子交换色谱

离子交换色谱 一、实验原理： 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 二、实验设计 离子交换剂；缓冲液；洗脱剂 具体操作： 1、离子交换介质的选择： 考虑目的分子的大小，目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱，目的分子稳定，选择强交换介质。 对于大多数纯化步骤来说，建议开始的时候使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。对于一个未知等电点的蛋白质，可以先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透 析至pH7.0，然后过阳离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中，说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷，可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。以此类推，直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止，也可用阳离子交换剂作类似的选择，不过要注意，pH 的改变应向减小的方向进行。 功能集团的强弱 一般情况下，在分离等电点pH为6-9的目的分子，尤其是当目的分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。 流动相(缓冲液)的选择： 离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对 pH有一定缓冲作用的溶

第七节离子交换色谱

第七节离子交换色谱 离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。 20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交 换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。 一、离子交换色谱相关理论 (一)基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换

剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。 图6.7-1 离子交换色谱原理 梯度缓冲液中的离子；极限缓冲液中的离子； 待分离的目标分子；▲需除去的杂质 1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平 衡色谱柱，以备下次使用 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 (二)基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、

离子交换层析

实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)

5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。

2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面

离子交换色谱柱和离子排阻色谱柱分离物质原理的区别

1.离子交换色谱是一种成熟的技术，柱填料含有极性可离子化的基团，如羧酸、磺酸或季铵离子，在合适的pH值下，这些基团将解离，吸引相反电荷的 物质。由于离子型物质能与柱填料反应，所以可被分离。 缓冲溶液常被用作离子交换色谱的流动相。缓冲溶液的pH值和离子强度将影响化合物从柱中的洗脱。这是由于改变pH值，可改变化合物的解离程度所致。样品电离度的降低，减少了样品与色谱柱的反应，样品组分就可以较快地从柱中流出。增加流动相的离子强度，平衡移向不利于样品与柱填料反应的方向，利于样品从柱中较快流出。 2.分子排阻色谱法是基于样品分子量大小不同而多样品进行分离的色谱法。固定相是有一定孔径的多孔填料，小分子量的化合物进入孔中，流动相是可 以溶解样品的溶剂。分离过程是按分子量大小的顺序，分子量大的化合物先从柱中洗脱。 分子排阻色谱法常用于分离高分子化合物或复杂的物质，如组织提取物、核酸、蛋白质等。 2. 1.离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含 有有机溶剂的缓冲液。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离. 2.排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。它类似于分子筛的作用， 但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。 常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。

离子交换与离子交换色谱

仲恺农业工程学院Array论文题目：离子交换与离子交换色谱 论文作者：陈维权万辉 作者学号：201111014228 201111014229 所在院系：化学化工学院 专业班级：应用化学112班 指导老师：刘展眉

离子交换与离子交换色谱 摘要 本文对离子交换与离子交换色谱技术进行了综述。简要介绍了离子交换剂的作用原理；重点系统的论述了有机离子交换技术和无机离子交换技术的研究进展。并展望了有机离子交换技术和无机离子交换技术的发展方向。 关键词 离子交换色谱离子交换剂有机离子交换无机离子交换 Abstract This article by ion-exchange chromatography and ion exchange technologies for review. Brief description of the action principle of ion exchanger; key system deals with organic and inorganic ion-exchange technology of ion-exchange technology advances. And the prospect of organic ion exchange technology and development trend of inorganic ion-exchange technology. Keywords Ion Exchange Color spectrum Ion exchanger Organic ion exchange Inorganic ion exchanger 引言 随着科学技术的发展，现代分析化学的分析对象越来越复杂，待检测组分含量越来越复杂，待检测组分含量越来越低，在地球和宇宙科学、环境科学、生命科学、材料科学以及医学和考古学中，经常要求检测μg∕g,nm∕g,pg∕g甚至更低含量的组分。目前虽然有许多灵敏度和选择性很高的仪器分析方法，但在分析实践中，常常由于存在基体效应以及其他各种干扰而难以得到准确的结果，因此在分离富集仍然是分析方法中不可缺少的重要环节。 回顾化学的发展历史便可以发现：化学的发展离不开分离富集。元素周期表中的各个元素的发现，经典的化学分离和提纯方法都曾经起着重要作用。从二十世纪开始，各种天然放射性元素的逐个发现，人工放射性元素的获得，原子核裂变现象的最终确认，几乎都离不开各种化学分离技术。今年来生命科学的许多重要成就，也都与分离科学有着紧密联系。在大多数分析实验中，对复杂物料的分析或痕量、超痕量分析一般均采用样品制备-分解-分离富集-测定-数据处理的分析流程，也就是说，分离富集是分析流程中必不可少，而且往往是相当困难而又关键的环节。从分析仪器的研制和发展趋势看，分离富集技术与测量技术紧密结合是仪器分析的必然趋势。目前最有成效的是气相色谱仪、高效液相色谱仪、离子色谱仪以及测汞仪等，它们都是集分离-

