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离子交换色谱分离质粒DNA的比较

离子交换色谱分离质粒DNA的比较
离子交换色谱分离质粒DNA的比较

离子交换色谱分离质粒DNA的比较

离子交换色谱

离子交换色谱 一、实验原理: 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 离子交换层析是用离子交换剂作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来。 二、实验设计 离子交换剂;缓冲液;洗脱剂 具体操作: 1、离子交换介质的选择: 考虑目的分子的大小,目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团;功能集团的强弱,目的分子稳定,选择强交换介质。 对于大多数纯化步骤来说,建议开始的时候使用强离子交换柱,可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质,可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂,使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷,可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂,缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷,可与阳离子交换剂结合。对于一个未知等电点的蛋白质,可以先选择一个阴离子交换剂,再选择一个中性的pH缓冲液,将蛋白质样品透 析至pH7.0,然后过阳离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中,说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷,可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0,然后再过阴离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。以此类推,直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止,也可用阳离子交换剂作类似的选择,不过要注意,pH 的改变应向减小的方向进行。 功能集团的强弱 一般情况下,在分离等电点pH为6-9的目的分子,尤其是当目的分子不稳定时,需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。 流动相(缓冲液)的选择: 离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对 pH有一定缓冲作用的溶

离子交换柱层析原理

离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程,主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析(Ion Exchange Chromatography 简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法,广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理: 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法,也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离,具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前,在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质: 离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可

第七节离子交换色谱

第七节离子交换色谱 离子交换色谱(ion-exchange chromatography,IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义,基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离,因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小,蛋白质分子无法进颗粒内部,只能吸附在表面,造成有效交换容量很小;②树脂表面电荷密度过大,使蛋白质在其上吸附得过于牢固,必须用较极端的条件才能洗脱,而这样的条件往往易造成蛋白质变性;③树脂的骨架具疏水性,一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用,也容易造成蛋白质变性失活。 20世纪50年代中期,Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-)纤维素和二乙氨乙基(DEAE-)纤维素,这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力,而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交 换容量,而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱,因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后,多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成,包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等,以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷,极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。 一、离子交换色谱相关理论 (一)基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换

剂带相反电荷因而能够与之竞争结合,而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同,表现出与离子交换剂在结合强度上的差异,在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。 图6.7-1 离子交换色谱原理 梯度缓冲液中的离子;极限缓冲液中的离子; 待分离的目标分子;▲需除去的杂质 1- 上样阶段,此时离子交换剂与平衡离子结合;2- 吸附阶段,混合样品中的分子与离子交换剂结合;3- 开始解吸阶段,杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱,目标分子仍处于吸附状态;4- 完全解吸阶段,目标分子被洗脱;5- 再生阶段,用起始缓冲液重新平 衡色谱柱,以备下次使用 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化,即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换,带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 (二)基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成,在水溶液中,与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、

离子交换层析

实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 (二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 )为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85 ~7.5 ),其余均属酸性蛋白。pH7.2 ~7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附,只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)

5.0.02 %NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 .DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 (下称A-50 )5g ,悬于500ml 蒸馏水内,1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例,将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中,搅匀,静置30min ,装入布氏漏斗(垫有 2 层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性;再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理,最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次,处理完后,将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。

2 .装柱 ( 1 )将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 (2 )将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ~3cm 高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min ,同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 ( 3 )关闭出水口,待A-50 凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 .平衡启开出水口螺旋夹,控制流速 4 滴/min ,使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。 4 .加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(0.5ml 血清,体积应小于床体积的2% ,蛋白浓度以<100mg 为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内,至与柱面

离子交换色谱柱和离子排阻色谱柱分离物质原理的区别

1.离子交换色谱是一种成熟的技术,柱填料含有极性可离子化的基团,如羧酸、磺酸或季铵离子,在合适的pH值下,这些基团将解离,吸引相反电荷的 物质。由于离子型物质能与柱填料反应,所以可被分离。 缓冲溶液常被用作离子交换色谱的流动相。缓冲溶液的pH值和离子强度将影响化合物从柱中的洗脱。这是由于改变pH值,可改变化合物的解离程度所致。样品电离度的降低,减少了样品与色谱柱的反应,样品组分就可以较快地从柱中流出。增加流动相的离子强度,平衡移向不利于样品与柱填料反应的方向,利于样品从柱中较快流出。 2.分子排阻色谱法是基于样品分子量大小不同而多样品进行分离的色谱法。固定相是有一定孔径的多孔填料,小分子量的化合物进入孔中,流动相是可 以溶解样品的溶剂。分离过程是按分子量大小的顺序,分子量大的化合物先从柱中洗脱。 分子排阻色谱法常用于分离高分子化合物或复杂的物质,如组织提取物、核酸、蛋白质等。 2. 1.离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂,流动相一般为水或含 有有机溶剂的缓冲液。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离. 2.排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱,是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同,以使组分分离。它类似于分子筛的作用, 但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后,随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,因此就直接通过柱子,首先在色谱图上出现,一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中,这些组分在柱上的保留值最大,在色谱图上最后出现。 常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,可根据载体和试样的性质,选用水或有机溶剂为流动相。

