柱层析的几个技巧

柱层析的几个技巧

柱层析就是通常所说的过柱子，又叫柱色谱，属于色谱法中使用最广泛的一种方法。对于含有多种有机物的混合样品，用重结晶无法提纯时，柱层析法可以说是有机实验中最有效的分离手段。实验室中常用的是以硅胶和氧化铝做固定相的吸附柱。硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。虽然很多化学实验书中都叙述了柱层析的实验方法，但大多数都是比较雷同地泛泛地描述，而且有些描述在实验室中并不适用。例如，很多书中都提到装柱时先在底层铺一层石英砂，倒入固定相后再在顶部铺一层石英砂。比较繁琐，而且效果也不是很好，在实验室中不适用。根据多年来使用柱层析的操作经验，本文总结了在使用柱层析时的几个技巧：

1、硅胶的使用

初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了，有时还会有大量的硅胶剩余，浪费硅胶，这主要是对硅胶等固定相的使用的量没有掌握。柱层析用的硅胶一般是100-200 目，100 毫升硅胶的质量在47 克左右，如果装一个直径是2.8 厘米的柱子，可以装18 厘高。为了避免浪费硅胶和溶剂，最初学习装柱时最好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单：用量筒量出100 毫升干硅胶，直接倒入各种规格的柱子中，敲实，用刻度

尺量出硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数了。一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅胶的使用量，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没有必要的浪费。称量硅胶时一般称30~70倍于上样量，如果极难分，也可以用100 倍量以上的硅胶。

2、洗脱剂的使用

洗脱剂的极性可用薄层层析来确定，一般以待分离样品Rf 值为0.2-0.3 为宜。选择的洗脱剂应该使两相邻物质Rf 值之差最大化。不要认为在板上爬得高分离的效果就比较好，如果Rf 在0.6，即使相差0.2 也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的过程，可以通过公式的比较：0.6/0.8 一次的分离度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。有时虽然在薄层板上看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以分离效果好。解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好的分离效果。当所分离物质极性跨度较大时，可用采梯度洗脱的方法，即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的不同化合物逐个洗脱下来。常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。在同样能洗脱的情况下，尽量使用

毒性小的洗脱剂。例如，乙酸乙酯：石油醚系统和二氯甲烷：石油醚系统，在同样都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯：石油醚系统。另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，混合溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使用。

3、装柱子的技巧

柱层析的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。湿法装柱很简单，使用也最普遍，就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆，柱子底部先用脱脂棉塞紧，然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。用漏斗将活好的固定相倒入柱子中，打开底部活塞，将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打，将固定相敲实，做到密实均匀无气泡即可。很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子，而且在柱子中没有气泡产生。干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中，然后用油泵抽柱子底部，相当于减压过柱，直到柱子变得很结实，再用淋洗剂“走柱子”。干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后，由于溶剂和固定相之间的吸附放热，所以柱子容易变花，影响分离效果。解决的方法是：

（1）固定相一定要添加结实；

（2）一定要用较多的溶剂“走柱子”，直到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱，最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。

4、上样的技巧

上样也有湿法和干法之分：湿法一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。在不用海沙的情况下，尽量不要破坏硅胶面。加样后，打开柱底活塞，让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会析出，这就需要先重结晶样品，得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。如果不能重结晶也没关系，直接过柱就行，样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解，最后随着洗脱剂流出。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF，DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按1：1 的量混合，硅胶使用的量也可以少一些，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒，

让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中，加入洗脱剂洗脱。

5、过柱的技巧

柱层析按过柱时的压力可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，例如一些天然化合物的分离，有时一个柱子过几个月也有可能。减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发，有时会在柱子外面有水汽凝结，另外有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气，噪音大，时间长，所以减压过柱用得比较少。加压过柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（用鱼缸供气的加压泵就行）。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。一般压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高，分离效果较好，所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡，使柱子变花，利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题，而且可以使柱子很快装实。随着科技的发展，色谱法的技术也日新月异，但柱层析实验技术还是比较简单和实用的，每个科研工作者在使用柱层析时，可以根据自己的实际情况来不断地摸索，不断地总结和提高柱层析的实验技术。