离子色谱法

一、离子色谱（IC）基本原理 离子色谱是高效液相色谱（HPLC）的一种，其分离原理也是通过流动相和固定相之间的相互作用，使流动相中的不同组分在两相中重新分配，使各组分在分离柱中的滞留时间有所区别，从而达到分离的目的。 二、离子色谱仪的结构 离子色谱仪一般由四部分组成，即输送系统、分离系统、检测系统、和数据处理系统。输送系统由淋洗液槽、输液泵、进样阀等组成；分离系统主要是指色谱柱；检测系统（如果是电导检测器）由抑制柱和电导检测器组成。 离子色谱的检测器主要有两种：一种是电化学检测器，一种是光化学检测器。电化学检测器包括电导、直流安培、脉冲安培、和积分安培；光化学检测器包括紫外－可见和荧光。电导检测器是IC的主要检测器，主要分为抑制型和非抑制型（也称为单柱型）两种。抑制器能够显著提高电导检测器的灵敏度和选择性，其发展经历了四个阶段，从最早的树脂填充的抑制器到纤维膜抑制器，平板微膜抑制器和先进的只加水的高抑制容量的电解和微膜结合的自动连续工作的抑制器。 三、离子色谱基本理论 离子色谱主要有三种分离方式：离子交换离子排斥和反相离子对。这三种分离方式的柱填料树脂骨架基本上都是苯乙烯/二乙烯苯的共聚物，但是树脂的离子交换容量各不相同，以下就主要介绍离子交换色谱的分离机理。 在离子色谱中应用最广的柱填料是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂。这类树脂的基球是用一定比例的苯乙烯和二乙烯基苯在过氧化苯酰等引发剂存在下，通过悬浮物聚合制成共聚物小珠粒。其中二乙烯基苯是交联剂，使共聚物称为体型高分子。

典型的离子交换剂由三个重要部分组成：不溶性的基质，它可以是有机的，也可以是无机的；固定的离子部位，它或者附着在基质上，或者就是基质的整体部分；与这些固定部位相结合的等量的带相反电荷离子。附着上去的集团常被称作官能团。结合上去的离子被称作对离子，当对离子与溶液中含有相同电荷的离子接触时，能够发生交换。正是后者这一性质，才给这些材料起了“离子交换剂”这个名字。 离子交换法的分离基理是离子交换，用于亲水性阴、阳离子的分离。阳离子分离柱使用薄壳型树脂，树脂基核为苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核的表面是磺化层，磺酸基以共价键与树脂基核共聚物相连；阴离子分离柱使用的填料也是苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物，核外是磺化层，它提供了一个与外界阴离子交换层以离子离子键结合的表面，磺化层外是流动均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒，这些胶乳微粒提供了树脂分离阴离子的能力，其分离基理基于流动相和固定相（树脂）阳离子位置之间的离子交换。 淋洗液中阴离子和样品中的阴离子争夺树脂上的交换位置，淋洗液中含有一定量的与树脂的离子电荷相反的平衡离子。在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是CO 32-和HCO 3-；在标准的阴离子色谱中，这种平衡离子是H +。离子交换进行的过程中，由于流动相可以连续地提供与固定相表面电荷相反的平衡离子，这种平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态，保持体系的离子电荷平衡。随着样品离子与连续离子（即淋洗离子）的交换，当样品离子与树脂上的离子成对时，样品离子由于库仑力的作用会有一个短暂的停留。不同的样品离子与树脂固定相电荷之间的库仑力（即亲和力）不同，因此，样品离子在分离柱中从上向下移动的速度也不同。样品阴离子A -与树脂的离子交换平衡可以用下式表示： 阴离子交换 A - ＋（淋洗离子）－＋NR 4-R ＝ A -+NR 4-R ＋ （淋洗离子） 对于样品中的阳离子，树脂交换平衡如下（H +为淋洗离子）： 阳离子交换 C + ＋ H +－O 3S-R ＝ C +－O 3S-R ＋ H + 在阴离子交换平衡中，如果淋洗离子是HCO 3-，可以用下式表示阴离子交换平衡： [][][][]4 33 4NH CO H A HCO NR A K + ---+-= K 是选择性系数。K 值越大，说明样品离子的保留时间越常。选择性系数是电荷、离子半径、系统淋洗液种类和树脂种类的函数。 离子半径 样品离子的价数越高，对离子交换树脂的亲和力越大。因此，在一般的情况下，保留时间随离子电荷数的增加而增加。也就是说，淋洗三价离子需要采用高离子强度的淋洗液，二价离子可以用较低浓度的淋洗液，而低于一价离子，所需淋洗液浓度更低。 离子半径