离子交换与离子交换色谱

仲恺农业工程学院Array论文题目:离子交换与离子交换色谱 论文作者:陈维权万辉 作者学号:201111014228 201111014229 所在院系:化学化工学院 专业班级:应用化学112班 指导老师:刘展眉

离子交换与离子交换色谱 摘要 本文对离子交换与离子交换色谱技术进行了综述。简要介绍了离子交换剂的作用原理;重点系统的论述了有机离子交换技术和无机离子交换技术的研究进展。并展望了有机离子交换技术和无机离子交换技术的发展方向。 关键词 离子交换色谱离子交换剂有机离子交换无机离子交换 Abstract This article by ion-exchange chromatography and ion exchange technologies for review. Brief description of the action principle of ion exchanger; key system deals with organic and inorganic ion-exchange technology of ion-exchange technology advances. And the prospect of organic ion exchange technology and development trend of inorganic ion-exchange technology. Keywords Ion Exchange Color spectrum Ion exchanger Organic ion exchange Inorganic ion exchanger 引言 随着科学技术的发展,现代分析化学的分析对象越来越复杂,待检测组分含量越来越复杂,待检测组分含量越来越低,在地球和宇宙科学、环境科学、生命科学、材料科学以及医学和考古学中,经常要求检测μg∕g,nm∕g,pg∕g甚至更低含量的组分。目前虽然有许多灵敏度和选择性很高的仪器分析方法,但在分析实践中,常常由于存在基体效应以及其他各种干扰而难以得到准确的结果,因此在分离富集仍然是分析方法中不可缺少的重要环节。 回顾化学的发展历史便可以发现:化学的发展离不开分离富集。元素周期表中的各个元素的发现,经典的化学分离和提纯方法都曾经起着重要作用。从二十世纪开始,各种天然放射性元素的逐个发现,人工放射性元素的获得,原子核裂变现象的最终确认,几乎都离不开各种化学分离技术。今年来生命科学的许多重要成就,也都与分离科学有着紧密联系。在大多数分析实验中,对复杂物料的分析或痕量、超痕量分析一般均采用样品制备-分解-分离富集-测定-数据处理的分析流程,也就是说,分离富集是分析流程中必不可少,而且往往是相当困难而又关键的环节。从分析仪器的研制和发展趋势看,分离富集技术与测量技术紧密结合是仪器分析的必然趋势。目前最有成效的是气相色谱仪、高效液相色谱仪、离子色谱仪以及测汞仪等,它们都是集分离-

离子色谱法

一、离子色谱(IC)基本原理 离子色谱是高效液相色谱(HPLC)的一种,其分离原理也是通过流动相和固定相之间的相互作用,使流动相中的不同组分在两相中重新分配,使各组分在分离柱中的滞留时间有所区别,从而达到分离的目的。 二、离子色谱仪的结构 离子色谱仪一般由四部分组成,即输送系统、分离系统、检测系统、和数据处理系统。输送系统由淋洗液槽、输液泵、进样阀等组成;分离系统主要是指色谱柱;检测系统(如果是电导检测器)由抑制柱和电导检测器组成。 离子色谱的检测器主要有两种:一种是电化学检测器,一种是光化学检测器。电化学检测器包括电导、直流安培、脉冲安培、和积分安培;光化学检测器包括紫外-可见和荧光。电导检测器是IC的主要检测器,主要分为抑制型和非抑制型(也称为单柱型)两种。抑制器能够显著提高电导检测器的灵敏度和选择性,其发展经历了四个阶段,从最早的树脂填充的抑制器到纤维膜抑制器,平板微膜抑制器和先进的只加水的高抑制容量的电解和微膜结合的自动连续工作的抑制器。 三、离子色谱基本理论 离子色谱主要有三种分离方式:离子交换离子排斥和反相离子对。这三种分离方式的柱填料树脂骨架基本上都是苯乙烯/二乙烯苯的共聚物,但是树脂的离子交换容量各不相同,以下就主要介绍离子交换色谱的分离机理。 在离子色谱中应用最广的柱填料是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂。这类树脂的基球是用一定比例的苯乙烯和二乙烯基苯在过氧化苯酰等引发剂存在下,通过悬浮物聚合制成共聚物小珠粒。其中二乙烯基苯是交联剂,使共聚物称为体型高分子。

