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色谱法分离原理word版

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色谱法分离原理

一.教学内容

1.色谱分离的基本原理和基本概念

2.色谱分离的理论基础

3.色谱定性和定量分析的方法

二.重点与难点

1.塔板理论,包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数(n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算

2.速率理论方程

3.分离度和基本分离方程

三.教学要求

1.熟练掌握色谱分离方法的原理

2.掌握色谱流出曲线(色谱峰)所代表的各种技术参数的准确含义

3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素

4.学会各种定性和定量的分析方法

四.学时安排4学时

第一节概述

色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。

在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相;自上而下运动的一相(一般是气体或液体)称为流动相;装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。

从不同角度,可将色谱法分类如下:

1.按两相状态分类

气体为流动相的色谱称为气相色谱(G C)

根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的

一薄层有机化合物液体),又可分为气固色谱(G S C)和气液色谱(G L C)。液体为流动相的色谱称液相色谱(L C)

同理液相色谱亦可分为液固色谱(L S C)和液液色谱(L L C)。

超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱(S F C)。随着色谱

工作的发展,通过化学反应将固定液键合到载体表面,这种化学键

合固定相的色谱又称化学键合相色谱(C B P C).

2.按分离机理分类

利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法,称为吸附色谱法。

利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。

利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法,称为离子交换色谱法。

利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的

方法,称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。

最近,又有一种新分离技术,利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法,常用于蛋白质的分离。

3.按固定相的外型分类

固定相装于柱内的色谱法,称为柱色谱。

固定相呈平板状的色谱,称为平板色谱,它又可分为薄层色谱和纸色谱。

4.按照展开程序分类

按照展开程序的不同,可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和

迎头法。洗脱法也称冲洗法。工作时,首先将样品加到色谱柱头上,

然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。

由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同.被冲洗剂带出的先

后次序也不同,从而使组分彼此分离。

这种方法能使样品的各组分获得良好的分离,色谱峰清晰。此外,除去冲洗剂后,可获得纯度较高的物质。目前,这种方法是色谱法中最常用的一种方法。

顶替法是将样品加到色谱柱头后,在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂(或直接用顶替剂作流动相),通过色谱柱,将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序,依次顶替出固定相。很明显,吸附或溶解能力最弱的组分最先流出,最强的最后流出。

此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分;其缺点是经一次使用后,柱子就被样品或顶替剂饱和,必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后,才能再使用。

迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱,吸附或溶解能力最弱的组分首先一纯物质的状态流出,其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物,以此类推。该法在分离多组分混合物时,除第一组分外,其余均非纯态,因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分(组分A),而不适用于对混合物进行分离。

第二节色谱流出曲线及有关术语

(一)色谱流出曲线和色谱峰

由检测器输出的电信号强度对时间作图,所得曲线称为色谱

流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。

如果进样量很小,浓度很低,在吸附等温线(气固吸附色谱)或分配等温线(气液分配色谱)的线性范围内,则色谱峰是对称的。(二)基线

在实验操作条件下,色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲

线称为基线,稳定的基线应该是一条水平直线。

(三)峰高

色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以(h)表示。

基线(a)

峰高(h)

(四)保留值

1.死时间t0

不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时,从进样到出现峰

极大值所需的时间称为死时间,它正比于色谱柱的空隙体积,

因为这种物质不被固定相吸附或溶解,故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时,可用柱长L与t0的比值计算,即

ū=L/t0

2.保留时间t r

试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间,称为保留时

3.调整保留时间t r′

某组分的保留时间扣除死时间后,称为该组分的调整保留时间,

即t r′=t r-t0

由于组分在色谱柱中的保留时间t r包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间,所以t r实际上是组分在固定相中保留的总时间。

保留时间是色谱法定性的基本依据,但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响,因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。