层析柱使用说明书

目录 一产品介绍 (2) 二产品特点 (2) 三技术参数 (2) 四操作说明 (2) 五操作注意事项 (4) 六售后服务承诺 (5) 七合格证 (5) 八随机附件 (6)

一产品介绍: 层析过程是采用特殊的吸附剂，从植物提取液中选择性地吸附其中的有效部分，去除无效成分的一种分离纯化新工艺。可以解决植提生产中所面临的剂量大、产品吸潮和重金属残留等实际问题。经层析技术处理后所得到的精制物，可使有效成分高度富集，杂质少，提取得率仅为原生物的2～5%，而一般水煮法为30%左右，醇沉法为15%左右；可有效地去除吸潮成分，并增强产品的稳定性；可有效地去除重金属。层析分离工艺所得提取物体积小，不吸潮，容易制成外型美观的各种剂型，尤其适用于颗粒剂、胶囊剂、片剂等的生产。该技术将是对中药提取工艺影响最大、带动面最广的技术进步之一。用于生物工程、制药工业、精细化工领域的分离纯化设计制造的工业制备，具有分辨高、选择性好、流动连续、效率高、处理稳定、样品可多可少、易于操作的特点，适用于含量少的复杂高分子物质的分离纯化，是中草药、化学合成药及生物活性物质有效成分分离提纯的核心设备。 二产品特点: ①合理的高径比，精密的进出口流体分布装置，保证层析柱装填效果和填 料再生效果，为高效分离提供了保障。 ②产品采用不锈钢材料，并进行内外抛光，耐腐蚀、使用寿命长、硬度高、 运输安全，质量有保障。 ③本设备确保无污染、效率高、操作方便等。 三技术参数

四操作说明 层析操作流程一般为：预处理，逆流洗柱，水洗，吸附，解吸、再生等工艺。 1、预处理：在吸附树脂的生产过程中，一般均采用工业级原料，产品没有经过进一步纯化处理，因此树脂内部往往残留少量单体，致孔剂和其他有机杂质，所以在使用之前必须进行预处理。 吸附树脂预处理方法如下： （1）将准备装柱使用的新树脂，用2倍左右体积的甲醇或其他水溶性溶剂（如乙醇、丙酮）浸泡2小时，并不时搅动，使树脂充分溶胀。 （2）、将已充分溶胀的吸附树脂装柱，以每小时3至4倍床体积的流速，将5至8倍的甲醇或其他水溶性的溶剂（如乙醇、丙酮）通过树脂层，至流出液加水稀释不变混。 （3）、甲醇处理后，以每小时6至8倍床体积的流速将去离子水通过树脂层，置换出甲醇即可投入使用。 2、逆流洗柱：逆流洗柱是用水洗除去水离子及破碎填料，树脂装入交换柱后，用蒸留水反洗树脂层，展开率为50-70%，直至出水清晰、无气味、无细碎树脂为止，再用50%-100%乙醇10-15倍体积慢速淋洗。2、用约2倍体积的4-5%HCl溶液，以2m/h流速通过树脂层。全部通入后，浸泡4-8小时，排去酸液，用洁净水冲洗至出水呈中性。冲洗流速为10-20m/h。 3、用约2倍树脂体积的2-5%NaOH溶液，按上面进HCl的方法通入和浸泡。排去碱液，用洁净水冲洗至出水呈中性。流速同上。酸碱溶液若能重复进行2-3次，则效果更佳。经预处理后的树脂，在第一次投入运行时应适当增加再生剂用量，以保证树脂获得充分的再生。 3、水洗：水洗目的主要是除去层析柱上所附着的渣滓。 4、吸附：吸附操作自上而下(或自下而上)通液，可采用不同流速，以选取最佳条件，一般流速sV 2—8。流出液每间隔一段时间取样检测，达泄漏点