典型的离子交换剂由三个重要部分组成:不溶性的基质,它可以是有机的,也可以是无机的;固定的离子部位,它或者附着在基质上,或者就是基质的整体部分;与这些固定部位相结合的等量的带相反电荷离子。附着上去的集团常被称作官能团。结合上去的离子被称作对离子,当对离子与溶液中含有相同电荷的离子接触时,能够发生交换。正是后者这一性质,才给这些材料起了“离子交换剂”这个名字。 离子交换法的分离基理是离子交换,用于亲水性阴、阳离子的分离。阳离子分离柱使用薄壳型树脂,树脂基核为苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物,核的表面是磺化层,磺酸基以共价键与树脂基核共聚物相连;阴离子分离柱使用的填料也是苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物,核外是磺化层,它提供了一个与外界阴离子交换层以离子离子键结合的表面,磺化层外是流动均匀的单层季铵化阴离子胶乳微粒,这些胶乳微粒提供了树脂分离阴离子的能力,其分离基理基于流动相和固定相(树脂)阳离子位置之间的离子交换。 淋洗液中阴离子和样品中的阴离子争夺树脂上的交换位置,淋洗液中含有一定量的与树脂的离子电荷相反的平衡离子。在标准的阴离子色谱中,这种平衡离子是CO 32-和HCO 3-;在标准的阴离子色谱中,这种平衡离子是H +。离子交换进行的过程中,由于流动相可以连续地提供与固定相表面电荷相反的平衡离子,这种平衡离子与树脂以离子对的形式处于平衡状态,保持体系的离子电荷平衡。随着样品离子与连续离子(即淋洗离子)的交换,当样品离子与树脂上的离子成对时,样品离子由于库仑力的作用会有一个短暂的停留。不同的样品离子与树脂固定相电荷之间的库仑力(即亲和力)不同,因此,样品离子在分离柱中从上向下移动的速度也不同。样品阴离子A -与树脂的离子交换平衡可以用下式表示: 阴离子交换 A - +(淋洗离子)-+NR 4-R = A -+NR 4-R + (淋洗离子) 对于样品中的阳离子,树脂交换平衡如下(H +为淋洗离子): 阳离子交换 C + + H +-O 3S-R = C +-O 3S-R + H + 在阴离子交换平衡中,如果淋洗离子是HCO 3-,可以用下式表示阴离子交换平衡: [][][][]4 33 4NH CO H A HCO NR A K + ---+-= K 是选择性系数。K 值越大,说明样品离子的保留时间越常。选择性系数是电荷、离子半径、系统淋洗液种类和树脂种类的函数。 离子半径 样品离子的价数越高,对离子交换树脂的亲和力越大。因此,在一般的情况下,保留时间随离子电荷数的增加而增加。也就是说,淋洗三价离子需要采用高离子强度的淋洗液,二价离子可以用较低浓度的淋洗液,而低于一价离子,所需淋洗液浓度更低。 离子半径

氨基酸的离子交换柱色谱分离实验教案

氨基酸的离子交换柱色谱分离 【实验目的】 1.掌握离子交换树脂分离氨基酸的基本原理; 2.掌握离子交换柱层析法的基本操作; 3.掌握氨基酸和茚三酮显色反应机理及洗脱曲线的绘制。 【实验原理】 1.离子交换层析原理 离子交换层析是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法.离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.树脂一般都制成球形的颗粒.阳离子交换树脂含有的酸性基团如磺酸基(一S03H),磷酸基(一P03H),亚磷酸基(一PO2H),羧基(一COOH),酚羟基(一OH)等,可解离出H离子,当溶液中含有其他阳离子时,例如在酸性环境中的氨基酸阳离子,它们可以和H 离子发生交换而"结合"在树脂上 本实验采用磺酸型阳子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和碱性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下,由于pH低于Lys的pI值,Lys可解离成阳离子,吸附在树脂上;又由于pH高于Asp的pI值,则Asp可解离为阴离子,不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。在pH12条件下,因pH高于Lys的pI值,Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来,这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 2.茚三酮反应机理 在弱酸条件下(pH5-7),蛋白质或氨基酸与茚三酮共热,可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。该反应颜色产物在570nm处有最大吸收峰。 【仪器与试剂】 1.仪器: 层析柱(20cmX1cm);铁架台;恒流泵;部分收集器;分光光度计;移液枪;恒温水浴锅;试管玻璃棒烧杯等常用器材。 2.试剂:

连续离子交换

连续离子交换技术与设备 首 页 >> 技术设备 >> 连续离子交换技术与设备 连续离子交换技术和工业色谱技术是一种完全革新的分离工艺技术,不同于传统的固定床(Fixed Bed)、脉冲床(Pulse Bed)、模拟移动床(Simulated Moving Bed)等工艺。它是在传统的固定床树脂吸附和离子交换工艺的基础上结合连续逆流系统技术优势开发而成。 连续离子交换技术和工业色谱技术可用于分离、精制和回收各种工业用水及其他溶液中的特定有效物质及有害物质,此系统可使用传统的吸附剂(如离子交换树脂、活性炭及合成吸附剂等)。 两组分分离:基于两组分的速度不同而将其分离

固定床与逆流连续床比较 整个工艺循环 连续离子交换系统由一个带有多个树脂柱(16,20,30柱)的圆盘,和一个多孔分配阀组成。通过圆盘的转动和阀口的转换,使分离柱在一个工艺循环中完成了吸附,水洗,解吸,再生的全部工艺过程。且在连续离交系统中,离子分离的所有工艺步骤在同时进行。相比而言,固定床离子分离系统是在一种间歇式的工艺中一步一段时间的进行所有步骤的操作。

旋转示意流程 系统特点: 产品成分和浓度保持稳定; 由于采用多柱系统,可灵活变更生产工艺流程 全自动、程序化的操作控制,运行稳定,避免人 工操作失误 设备紧凑,易于安装在任何位置,易与旧的生产 过程和设备匹配; 可同时去除或者分离具有不同特性的物质,可将复杂的工艺简单化; 树脂用量大幅减少50-90%,洗涤水的用量最高可节约50-70%,化学药品、洗脱剂的消耗也得到相应减少,减少运行成本和设备投资; 主要应用领域 制药行业(抗生素、维生素) 精细化工和生物技术(手性物质的分离) 食品行业(糖的软化、葡萄糖的去矿化,糖浆的脱色,果葡糖浆的纯化)

实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离

实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离 【原理】 本实验采用磺酸型阳子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下,因为低于Lys的pI值,Lys可解离成阳离子挂在树脂上;高于Asp的pI值,则Asp可解离为阴离子,不能被树脂吸附而直接流出色谱柱,在pH 12条件下,因高于Lys的pI值,Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来,这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 【操作】 1、树脂的处理 关于市售新树脂的处理见注1,关于树脂浮洗的方法参照讲义所述,本实验采用处理好的树脂。 2、装柱:将色谱柱垂直装好,关闭柱底出口,在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。 将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中,加进1~2倍体积的柠檬酸缓冲液,经抽气处理后,搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满,倒时不要太快,以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2~3cm高时,用吸管吸去柱内上层所出现的清液,慢慢打开柱底出口,继续加注树脂悬液,直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败,另外树脂悬液的温度要相对恒定(特别是对于采用高温法)。装好的柱体应该没有纹路,没有裂痕,没有气泡和柱顶表面平整而均匀,这样方可投入使用,否则要重装。 3、平衡:柱装好后接上预先调好的恒流泵,用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡,直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止(pH试纸检查),这大约需要2~3倍床体积。 4、加样与洗脱:移去柱上的液器塞,打开柱底出口,小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中,加样时不要过快,以免冲坏树脂表面,加样后慢慢打开柱底阀,使液面再与树脂面相齐时关闭,然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1~2次。洗涤后,用缓冲液在柱内加到约2cm 高的液层,然后接上恒流泵,调流速0.5ml/分即开始洗脱。 注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡,并且在调节时不要过猛,以免影响色谱行为。 5、收集:柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。 6、改换高pH洗脱收集:关闭恒流泵及柱底阀,将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液,然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。 7、测定:(注2)将收集的各管编号后,分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中,加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液,0.5ml茚三酮试剂,混合后在100℃水浴上加热25分钟。然后水冷却5~10分钟,加3m160%乙醇衡稀释,摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。测定后,以光密度为纵坐标,收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。 8、再生,对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱,再用蒸馏水洗至中性后重复使用。 注:1、对于市售的干树脂其处理方法为:先经水充分溶胀后,倾去上面的泥状细粒,