氨基酸的离子交换柱色谱分离实验教案

氨基酸的离子交换柱色谱分离 【实验目的】 1.掌握离子交换树脂分离氨基酸的基本原理； 2.掌握离子交换柱层析法的基本操作； 3.掌握氨基酸和茚三酮显色反应机理及洗脱曲线的绘制。 【实验原理】 1.离子交换层析原理 离子交换层析是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法.离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.树脂一般都制成球形的颗粒.阳离子交换树脂含有的酸性基团如磺酸基(一S03H),磷酸基(一P03H),亚磷酸基(一PO2H),羧基(一COOH),酚羟基(一OH)等,可解离出H离子,当溶液中含有其他阳离子时,例如在酸性环境中的氨基酸阳离子,它们可以和H 离子发生交换而"结合"在树脂上 本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和碱性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，由于pH低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子，吸附在树脂上；又由于pH高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。在pH12条件下，因pH高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 2.茚三酮反应机理 在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。该反应颜色产物在570nm处有最大吸收峰。 【仪器与试剂】 1.仪器： 层析柱（20cmX1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管玻璃棒烧杯等常用器材。 2.试剂：

连续离子交换

连续离子交换技术与设备 首 页 >> 技术设备 >> 连续离子交换技术与设备 连续离子交换技术和工业色谱技术是一种完全革新的分离工艺技术，不同于传统的固定床（Fixed Bed）、脉冲床（Pulse Bed）、模拟移动床（Simulated Moving Bed）等工艺。它是在传统的固定床树脂吸附和离子交换工艺的基础上结合连续逆流系统技术优势开发而成。 连续离子交换技术和工业色谱技术可用于分离、精制和回收各种工业用水及其他溶液中的特定有效物质及有害物质，此系统可使用传统的吸附剂（如离子交换树脂、活性炭及合成吸附剂等）。 两组分分离：基于两组分的速度不同而将其分离

固定床与逆流连续床比较 整个工艺循环 连续离子交换系统由一个带有多个树脂柱（16，20，30柱）的圆盘，和一个多孔分配阀组成。通过圆盘的转动和阀口的转换，使分离柱在一个工艺循环中完成了吸附，水洗，解吸，再生的全部工艺过程。且在连续离交系统中，离子分离的所有工艺步骤在同时进行。相比而言，固定床离子分离系统是在一种间歇式的工艺中一步一段时间的进行所有步骤的操作。

旋转示意流程 系统特点： 产品成分和浓度保持稳定； 由于采用多柱系统，可灵活变更生产工艺流程 全自动、程序化的操作控制，运行稳定，避免人 工操作失误 设备紧凑，易于安装在任何位置，易与旧的生产 过程和设备匹配； 可同时去除或者分离具有不同特性的物质，可将复杂的工艺简单化； 树脂用量大幅减少50-90%，洗涤水的用量最高可节约50-70%，化学药品、洗脱剂的消耗也得到相应减少，减少运行成本和设备投资； 主要应用领域 制药行业（抗生素、维生素） 精细化工和生物技术（手性物质的分离） 食品行业（糖的软化、葡萄糖的去矿化，糖浆的脱色，果葡糖浆的纯化）