离子交换柱层析原理

离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可

层析柱使用方法

层析柱使用方法 层析柱使用方法柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 1：装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱：是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱：则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 2：上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。 谈TLC，需要切记的是： 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷

柱层析分离的实验方法和技巧

柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二：关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm ×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。

层析柱的一些总结

多数微生物碱性蛋白酶不耐热，碱土金属，特别是钙对碱性蛋白酶有明显的热稳定作用 碱性蛋白酶是加酶洗涤剂的主要添加剂之一，在丝绸、制革工业中也有广泛用途 热稳定性将酶液分别置于不同的温度条件下（30℃，40℃，50℃，60℃，70℃）保温10min 后，立即在0℃冰浴中冷却，然后在40℃下测碱性蛋白酶活力，以剩余的酶活性作为评价酶的热稳定性的指标。测量三个重复求平均值，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下蛋白酶的剩余酶活性与最高酶活性的比值。 以ph7的缓冲液为例,如果你的目标蛋白等电点小于7,呢就带负电荷,用阴离子交换的柱子,如果是大于7,那选择阳离子交换的柱子,如果等电点是7,那上样的缓冲液pH大于它的等电点用阴离子,小于7的用阳离子,如此类推就可以 缓冲液的PH＝pI值＋1，上阴离子柱，＝pI值－1，上阳离子柱，一般缓冲液ph范围在6.5～8.5之间，与PI值相差1个PH是比较理想的。 如果不清楚PI值，可以将蛋白溶到PH梯度的缓冲液里，然后分别试阳离子和阴离子填料（50ul左右得体积就够了），看那个PH下挂得好。 强离子交换剂: 在宽pH范围内载量稳定，所以他的优点是不同pH下载量恒定，可控性好，平衡过程快速、简单。 弱离子交换介质的缺点：适用的pH范围比较小，随着pH不同载量发生变化。但是大部分蛋白等电点在5.5 ~ 7.5 。因此强/弱离子交换介质都可以使用 弱离子交换介质（DEAE、ANX、CM)优点在于：和强离子交换介质的选择性不同，因此我们一般先使用强离子交换，如果优化条件还是达不到理想的分离效果，可以尝试弱离子交换，用选择性不同的介质尝试一下。 因此弱离子交换与强离子交换由于选择性不同，可以说是对不同蛋白的结合力有差异。S 技术规格 离子交换剂类型 Q Sepharose FF 季氨基，强阴离子 DEAE Sepharose FF 二乙基氨基乙基，弱阴离子 ANX Sepharose 4FF 二乙基氨基丙基，弱阴离子 SP Sepharose FF 磺丙基，强阳离子 CM Sepharose FF 羟甲基，弱阳离子 离子容量 Q Sepharose FF 0.18-0.25mmol（Cl-）/ml DEAE Sepharose FF 0.11-0.16mmol（Cl-）/ml ANX Sepharose 4 FF 0.13-0.18mmol（Cl-）/ml SP Sepharose FF 0.18-0.25mmol（H+）/ml CM Sepharose FF 0.09-0.13mmol（H+）/ml 动态载量 Q Sepharose FF 120mg HSA/ml 填料 DEAE Sepharose FF 110mg HSA/ml 填料 ANX Sepharose 4 FF 5mg 甲状腺球蛋白/ml 填料 SP Sepharose FF 70mg RNAase/ml 填料 CM Sepharose FF 50mg RNAase/ml 填料