离子交换柱交换层析法分离氨基酸知识讲解

离子交换柱交换层析法分离氨基酸

离子交换柱层析法分离氨基酸 一、实验原理 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力(静电引力)而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂,流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。 树脂(惰性支持物)上结合了阳离子或阴离子后,可与阴离子或阳离子结合,改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同,故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出,达到分离的目的。带电荷量少,与交换剂亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量大,与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。 本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂,分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下,Asp和Lys的带电情况不同,与磺酸集团的亲和力不同,因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后,测定吸光度,从而得到洗脱曲线。 二、实验器材 实验仪器:层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂:Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液(pH5.3)、 0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品(0.005mol/L的Asp和Lys,用 0.02mol/L的HCl配制) 三、实验操作记录 1、树脂的处理

干树脂经蒸馏水膨胀,倾去细小颗粒,然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗,每次浸2h,并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小时(转型),用蒸馏水洗至中性。 2、装柱前的准备 选择直径1cm,长度15~20cm的层析柱,观察柱底端滤膜是否完好,分别用流水和蒸馏水冲洗干净。 将层析柱垂直装在铁架台上,柱进水口和出水口装上橡皮管,关闭柱底端出口,在柱内注入少许(约1cm高)的洗脱液,打开出水口,排净管内空气后关闭出水口。 3、装柱 向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液,用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状,然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快,以免产生泡沫和气泡。 待树脂在柱底部有明显沉积(约1cm高)后,缓慢打开出口(或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液),继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续,均匀,无文格、无气泡,表面平整,液面不得低于树脂表面,否则要重新装柱。 4、平衡 层析柱装好后,接上已调好流速的恒流泵,用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡,直到流出液的pH与洗脱液pH相同(约需2~3倍柱床体积)。5、加样

离子交换色谱-

离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺 何强1, 孔祥虹1, 李建华1, 乐爱山1, 赵洁2 ( 1. 陕西出入境检验检疫局, 西安710068; 2. 西安理工大学理学院, 西安710054) 摘要: 建立离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品直接用水和乙腈提取, 分析时用LC - SCX离子交换色谱柱分离, 浓度为0.05 mol/ L磷酸二氢钾溶液( pH值为3.0) - 乙腈( 70 ∶30) 为流动相, 流速1.0 mL/min, 在紫外波长240 nm下检测。三聚氰胺在0.5 ~ 100.0 mg/ L的范围内, 质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系( r=0.9999) , 最低检出限为1.0 mg/ kg, 加标回收率在93.8 % ~102.5 %范围内, 相对标准偏差(RSD) 小于3.5 %。该方法简便、快速、准确, 能够满足检测要求。 关键词:三聚氰胺; 乳制品; 离子交换色谱 Determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatography and UV detection HE Qiang1, KONG Xiang- hong1, LI Jian- hua1, YUE Ai- shan1, ZHAO Jie2 (1. Shaanxi Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xi' an 710068, China; 2. College of Science, Xi' an Universityof Technology, Xi' an 710054, China) Abstract: A method was developed for the determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatography. Samples were extracted with water and acetonitrile. Chromatographic analysis was performed on a LC - SCX column eluted with 0.05 mol/ L KH2PO4(pH=3.0) - acetonitrile (70∶30) at a flow rate of 1.0 mL/min and UV detection at 240 nm. The present method showed good linear relationship(r = 0.9999) for melamin at the range of 0.5 ~ 100.0 mg/ L, the detection limit were 1.0 mg/ kg, the recoveries ranged from 93.8 % to102.5 % with relative tandard deviations (RSD) less than 3.5 %. The ethod is simple, fast, accurate for the melamine analysis. Key words: melamine; dairy products; ion exchange chromatography 正文: 最近美国FDA调查确认宠物食品受三聚氰胺污染是造成许多宠物非正常死亡的原因, 从而要求出口到美国的含蛋白产品必须检测三聚氰胺, 已经对我国的食品出口企业产生了较大的负面影响。三聚氰胺(melamine)简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺, 分子式为C3N6H6, 是一种重要的氮杂环有机化工原料, 具有一定的肾毒性。因为其分子中 含有大量氮元素, 而用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮”, 所以一些不法