4.死体积V0

指色谱柱在填充后,柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色

谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相

很小可忽略不计时,死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速F c o

(c m3·m i n-1)计算。

V0=t0F c o

式中F c o为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。仅适用于气相色谱,不适用于液相色谱。

5.保留体积V r

指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过

的流动相的体积。保留时间与保留体积关系:

V r=t r F c o

6.调整保留体积V r¢

某组分的保留体积扣除死体积后,称为该组分的调整保留体积。

V r¢=V r-V0=t r¢F c o

7.相对保留值r2,1

某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比,称为相对保留值。

r2,1=t r2¢/t r1′=V r2¢/V r1¢

由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,因此,它在色谱法中,特别是在

气相色谱法中,广泛用作定性的依据。在定性分析中,通常固定一

个色谱峰作为标准(s),然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值,此时可用符号a表示,即

a=t r¢(i)/t r¢(s)

式中t r¢(i)为后出峰的调整保留时间,所以a总是大于1的。

相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标,又称选择因子。

(五)区域宽度

色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一,用于衡

量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度

通常有三种方法。

1.标准偏差s

即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。

2.半峰宽W1/2

即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为

W1/2=2.354s

3.峰底宽度W

即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏

差s的关系是W=4s

从色谱流出曲线中,可得许多重要信息:

(i)根据色谱峰的个数,可以判断样品中所含组分的最少个数;

(i i)根据色谱峰的保留值,可以进行定性分析;

(i i i)根据色谱峰的面积或峰高,可以进行定量分析;

(i v)色谱峰的保留值及其区域宽度,是评价色谱柱分离效能的依据;

(v)色谱峰两峰间的距离,是评价固定相(或流动相)选择是否合适的依据。

色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离,组分要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色谱过程的热力学性质有关。

第三节色谱法基本原理

(一)分配系数K和分配比k

1.分配系数K

分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程,而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述,而描述这种分配的参数称为分配系数K。

它是指在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值,即

K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度= C s/C m

分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的,它是每一个溶质的特征值,它仅与两个变量有关:固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。

2.分配比k

分配比又称容量因子,它是指在一定温度和压力下,组分在两相间分配达平衡时,分配在固定相和流动相中的质量比。即

k=组分在固定相中的质量/组分在流动相中的质量=m s/m m

k值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量大,因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化,而且还与流动相及固定相的体积有关。

k=m s/m m=C s V S/C m V m

式中c s,c m分别为组分在固定相和流动相的浓度;V m为柱中流动相的体积,近似等于死体积。V s为柱中固定相的体积,在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。

例如:在分配色谱中,V s表示固定液的体积;在尺寸排阻色谱中,则表示固定相的孔体积。

分配比k值可直接从色谱图中测得(推导过程教材P.296~297)。

k=(t r–t0)/t0=t¢r/t0=V¢r/V0

4.分配系数K与分配比k的关系

K=k .b

其中β称为相比率,它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如,对填充柱,其β值一般为6~35;对毛细管柱,其β值为60~600。

4.分配系数K及分配比k与选择因子α的关系

对A、B两组分的选择因子,用下式表示:

α= t¢r (B) / t¢r (A) =k(A)/k(B)=K(A)/ K (B)

通过选择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来,α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k 值相等,则α=1,两个组分的色谱峰必将重合,说明分不开。两组分的K或k值相差越大,则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。

图中K A>K B,因此,A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加,两峰间的距离逐渐变大,同时,每一组分的浓度轮廓(即区域宽度)也慢慢变宽。显然,区域扩宽对分离是不利的,但又是不可避免的。若要使A、B组分完全分离,必须满足以下三点:

第一,两组分的分配系数必须有差异;

第二,区域扩宽的速率应小于区域分离的速度;

第三,在保证快速分离的前提下,提供足够长的色谱柱。

第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论,它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率,而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提,故称为线性色谱理论。

(二)塔板理论

把色谱柱比作一个精馏塔,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为,同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标,即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用H表示,称为塔板高度,简称板高。

塔板理论假设:

1.在柱内一小段长度H内,组分可以在两相间迅速达到平衡。这

一小段柱长称为理论塔板高度H。

2.以气相色谱为例,载气进入色谱柱不是连续进行的,而是脉动式,

每次进气为一个塔板体积(ΔV m)。

3.所有组分开始时存在于第0号塔板上,而且试样沿轴(纵)向扩

散可忽略。

4.分配系数在所有塔板上是常数,与组分在某一塔板上的量无关。

简单地认为:在每一块塔板上,溶质在两相间很快达到分配平衡,然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱,溶质平衡的次数应为:

n=L/H

n称为理论塔板数。与精馏塔一样,色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加,随板高H的增大而减小。

塔板理论指出:

第一,当溶质在柱中的平衡次数,即理论塔板数n大于50时,可得到基本对称的峰形曲线。在色谱柱中,n值一般很大,如气相色谱柱的n约为103 ~ 106,因而这时的流出曲线可趋近于正态分布曲线。

第二,当样品进入色谱柱后,只要各组分在两相间的分配系数有微小差异,经过反复多次的分配平衡后,仍可获得良好的分离。

第三,n与半峰宽及峰底宽的关系式为:

n= 5.54(t r/W1/2)2=16(t r/W)2

式中t r与W1/2( W )应采用同一单位(时间或距离)。从公式可以看出,在t r一定时,如果色谱峰很窄,则说明n越大,H越小,柱效能越高。

在实际工作中,由公式n = L / H和n = 5.54(t r / W1/2)2 =16(t r/W)2

计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能,因为采用t R计算时,没有扣除死时间t M,所以常用有效塔板数n有效

表示柱效:

n有效= 5.54(t r¢/W1/2)2=16(t r¢/W)2

有效板高:H有效=L/n有效

因为在相同的色谱条件下,对不同的物质计算的塔板数不一样,因此,在说明柱效时,除注明色谱条件外,还应指出用什么物质进行测量。

例已知某组分峰的峰底宽为40s,保留时间为400s,计算此色谱柱的理论塔板数。

解:n=16(t R/W)2=16′(400/40)2=1600块

塔板理论是一种半经验性理论。它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率,解释了流出曲线的形状,并提出了计算和评价柱效高低的参数。但是,色谱过程不仅受热力学因素的影响,而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关,因此塔板理论只能定性地给出板高的概念,却不能解释板高受哪些因素影响;也不能说明为什么在不同的流速下,可以测得不同的理论塔板数,因而限制了它的应用。

(三)速率理论

1956年荷兰学者v a n D e e m t e r(范第姆特)等在研究气液色谱时,提出了色谱过程动力学理论——速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念,并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程,从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。v a n D e e m t e r方程的数学简化式为

H=A+B/u+C u

式中u为流动相的线速度;A、B、C、为常数,分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。

第三节色谱法基本原理

1.涡流扩散项A

在填充色谱柱中,当组分随流动相向柱出口迁移时,流动相由于受到固定相颗粒障碍,不断改变流动方向,使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动,故称涡流扩散。

由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性,使组分在色谱

柱中路径长短不一,因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并

不一致,引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定:

A=2λd p

上式表明,A与填充物的平均直径d p的大小和填充不规则因子λ有关,与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散,提高柱效,使用细而均匀的颗粒,并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管,不存在涡流扩散。因此A=0。

2.分子扩散项B/u(纵向扩散项)

纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入,其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进,由于存在浓度梯度,“塞子”必然自发的向前和向后扩散,造成谱带展宽。分子扩散项系数为B=2γD g

γ是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素,也称弯曲因子,它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。

D g为组分在流动相中扩散系数(c m3·s-1),分子扩散项与组分在流动相中扩散系数D g成正比.

D g与流动相及组分性质有关:

(a)相对分子质量大的组分D g小,D g反比于流动相相对分子质量的平方根,所以采用相对分子质量较大的流动相,可使B项降低;

(b)D g随柱温增高而增加,但反比于柱压。

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