柱层析的一些心得

常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分离的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 １．吸附剂 常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等：吸附剂一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。对吸附剂来说粒子小、表面积大，吸附能力就高，但是颗粒小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性和碱性3种。酸性氧化铝是用1％盐酸浸泡后，用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液pH为4，用于分离酸性物质；中性氧化铝的pH约为7．5，用于分离中性物质；碱性氧化铝的pH约为10，用于胺或其它碱性化合物的分离。 因硅胶略带酸性，只能用于对酸不敏感的化合物的分离。常用300-400目的柱硅胶或H 硅胶。若化合物的R f值相差较大，则可考虑使用２00-３00目硅胶以加快层析速度。 另：因吸附剂的比表面较大，天气潮湿时或长期放置中吸附的水分会对分离效果产生极大的影响（相当于大大增加了固定相的极性导致样品分不开），因此应将吸附剂放入９０～１００度烘箱内烘２小时后，取出在干燥器中冷却后再使用。使用的硅胶，不用时一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面，或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。 2．溶质的结构与吸附能力的关系 化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，氧化铝对各种化合物的吸附性按以下次序递减： 酸和碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃 ３．柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球是常用的手动加压的方法。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 体会：过柱时是否加压要具体分析，通常情况下直径比较粗的柱子用常压即可，因其横截面积的缘故淋洗剂的流速已足够快。通常控制柱子下端液体流速大约在0.5~1滴每秒的范围比较合适。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。一般不推荐使用。 ４．柱子的尺寸 从理论上讲应该是粗长的好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了。

硅胶柱层析的操作方法

硅胶柱层析 一、硅胶柱层析的原理 利用吸附原理，即利用硅胶对中药混合物中各种成分吸附能力的差异，而使混合物中各成分得以分离的色谱方法。 二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 1、装柱 操作要点：装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防吸附剂外漏。有干法装柱和湿法装柱两种方法 （1）干法装柱：将硅胶通过漏斗装入柱内，中间不应间断，形成一细流慢慢加入管内。也可用橡皮槌轻轻敲打柱硅胶柱使硅胶装填连续均匀、紧密。柱装好后，打开下端活塞，然后倒入洗脱剂洗脱以排尽柱内空气，并保持一定液面。（2）湿法装柱：将最初准备使用的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂缓慢流出。然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内（或将硅胶与适量洗脱剂调成混悬液慢慢加入柱内，），硅胶依靠重力和洗脱剂的带动，在柱内自由沉降，此间要不断把流出的洗脱剂加回柱内保持一定的液面，直至把硅胶加完并在柱内沉降不再变动为止。然后在硅胶上面加一小片滤纸或少许脱脂棉。根据加样量控制洗脱剂液面至一定高度。 匀浆法：搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过

柱。 2、上样 将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中，制成体积小、浓度高的样品溶液，加入层析柱中硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂，则将样品溶于易挥发的溶剂中，并加入适量硅胶（不超过柱中硅胶全量的1/10）与其拌匀，除尽溶剂，将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶（始终保持洗脱剂有一定的液面），再覆盖一层硅胶即可。上样时注意沿着柱内壁慢慢加入，始终保持硅胶上端表面平整；上样量为硅胶的1/60~1/30。 3、洗脱 洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选，一般TLC展开时Rf 值为0.2~0.3的溶剂系统是最佳的洗脱系统，采用梯度洗脱法洗脱。先打开柱下端活塞，保持洗脱剂流速1~2滴/秒。上端不断添加洗脱剂（可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相近）。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂洗（一般不超过三种溶剂），通常采用梯度洗脱。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。 4、收集处理 等份收集洗脱液，每份收集量大概与所用硅胶的量相当。每份洗脱液采用薄层定性检查，合并含相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单体成分。如仍为几个单体成分的混合物，不易析出单体成分的结晶。则需要进一步层析或用其他方法分离。 注：(1)柱色谱分离能力比薄层分离能力强，效果更好，尤其对结构相似、性质接近、采用薄层难以分离的成分分离效果好。 (2) 洗柱子能不用含水的混合溶剂，就尽量不要用。