离子交换色谱法标准操作程序

方法摘要: 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography,IEC)以离子交换树脂作为固定相,树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时,组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。溶液pH低于C产品组分等电点PI时,组分带正电荷,可以跟固定相上的阳离子交换,吸附在固定相上,用盐浓度梯度洗脱时,组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。紫外检测器检测280nm处的响应值,根据组分峰面积计算纯度。 范围: 适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。职责: 操作人员: ?严格按照此规程要求进行操作。 岗位主管: ?起草文件,并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新; ?监督操作规程是否与实际过程一致,资源是否满足要求; ?培训,确保此操作规程的正确实施。 程序: 1术语解释 无 2试剂和材料 ?色谱柱:阳离子交换色谱柱,例如MabPac TM SCX-10,4.0×250mm,10μm(Thermo)?试剂:N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES,分析纯),氯化钠(NaCl,色谱纯),盐酸(HCl,分析纯),磷酸氢二钠(Na2HPO4,色谱纯),磷酸(H3PO4,色谱纯),纯 化水(自制) ?滤膜:孔径为0.45μm或以下 注:所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代,但应证明适用;所有材料遵循厂家有效期。3仪器设备 ?液相色谱仪:例如Agilent 1260 ?天平,精确到mg ?pH计 ?溶剂过滤装置 ?离心机(转速10000 rpm以上)

?移液器(10-1000 μl) 4溶液配制 4.1流动相配制 4.1.1流动相A:20 mM ACES,pH 6.20 称取ACES 3.64 g,加入1000 ml 水搅拌至完全溶解,HCl调pH 6.20±0.02; 经0.45 μm滤膜过滤,室温保存,有效期3天,使用前超声脱气15min。 4.1.2流动相B:20 mM ACES,500 mM NaCl,pH 6.20 称取ACES 3.64 g,NaCl 29.22 g,加入1000 ml水搅拌至完全溶解,HCl调pH 6.20±0.02; 经0.45 μm滤膜过滤,室温保存,有效期3天,使用前超声脱气15min。 注:流动相调pH时,确认溶液温度在23~27℃。 4.1.3色谱柱保存液:20 mM Na2HPO4/H3PO4,pH 6.5 称量2.84 g Na2HPO4,加入1000 ml纯水搅拌溶解,用H3PO4调节pH值为6.50±0.02,使用0.45 μm滤膜过滤后,2-8℃低温保存,有效期1个月。 4.2 样品溶液配制 4.2.1参比品溶液配制 取规定的参比品,根据蛋白浓度标示量,用制剂缓冲液稀释至5.0 mg/ml,转移到样品 瓶。 例:参比品CDS20180209,蛋白标示量为22.0 mg/ml,稀释4.4倍(40 μl参比品+136μl 制剂缓冲液),稀释后浓度为5.0 mg/ml。 4.2.2供试品溶液配制 稀释方法同4.2.1。 对于浑浊的样品,需经0.22 μm的滤膜过滤,或者10000 rpm离心10min,取上清液至 样品瓶。 5检测方法 5.1色谱系统准备 5.1.1打开sealwash(清洗液:10%异丙醇-水溶液);更换洗针瓶(清洗液:水); 5.1.2以检测方法的流动相起始比例(流动相A:4%,流动相B:96%),1.0 ml/min的流速平 衡至基线平稳,至少20min。 5.1.3关键色谱参数和洗脱梯度

连续离子交换

连续离子交换技术与设备 首页 >> 技术设备>> 连续离子交换技术与设备 连续离子交换技术和工业色谱技术是一种完全革新的分离工艺技术,不同于传统的固定床(Fixed Bed)、脉冲床(Pulse Bed)、模拟移动床(Simulated Moving Bed)等工艺。它是在传统的固定床树脂吸附和离子交换工艺的基础上结合连续逆流系统技术优势开发而成。 连续离子交换技术和工业色谱技术可用于分离、精制和回收各种工业用水及其他溶液中的特定有效物质及有害物质,此系统可使用传统的吸附剂(如离子交换树脂、活性炭及合成吸附剂等)。 两组分分离:基于两组分的速度不同而将其分离 固定床与逆流连续床比较