离子交换色谱-

离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺 何强1, 孔祥虹1, 李建华1, 乐爱山1, 赵洁2 ( 1. 陕西出入境检验检疫局, 西安710068; 2. 西安理工大学理学院, 西安710054) 摘要: 建立离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品直接用水和乙腈提取, 分析时用LC - SCX离子交换色谱柱分离, 浓度为0.05 mol/ L磷酸二氢钾溶液( pH值为3.0) - 乙腈( 70 ∶30) 为流动相, 流速1.0 mL/min, 在紫外波长240 nm下检测。三聚氰胺在0.5 ~ 100.0 mg/ L的范围内, 质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系( r=0.9999) , 最低检出限为1.0 mg/ kg, 加标回收率在93.8 % ~102.5 %范围内, 相对标准偏差(RSD) 小于3.5 %。该方法简便、快速、准确, 能够满足检测要求。 关键词:三聚氰胺; 乳制品; 离子交换色谱 Determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatography and UV detection HE Qiang1, KONG Xiang- hong1, LI Jian- hua1, YUE Ai- shan1, ZHAO Jie2 (1. Shaanxi Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xi' an 710068, China; 2. College of Science, Xi' an Universityof Technology, Xi' an 710054, China) Abstract: A method was developed for the determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatography. Samples were extracted with water and acetonitrile. Chromatographic analysis was performed on a LC - SCX column eluted with 0.05 mol/ L KH2PO4(pH=3.0) - acetonitrile (70∶30) at a flow rate of 1.0 mL/min and UV detection at 240 nm. The present method showed good linear relationship(r = 0.9999) for melamin at the range of 0.5 ~ 100.0 mg/ L, the detection limit were 1.0 mg/ kg, the recoveries ranged from 93.8 % to102.5 % with relative tandard deviations (RSD) less than 3.5 %. The ethod is simple, fast, accurate for the melamine analysis. Key words: melamine; dairy products; ion exchange chromatography 正文： 最近美国FDA调查确认宠物食品受三聚氰胺污染是造成许多宠物非正常死亡的原因, 从而要求出口到美国的含蛋白产品必须检测三聚氰胺, 已经对我国的食品出口企业产生了较大的负面影响。三聚氰胺(melamine)简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺, 分子式为C3N6H6, 是一种重要的氮杂环有机化工原料, 具有一定的肾毒性。因为其分子中 含有大量氮元素, 而用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮”, 所以一些不法

离子交换色谱法标准操作程序

方法摘要： 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脱时，组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。 范围： 适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。职责： 操作人员： ?严格按照此规程要求进行操作。 岗位主管： ?起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新； ?监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求； ?培训，确保此操作规程的正确实施。 程序： 1术语解释 无 2试剂和材料 ?色谱柱：阳离子交换色谱柱，例如MabPac TM SCX-10，4.0×250mm，10μm（Thermo）?试剂：N-（2-乙酰胺基）-2-氨基乙磺酸（ACES，分析纯），氯化钠（NaCl，色谱纯），盐酸（HCl，分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4，色谱纯），磷酸（H3PO4，色谱纯），纯 化水（自制） ?滤膜：孔径为0.45μm或以下 注：所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用；所有材料遵循厂家有效期。3仪器设备 ?液相色谱仪：例如Agilent 1260 ?天平，精确到mg ?pH计 ?溶剂过滤装置 ?离心机（转速10000 rpm以上）

?移液器（10-1000 μl） 4溶液配制 4.1流动相配制 4.1.1流动相A：20 mM ACES，pH 6.20 称取ACES 3.64 g，加入1000 ml 水搅拌至完全溶解，HCl调pH 6.20±0.02； 经0.45 μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。 4.1.2流动相B：20 mM ACES，500 mM NaCl，pH 6.20 称取ACES 3.64 g，NaCl 29.22 g，加入1000 ml水搅拌至完全溶解，HCl调pH 6.20±0.02； 经0.45 μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。 注：流动相调pH时，确认溶液温度在23~27℃。 4.1.3色谱柱保存液：20 mM Na2HPO4/H3PO4，pH 6.5 称量2.84 g Na2HPO4，加入1000 ml纯水搅拌溶解，用H3PO4调节pH值为6.50±0.02，使用0.45 μm滤膜过滤后，2-8℃低温保存，有效期1个月。 4.2 样品溶液配制 4.2.1参比品溶液配制 取规定的参比品，根据蛋白浓度标示量，用制剂缓冲液稀释至5.0 mg/ml，转移到样品 瓶。 例：参比品CDS20180209，蛋白标示量为22.0 mg/ml，稀释4.4倍（40 μl参比品+136μl 制剂缓冲液），稀释后浓度为5.0 mg/ml。 4.2.2供试品溶液配制 稀释方法同4.2.1。 对于浑浊的样品，需经0.22 μm的滤膜过滤，或者10000 rpm离心10min，取上清液至 样品瓶。 5检测方法 5.1色谱系统准备 5.1.1打开sealwash（清洗液：10%异丙醇-水溶液）；更换洗针瓶（清洗液：水）； 5.1.2以检测方法的流动相起始比例（流动相A：4%，流动相B：96%），1.0 ml/min的流速平 衡至基线平稳，至少20min。 5.1.3关键色谱参数和洗脱梯度