柱层析知识总结

柱层析知识总结 柱层析 利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。 1.吸附柱层析的器材 (1)层析柱 实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。 层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。 (2)吸附剂 柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30～50倍，对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素，最后用实验方法选择和确定。 市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗到其浸出液的pH值为4，适用于分离酸性物质；碱性氧化铝浸出液的pH值为9～10，用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应pH值为7.5，适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分，可适用于各类有机物的分离。 柱层析所用氧化铝的粒度一般为100～150目，硅胶为60～100目，如果颗粒太小，淋洗剂在其中流动太慢，甚至流不出来。 氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好，要用实验方法确定，而不是盲目选择高的活性级别，最常使用的是Ⅱ～Ⅲ级。如果吸附剂活性太低，分离效果不好，可通过“活化”来提高其活性。所谓“活化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分，提高其吸附活性的过程。通常是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。“活化”的温度和时间应根据分离需要而定。氧化铝一般在200℃恒温4h，硅胶在105～110℃恒温0.5～1h。“活化”完毕，切断电源，待温度降至接近室温时，从烘箱中取出放进干燥器中备用。有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好，可将吸附剂放在空气中让其吸收一些水分，分离效果反而好一些。 此外，一些天然产物带有多种官能团，对微弱的酸碱性都很敏感，则可用纤维素、淀粉或糖类作吸附剂。活性碳是

柱层析方法经验归纳汇总

1、选柱子：有玻璃柱和不锈钢柱两种，实验室常用玻璃柱。径高比一般在1:5-10。 根据吸附剂用量（体积)确定柱子大小，一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4～1/5。 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。 其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结)，以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长)。 加压柱是种比较好的方法，与常压柱类似，只是外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或小气泵。特别在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 柱子的尺寸为粗长的最好。柱子越长，相应的塔板数就越高。柱子越，上样后样品的原点就越小（反映在柱子上就是样品层比较薄)，这样相对的减小了分离的难度。 无水无氧柱适用于对氧、水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱

和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的物质，小心不为过。因为分离的物质比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝有碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。 2、选择吸附剂：200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶。干硅胶的视密度在左右，所以要称40 g硅胶，用烧杯量100 ml也可以。 书中写硅胶量是样品量的30-40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在，杂质相差以上)，就可以少用硅胶。 用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。 常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。

过柱子的原理与方法

过柱子的原理与方法 标签：过柱子硅胶原理方法 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。，硅胶层析是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使物质分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。硅胶层析主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯，高纯度物质的制备等。 硅胶层析 性状：该产品为白色均匀颗粒，主要成分为二氧化硅，由优质硅胶为原料加工制成。其主要特点是能通过对混合物质中的不同成分吸附保留时间的差异，达到分离提纯的目的。依其纯度又分为工业级粗孔柱层析硅胶、试剂级柱层析硅胶。 用途：主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯，高纯度物质的制备等。 硅胶表面结构概述 在色谱和工业水处理领域中，无定形硅胶已得到了广泛的应用，它具有多孔的无定形结构，不产生任何x 射线衍射[1,4]。硅胶的表面存在着硅醇基团(si-oh)和暴露的硅氧烷键(si-o-si)。硅醇基团是强吸附的极性基团，而硅氧烷键是疏水基团。硅氧烷键上的δ键被dπ-pπ作用而加强，氧原子上的孤对电子参与π作用，不能参与给体与受体间的相互作用，不能形成氢键。scott和kucera证实硅氧烷基团几乎不吸附极性溶剂分子。然而，由于硅氧烷键的疏水作用性，可以吸附某些非极性溶剂分子。对硅胶改性而言，硅醇基比硅氧烷基重要得多。硅醇基团可以孤立、成对(双生)和缔合(连位)等不同的方式存在于硅胶表面。最近研究表明，不仅两个或两个以上的缔合硅醇基团可以形成键合对，甚至成对硅醇基团也可以形成键合对。硅胶表面的结构可以通过许多方法进行测定。一般情况下，随着比表面积的增加，硅胶表面上硅醇基团的浓度略有降低。通常硅醇含量的测定方法有同位素交换法、滴定法、光谱法和烷基铝法等。nawrock[1]报道了用同位素交换法测定硅胶表面的硅醇基浓度是8.0±1.0μmol/m2，而且这个数值常常被视为硅胶的物理化学常数。硅醇基团具有明显的酸性，测定的pka值是7.1。通过对硅胶表面的结构分析，可知硅胶表面硅醇基的类型、浓度和表面分布都会影响所制备键合相的性能，而硅胶的预处理则可以改变表面硅醇类型的分布，提高表面的缔合硅醇的含量，改善硅胶表面键合相的性能。 硅胶柱层析技术 硅胶柱层析原理 硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。 硅胶柱层析流动相 极性小的用乙酸乙酯：石油醚洗脱；极性较大的用甲醇：氯仿洗脱；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸洗脱；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 硅胶柱层析惯用方法 1.称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅

柱层析法和薄层层析法简介

柱层析法和薄层层析法简介 柱层析法 1. 原理 流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。 2. 柱色谱分离条件 ⑴固定相选择 柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为： 成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。 常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。 活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的再重叠，适得其反。 ⑵流动相选择 色谱分离使用的流动相又称展开剂。展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。 在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。 在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色谱柱。

详细柱层析技巧

详细柱层析技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。 柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。 关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。 可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。

过柱子总结(吸附剂与洗脱剂)

过柱子总结（吸附剂与洗脱剂） 吸附剂与洗脱剂 （一）吸附剂与洗脱剂 根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。 1．吸附剂的要求 ①对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。 ②对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。 ③颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速（一般为1.5mL·min-1）通过色谱柱。 ④材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。 2、常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。 3、几种常见吸附剂的特性 （1）氧化铝：市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100～150目。 碱性氧化铝（pH9—10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。 酸性氧化铝（pH3.5—4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。 中性氧化铝（pH7—7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。 （2）硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。 适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。（3）聚酰胺：色谱用聚酰胺主要又锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在16000～20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。 聚酰胺色谱的原理：兼具吸附色谱和分配色谱的功能。采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱——正相色谱；采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱——反相色谱。 分离对象：能与聚酰胺形成氢键的化合物，如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。 聚酰胺在水中吸附能力的规律： 形成氢键的基团(如：酚经基、按基、酪基、硝基等)越多， 则吸附力越强。如：丁二酸＞丁酸 形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小。芳香核、共轭双键多者吸附力大，少者吸附人小。

柱色谱实验操作方法

一、液-固色谱原理 液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术，柱色谱属于液-固吸附色谱。 当混合物溶液加在固定相上，固体表面借各种分子间力（包括范德华力和氢键）作用于混合物中各组分，以不同的作用强度被吸附在固体表面。 由于吸附剂对各组分的吸附能力不同，当流动相流过固体表面时，混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少，吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。 二、柱色谱分离条件 （1）固定相选择 柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。

吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为： 成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。 常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等（表1）。 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4～4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9～10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。

吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。 活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。 吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的在重叠，适得其反。 （2）流动相选择 色谱分离使用的流动相又称展开剂。 展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。 在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。 在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色谱柱。 当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能展开洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。 三、柱色谱分离操作

柱层析的操作步骤和注意事项

柱层析技术 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相 的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望 能有所帮助。 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所 以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分 离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过 硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝聚），以及有些比较易分解的东西可能得 不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过 减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念 头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力 的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。非凡是在轻易分解 的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得 加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。 柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是 样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想假如柱子十厘米，而样品就有二 厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而假如样品层只 有0.5厘米，那么各组分就比较轻易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多 的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说， 不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选

层析柱知识

柱层析 利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。 1.吸附柱层析的器材 (1)层析柱 实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF 等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。 层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。 (2)吸附剂 柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30～50倍，对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素，最后用实验方法选择和确定。 市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗到其浸出液的pH值为4，适用于分离酸性物质；碱性氧化铝浸出液的pH值为9～10，用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应pH值为7.5，适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分，可适用于各类有机物的分离。 柱层析所用氧化铝的粒度一般为100～150目，硅胶为60～100目，如果颗粒太小，淋洗剂在其中流动太慢，甚至流不出来。 氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好，要用实验方法确定，而不是盲目选择高的活性级别，最常使用的是Ⅱ～Ⅲ级。如果吸附剂活性太低，分离效果不好，