整个工艺循环 连续离子交换系统由一个带有多个树脂柱(16,20,30柱)的圆盘,和一个多孔分配阀组成。通过圆盘的转动和阀口的转换,使分离柱在一个工艺循环中完成了吸附,水洗,解吸,再生的全部工艺过程。且在连续离交系统中,离子分离的所有工艺步骤在同时进行。相比而言,固定床离子分离系统是在一种间歇式的工艺中一步一段时间的进行所有步骤的操作。 旋转示意流程 系统特点: 产品成分和浓度保持稳定; 由于采用多柱系统,可灵活变更生产工艺流程 全自动、程序化的操作控制,运行稳定,避免人工操作失误 设备紧凑,易于安装在任何位置,易与旧的生产过程和设备匹 配; 可同时去除或者分离具有不同特性的物质,可将复杂的工艺简单化; 树脂用量大幅减少50-90%,洗涤水的用量最高可节约50-70%,化学药品、洗脱剂的消耗也得到相应减少,减少运行成本和设备投资;

主要应用领域 制药行业(抗生素、维生素) 精细化工和生物技术(手性物质的分离) 食品行业(糖的软化、葡萄糖的去矿化,糖浆的脱色,果葡糖浆的纯化) 湿法冶金行业(金属回收) 水处理(废水处理、纯水制备) 迄今为止,三达已为国内外知名企业提供了数十套SEPTOR系统,广泛的应用于制药行业、食品行业、化学工业等,包括头孢菌素C的分离纯化、维生素C和古龙酸由盐x到酸的转化,果葡糖浆的分离,制取高果糖浆,阿米卡星的分离纯化等的生产工艺中。

氨基酸的离子交换色谱分离-上课讲稿

同学们好!下面开始上课。 今天我们的实验内容是“氨基酸的离子交换色谱分离”。大家翻到书本第69页。 我们的实验目的有三个: 1)了解层析法的概念、特点和分类; 2)复习氨基酸的理化性质; 3)掌握离子交换层析分离生物大分子的原理和方法。 今天实验题目是氨基酸的离子交换色谱分离。所以首先向同学们介绍离子交换色谱。 顾名思义,离子交换色谱,就是分离过程是基于离子交换的原理而进行的。具体来说,就是基于带相反电荷的分子的相互吸引。也就是异种电荷相互吸引、同种电荷相互排斥。所以,按照带电荷的正负,离子交换层析一般分为两种类型,一种是阳离子交换色谱,填料上结合有带负电荷的基团,可以与溶液中带正电荷的样品结合;另一种是阴离子交换色谱,填料上结合带正电荷的基团,可以与溶液中带负电荷的样品结合。那么,我们今天使用的是阳离子交换柱,就是你们桌子上的黄色填料。 离子交换色谱是利用样品的带电性质进行的分离。那么,氨基酸的带电性是怎么样的呢?这是基于氨基酸的组成。氨基酸是一种兼性离子。什么是兼性离子呢?就是在溶液中既可以带正电荷,又可以带负电荷。氨基酸包含一个氨基,可以作为氢离子的受体,这是氨基酸成为阳离子;氨基酸又带有一个羧基,可以作为氢离子的供体,这时氨基酸成为阴离子。有这个性质,引申出一个等电点的概念,也就是氨基酸所带净电荷为0的状态。在PH小于等电点时,氨基酸带负电荷,当PH大于等电点时,氨基酸带正电荷。 如何利用离子交换色谱分离两种不同的氨基酸? 因为离子交换色谱根据“同种电荷相斥,异种电荷相吸”原理分离样品,而不同的氨基酸具有不同的等电点,它们在溶液中可能携带相反电荷。

所以,我们将溶液调到一特定pH值,让一种氨基酸携带正电荷,使之与离子柱结合;同时,让另一种氨基酸携带负电荷,使之保留在溶液中。 在我们的实验中,我们需要分离天冬氨酸与赖氨酸,天冬氨酸的等电点时2.97,赖氨酸的等电点时9.74。我们可以看到,存在三种情况: 1)pH < 2.97 ,Asp与Lys均带正电荷 2)2.97 < pH < 9.74,Asp带负电荷,Lys带正电荷 3)pH > 9.74,Asp与Lys均带负电荷 是不是只有第二种情况符合我们之前说的方案? 因此,我们的实验基本步骤是:上样,样品液:0.005 mol/L 的Asp与Lys溶于0.02 mol/L HCl中形成的混合液(pH < 2)。1)先用pH5.3的柠檬酸缓冲液洗脱;2)pH 12 的氢氧化钠溶液洗脱。 1)平衡,向层析柱加入pH 5.3的柠檬酸缓冲液,直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止,用pH试纸检查。 2)上样。降低液面至填料表面上方1 厘米左右,加入0.5毫升氨基酸混合液样品。 3)向层析柱加入pH 5.3的柠檬酸缓冲液进行洗脱。 4)用短试管收集天冬氨酸。每管5毫升,收集1-5管。 5)向层析柱加入pH 12的NaOH缓冲液进行洗脱。每管5毫升,用短试管收集6-12管。 6)测定。取0.5毫升收集液于长试管中,加入1毫升pH5.3柠檬酸缓冲液, 0.5毫升茚三酮,混合后在100℃加热25分钟,然后水冷却5-10分钟,加入3毫 升60%乙醇稀释,用分光光度计在570 nm处检测。