连续离子交换

连续离子交换技术与设备 首页 >> 技术设备>> 连续离子交换技术与设备 连续离子交换技术和工业色谱技术是一种完全革新的分离工艺技术，不同于传统的固定床（Fixed Bed）、脉冲床（Pulse Bed）、模拟移动床（Simulated Moving Bed）等工艺。它是在传统的固定床树脂吸附和离子交换工艺的基础上结合连续逆流系统技术优势开发而成。 连续离子交换技术和工业色谱技术可用于分离、精制和回收各种工业用水及其他溶液中的特定有效物质及有害物质，此系统可使用传统的吸附剂（如离子交换树脂、活性炭及合成吸附剂等）。 两组分分离：基于两组分的速度不同而将其分离 固定床与逆流连续床比较

整个工艺循环 连续离子交换系统由一个带有多个树脂柱（16，20，30柱）的圆盘，和一个多孔分配阀组成。通过圆盘的转动和阀口的转换，使分离柱在一个工艺循环中完成了吸附，水洗，解吸，再生的全部工艺过程。且在连续离交系统中，离子分离的所有工艺步骤在同时进行。相比而言，固定床离子分离系统是在一种间歇式的工艺中一步一段时间的进行所有步骤的操作。 旋转示意流程 系统特点： 产品成分和浓度保持稳定； 由于采用多柱系统，可灵活变更生产工艺流程 全自动、程序化的操作控制，运行稳定，避免人工操作失误 设备紧凑，易于安装在任何位置，易与旧的生产过程和设备匹 配； 可同时去除或者分离具有不同特性的物质，可将复杂的工艺简单化； 树脂用量大幅减少50-90%，洗涤水的用量最高可节约50-70%，化学药品、洗脱剂的消耗也得到相应减少，减少运行成本和设备投资；

主要应用领域 制药行业（抗生素、维生素） 精细化工和生物技术（手性物质的分离） 食品行业（糖的软化、葡萄糖的去矿化，糖浆的脱色，果葡糖浆的纯化） 湿法冶金行业（金属回收） 水处理（废水处理、纯水制备） 迄今为止，三达已为国内外知名企业提供了数十套SEPTOR系统，广泛的应用于制药行业、食品行业、化学工业等，包括头孢菌素C的分离纯化、维生素C和古龙酸由盐x到酸的转化，果葡糖浆的分离，制取高果糖浆，阿米卡星的分离纯化等的生产工艺中。

氨基酸的离子交换色谱分离-上课讲稿

同学们好！下面开始上课。 今天我们的实验内容是“氨基酸的离子交换色谱分离”。大家翻到书本第69页。 我们的实验目的有三个： 1）了解层析法的概念、特点和分类； 2）复习氨基酸的理化性质； 3）掌握离子交换层析分离生物大分子的原理和方法。 今天实验题目是氨基酸的离子交换色谱分离。所以首先向同学们介绍离子交换色谱。 顾名思义，离子交换色谱，就是分离过程是基于离子交换的原理而进行的。具体来说，就是基于带相反电荷的分子的相互吸引。也就是异种电荷相互吸引、同种电荷相互排斥。所以，按照带电荷的正负，离子交换层析一般分为两种类型，一种是阳离子交换色谱，填料上结合有带负电荷的基团，可以与溶液中带正电荷的样品结合；另一种是阴离子交换色谱，填料上结合带正电荷的基团，可以与溶液中带负电荷的样品结合。那么，我们今天使用的是阳离子交换柱，就是你们桌子上的黄色填料。 离子交换色谱是利用样品的带电性质进行的分离。那么，氨基酸的带电性是怎么样的呢？这是基于氨基酸的组成。氨基酸是一种兼性离子。什么是兼性离子呢？就是在溶液中既可以带正电荷，又可以带负电荷。氨基酸包含一个氨基，可以作为氢离子的受体，这是氨基酸成为阳离子；氨基酸又带有一个羧基，可以作为氢离子的供体，这时氨基酸成为阴离子。有这个性质，引申出一个等电点的概念，也就是氨基酸所带净电荷为0的状态。在PH小于等电点时，氨基酸带负电荷，当PH大于等电点时，氨基酸带正电荷。 如何利用离子交换色谱分离两种不同的氨基酸？ 因为离子交换色谱根据“同种电荷相斥，异种电荷相吸”原理分离样品，而不同的氨基酸具有不同的等电点，它们在溶液中可能携带相反电荷。

所以，我们将溶液调到一特定pH值，让一种氨基酸携带正电荷，使之与离子柱结合；同时，让另一种氨基酸携带负电荷，使之保留在溶液中。 在我们的实验中，我们需要分离天冬氨酸与赖氨酸，天冬氨酸的等电点时2.97，赖氨酸的等电点时9.74。我们可以看到，存在三种情况： 1）pH < 2.97 ，Asp与Lys均带正电荷 2）2.97 < pH < 9.74，Asp带负电荷，Lys带正电荷 3）pH > 9.74，Asp与Lys均带负电荷 是不是只有第二种情况符合我们之前说的方案？ 因此，我们的实验基本步骤是：上样，样品液：0.005 mol/L 的Asp与Lys溶于0.02 mol/L HCl中形成的混合液（pH < 2）。1）先用pH5.3的柠檬酸缓冲液洗脱；2）pH 12 的氢氧化钠溶液洗脱。 1）平衡，向层析柱加入pH 5.3的柠檬酸缓冲液，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止，用pH试纸检查。 2）上样。降低液面至填料表面上方1 厘米左右，加入0.5毫升氨基酸混合液样品。 3）向层析柱加入pH 5.3的柠檬酸缓冲液进行洗脱。 4）用短试管收集天冬氨酸。每管5毫升，收集1-5管。 5）向层析柱加入pH 12的NaOH缓冲液进行洗脱。每管5毫升，用短试管收集6-12管。 6）测定。取0.5毫升收集液于长试管中，加入1毫升pH5.3柠檬酸缓冲液， 0.5毫升茚三酮，混合后在100℃加热25分钟，然后水冷却5-10分钟，加入3毫 升60%乙醇稀释，用分光光度计在570 nm处检测。

tosoh高性能离子交换色谱柱

No.109 TSKgel STAT系列色谱柱 —目录— 页码 1. 前言 1 2. 色谱柱的基本特点 1 2-1. 填料特点 1 2-2. 柱压 2 2-3. 标准蛋白质的分离 2 2-4. 核酸的分离 4 2-5. 样品载量 5 3. 阴离子交换色谱柱的应用实例 6 4. 阳离子交换色谱柱的应用实例10 5. 总结14