tosoh高性能离子交换色谱柱

No.109 TSKgel STAT系列色谱柱 —目录— 页码 1. 前言 1 2. 色谱柱的基本特点 1 2-1. 填料特点 1 2-2. 柱压 2 2-3. 标准蛋白质的分离 2 2-4. 核酸的分离 4 2-5. 样品载量 5 3. 阴离子交换色谱柱的应用实例 6 4. 阳离子交换色谱柱的应用实例10 5. 总结14

1. 前言 离子交换色谱法是一项广泛应用于生物制药、生物化学和食品工业等领域的分析技术,其可以轻松地对生物大分子样品(例如蛋白质和核酸)进行分离和定量分析。离子交换色谱包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱,前者使用带季胺或叔胺基团的填料,后者使用带磺酸或羧酸基团的填料。可以根据目标蛋白质的化学性质、空间立体构造、等电点,或者根据与杂质组分间的不同分离选择性,选择最适填料装填的离子色谱柱。核酸一般采用阴离子交换色谱柱进行分离分析。东曹离子交换色谱柱包括TSKgel 5PW系列和TSKgel NPR系列产品,前者使用一种多孔性填料,可用于实验室规模的分离和纯化工作,后者使用非多孔性填料(粒径:2.5μm),适用于高速、高分辨率和微量分析。 无论是不同粒径的TSKgel PW系列高速分析、中高压制备填料,亦或是工业生产制备用TOYOPEARL系列的中低压层析填料,其填料基质的化学组成和骨架构造都是一致的,因此实验室规模下使用TSKgel 5PW系列色谱柱优化获得的分离条件可以很容易地规模放大到生产级别。 TSKgel NPR系列色谱柱使用非多孔性填料(粒径:2.5 μm),因此尤其适用于高分辨率和高通量的分析。此外,该类色谱柱对低浓度的肽和蛋白质样品分离、分析时,亦可获得良好的回收率。 最近推出的TSKgel STAT系列色谱柱,使用非多孔性填料,能够实现在较低柱压下获得与TSKgel NPR系列色谱柱相同或更好的保留及分辨率。本报告将详细介绍TSKgel STAT系列色谱柱的基本特点和部分应用实例。 2. 色谱柱的基本特点 2-1. 填料特点 TSKgel STAT系列色谱柱包括导入了季胺基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel Q-STAT阴离子交换色谱柱和TSKgel DNA-STAT阴离子交换色谱柱,可以提供10、7和5μm 多种粒径选择;包括导入了磺酸基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel SP-STAT强阳离子交换色谱柱,可以提供10和7μm的两种粒径选择;还包括导入了羧酸基团、非多孔、亲水性聚合物基质填料装填的TSKgel CM-STAT弱阳离子交换色谱柱。这些色谱柱的规格和特点详见表1。 TSKgel STAT系列色谱柱包括尺寸为3.0 mm I.D.×3.5 cm 的、设计用于进行1至2分钟内完成分析的高通量色谱柱(粒径10μm:高通量色谱分析柱);包括尺寸为4.6 mm I.D.× 10 cm的、设计用于进行高分辨率分析的色谱柱(粒径7μm:高分辨率色谱柱)。由于该类色谱柱使用的填料基质的机械强度高,填料几乎不会因溶剂改变而发生收缩或膨胀,所以也可以使用添加了有机溶剂的洗脱条件。在洗脱液中适当添加有机溶剂,可以有效抑制高疏水性样品的吸附,从而加快洗脱速度。此外,也可以通过在洗脱液中适当添加有机溶剂,有效清洗和去除实际样品分析中吸附在色谱柱填料上的污染物质。 表1 . TSKgel STAT系列色谱柱填料特点

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