1. 前言 离子交换色谱法是一项广泛应用于生物制药、生物化学和食品工业等领域的分析技术，其可以轻松地对生物大分子样品（例如蛋白质和核酸）进行分离和定量分析。离子交换色谱包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱，前者使用带季胺或叔胺基团的填料，后者使用带磺酸或羧酸基团的填料。可以根据目标蛋白质的化学性质、空间立体构造、等电点，或者根据与杂质组分间的不同分离选择性，选择最适填料装填的离子色谱柱。核酸一般采用阴离子交换色谱柱进行分离分析。东曹离子交换色谱柱包括TSKgel 5PW系列和TSKgel NPR系列产品，前者使用一种多孔性填料，可用于实验室规模的分离和纯化工作，后者使用非多孔性填料（粒径：2.5μm），适用于高速、高分辨率和微量分析。 无论是不同粒径的TSKgel PW系列高速分析、中高压制备填料，亦或是工业生产制备用TOYOPEARL系列的中低压层析填料，其填料基质的化学组成和骨架构造都是一致的，因此实验室规模下使用TSKgel 5PW系列色谱柱优化获得的分离条件可以很容易地规模放大到生产级别。 TSKgel NPR系列色谱柱使用非多孔性填料（粒径：2.5 μm），因此尤其适用于高分辨率和高通量的分析。此外，该类色谱柱对低浓度的肽和蛋白质样品分离、分析时，亦可获得良好的回收率。 最近推出的TSKgel STAT系列色谱柱，使用非多孔性填料，能够实现在较低柱压下获得与TSKgel NPR系列色谱柱相同或更好的保留及分辨率。本报告将详细介绍TSKgel STAT系列色谱柱的基本特点和部分应用实例。 2. 色谱柱的基本特点 2-1. 填料特点 TSKgel STAT系列色谱柱包括导入了季胺基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel Q-STAT阴离子交换色谱柱和TSKgel DNA-STAT阴离子交换色谱柱，可以提供10、7和5μm 多种粒径选择；包括导入了磺酸基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel SP-STAT强阳离子交换色谱柱，可以提供10和7μm的两种粒径选择；还包括导入了羧酸基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel CM-STAT弱阳离子交换色谱柱。这些色谱柱的规格和特点详见表1。 TSKgel STAT系列色谱柱包括尺寸为3.0 mm I.D.×3.5 cm 的、设计用于进行1至2分钟内完成分析的高通量色谱柱（粒径10μm：高通量色谱分析柱）；包括尺寸为4.6 mm I.D.× 10 cm的、设计用于进行高分辨率分析的色谱柱（粒径7μm：高分辨率色谱柱）。由于该类色谱柱使用的填料基质的机械强度高，填料几乎不会因溶剂改变而发生收缩或膨胀，所以也可以使用添加了有机溶剂的洗脱条件。在洗脱液中适当添加有机溶剂，可以有效抑制高疏水性样品的吸附，从而加快洗脱速度。此外，也可以通过在洗脱液中适当添加有机溶剂，有效清洗和去除实际样品分析中吸附在色谱柱填料上的污染物质。 表1 . TSKgel STAT系列色谱柱填料特点

色谱分离方法

色谱分离方法[1] 根据分离原理还可将色谱法分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、电泳色谱、气相色谱等。利用物质吸附能力不同进行分离的称为吸附色谱，常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔吸附树脂等。利用物质在两相不互溶的溶剂中的分配比不同进行分离的称为分配色谱，常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维粉等，液滴逆流色谱（DCCC, droplet counter current chromatography）和高速逆流色谱(HSCCC , high speed counter current chromatography)则是在分配色谱与逆流分溶相结合的基础上发展而成的一种新技术。利用物质解离程度不同进行分离的称为离子交换色谱，常用的离子交换树脂有强酸型（磺酸型）、强碱型（季胺型）、弱酸型（羧酸型）、弱碱型（三级胺型）等。利用物质分子大小不同进行分离的称为凝胶色谱（亦称分子筛或排阻色谱），常用的支持剂有葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶等。利用电流通过时，离子趋电性不同进行分离的称为电泳色谱，常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳等。本书将根据其在天然药物分离工作中的重要性择要介绍。 色谱法的特点是分离效果好，对于经典方法难以得到分离的化合物采用色谱法往往可以得到满意的分离，但对于所用的吸附剂或支持剂、试剂、仪器设备等要求较高，技术操作较细致，操作周期也较长，故在工业生产中用得较少，目前主要是作为一种实验室常规分离方法用于天然药物中生物活性成分及化学成分的研究。 由于天然药物中有效成分的结构类型不同，理化性质也不同，所以选择的色谱方法也是不同的，要根据具体情况选定。 通常生物碱的分离可选用硅胶或氧化铝色谱，对于极性较强的生物碱可选用分配色谱或反相色谱，对于碱性较强的生物碱可选用离子交换色谱，对于水溶性生物碱如季胺型生物碱、氮氧化物生物碱等也可选用分配色谱或离子交换色谱。 苷类化合物的色谱分离与苷元的性质有关，对于水溶性较大的苷如皂苷、强心苷等通常采用分配色谱或反相色谱分离，对于水溶性较小的苷则可采用吸附色谱分离。 挥发油、甾体、萜类、萜类内酯（成苷者除外）等往往首选硅胶及氧化铝色谱，若在氧化铝色谱上有次级反应，则宜用硅胶吸附色谱分离。 黄酮类、醌类等含有酚羟基的化合物则可采用聚酰胺色谱进行分离。 有机酸、氨基酸等含有羧基或氨基类的化合物通常可选用离子交换色谱进行分离，有时也可用分配色谱进行分离。氨基酸类化合物还可采用活性炭色谱进行分离。 对于大分子化合物如多肽、多聚糖、蛋白质以及极性较大的化合物则通常采用凝胶色谱进行分离。 第一节硅胶柱色谱 硅胶色谱是最常用的色谱方法，适用于亲脂性成分的分离，广泛用于萜类、甾体、强心苷、苯丙素、黄酮、醌类、生物碱等类化合物的分离。它具有价廉、分离效果好、再生容易、适用范围广、不易与有机酸、酚类以及色素等类化合物形成不可逆吸附，样品损失较少、回收率较高、副反应较少等优点。但与氧化铝色谱相比，具有分离效果较差、样品处理量较少、对杂质的吸附能力较差等缺点。 二．硅胶吸附色谱 （一）．色谱柱的选择 有多种多样的色谱柱可供选择（见图2-1）。下端带有玻璃塞的或不带有玻璃塞的以及带有垂熔筛板的均可选用。吸附色谱所用的洗脱剂均为有机溶剂，因有机溶剂可溶解在玻璃塞上起润滑和密封作用的凡士林，故对玻璃塞的密封和润滑需要用淀粉甘油糊，而不能用凡士林。在用不带有玻璃塞的色谱柱时，含氯的溶剂如氯仿、二氯甲烷等对胶管的腐蚀很大，

离子交换色谱柱使用说明

XB-SCX色谱柱使用说明 发布日期：2011-08-23 一. Ultimate? XB-SCX强阳离子交换柱说明： 基质：超高纯全多孔球形硅胶； 填料：硅胶基质上键合有苯基磺酸基（－C6H4－SO3－）； pH范围：使用范围为2.0~6.5； 最大使用压力：40Mpa（即6000psi）； 最高使用温度：80℃； 色谱柱内保存溶液：100％甲醇； 色谱柱两端筛板孔径均为2um，色谱柱可以反向冲洗。 二. Ultimate? XB-SCX色谱柱的使用特性： 1. 常用于分离在水溶液中呈阳离子态的化合物； 2. Ultimate? XB-SCX色谱柱能与水和有机溶剂兼容，可用甲醇、乙腈和水（包括缓冲盐溶液）作流动相进行分析； 3. 阳离子化合物的保留能力与流动相的pH、离子强度、流动相中有机相的比例以及温度有关。通常离子强度越大保留时间越短，流动相中有机相的比例越大保留时间越长； 4. 柠檬酸盐和磷酸盐等缓冲盐通常用于调整流动相的pH和离子强度以改善分离度。流动相的pH应该维持在pH 2.0~6.5； 5. 阳离子柱的平衡时间相对C18而言较长。 三. Ultimate? XB-SCX色谱柱的维护 1. 流动相抽滤过0.45um滤膜，样品针筒过滤； 2. 使用之前，先用过渡流动相以1.0ml/min过渡30min，然后用流动相走基线，基线平稳后进样；使用之后，先用100mmol/L的NaClO4 溶液（调节pH<4）以1.0ml/min反向冲洗色谱柱40min；然后用水反向冲洗30min，再用甲醇反向冲洗40min，最后保存在纯甲醇中；过渡流动相是指：有机相和水相比例与流动相相同，只是过渡流动相不含缓冲盐； 3. 建议： 1）用保护柱和预柱以延长色谱柱的使用寿命； 2）使用一段时间（约一周）后需用纯甲醇（或乙腈）以1.0ml/min反向冲洗色谱柱90min，冲洗过程中注意过渡，防止缓冲盐析出。 四. Ultimate? XB-SCX色谱柱的保存 1. 长期保存：保存在纯甲醇（或乙腈）中。用纯甲醇（或乙腈）保存之前需确保色谱柱内不含缓冲盐； 2. 短期保存（一、两天）：保存在与流动相的比例相同但不含缓冲盐的过渡流动相中。如果流动相中不含有机相或有机相过低，则保存在甲醇（或乙腈）：水＝75：25中。 XB-SAX色谱柱使用说明 发布日期：2011-08-23