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类胡萝卜素的分离与测定

类胡萝卜植物色素的分离与测定

一,实验目的

1、学会类胡萝卜素的分离测定的方法。

二,实验基本原理

β-胡萝卜素分子中的碳骨架是由8个异戊二烯单位连接而成的,它们是四萜类化合物。它们的分子中都有一个较长的π-π共轭体系,能吸收不同波长的可见光,因而,它们都呈现一定的绿色,β-胡萝卜素是黄色物质,所以,又把它们叫做多烯色素。

(β-胡萝卜素)

胡萝卜素是最早发现的一种多烯色素。后来,又发现了许多在结构上与胡萝卜素类似的色素,于是就把这类物质叫做胡萝卜素类化合物,或者叫做类胡萝卜素。这类化合物大都难溶于水,易溶于弱极性或非极性的有机溶剂,因此又把这类化合物叫做脂溶性色素。

胡萝卜素广泛存在于植物的叶、花、果实中,尤以胡萝卜中含量最高。胡萝卜素有α、β、γ三种异构体,在生物体中以β-异构体含量最多,生理活性最强。在动物体中,胡萝卜素在酶的作用下可转化为维生素A,因此,胡萝卜素又被叫做维生素A原。胡萝卜素在人和高等动物体内就有重要的生理功能,是人和高等动物生存不可缺少的营养物质。

三,实验仪器与试剂

仪器:三角瓶(50ml)、分液漏斗(150ml)、蒸馏瓶(50ml)、普通蒸馏装置(或减压蒸馏装置)、色谱柱、硅胶薄层板、量筒、烧杯、试管、721分光光度计、层析缸。

试剂:番茄(或番茄酱)或胡萝卜、食盐、丙酮、乙酸乙酯、石油醚(60~90℃)、乙醇、污水硫酸镁、氧化铝(层析用,100~200目)、硅胶(层析用,200~300目)、无水硫酸钠、石油醚(60~90℃):乙醇(2:1,V/V)、石油醚:丙酮(3:2,V/V)。

四,实验内容与步骤

1、类胡萝卜素的柱色谱分离:

选一支1.5*20cm 的色谱柱,用适量层析用氧化铝(100~200目)作吸附剂干法装柱,高度约10cm ,要求紧密匀实。分离方式为梯度洗脱,第一步用石油醚(60~90℃)洗脱。先沿色谱柱管壁滴加5~8ml 石油醚至柱体(各方向要均匀),待溶剂表面降至氧化铝柱面顶端时,用滴管迅速地小心滴加5~10滴样品至柱子中,待样品液面即将在柱面上消失时,沿管壁小心滴加石油醚3~5滴,冲洗粘在管壁上的有色物质。如此重复3~4次,直至管壁冲洗干净为止。随后,在管内加入尽可能多的石油醚进行洗脱,第一步收集到的洗脱液为黄色。待洗脱液清亮无色后用石油醚:丙酮(3:2,V/V)的混合液洗脱,第二步收集到的洗脱液为红色。最后用丙酮将前两步不能洗脱的剩余组分洗脱下来。分别收集第三步洗脱液,用薄层色谱检测及分光光度法测定。

2、类胡萝卜素的薄层色谱检测:

对前面得到的类胡萝卜素样品以及柱色谱分离得到的样品分别进行薄层分析,以检查柱色谱分离效果。薄层层析板预先用硅胶G制备并活化(110℃,1小时),展开剂为石油醚:丙酮(3:2,V/V)。薄层分离后观察斑点位置,计算各斑点的Rf值,并明确各斑点归属。

在本实验条件下,薄层检测结果为:β-胡萝卜素,黄色,Rf值为0.89;番茄红素,深红色,Rf值为0.84。

3 、类胡萝卜素的分光光度法测定

取柱色谱分离后得到的样品,用丙酮适当稀释至仪器测量范围,然后用721分光光度计分别在420~520范围测定它们的光密度E,并做出E-λ曲线(每隔10nm 测定一次光密度)。指出各自最大吸收峰λmax ,并与标准吸收对照鉴定。

五,注意事项:

1 、新鲜番茄果肉组织中含有大量水分,类胡萝卜素处在含水量很高的细胞环境中,有机溶剂不易渗透进去,因此,为了提高提取效率,减少提取溶剂用量,应首先用食盐对番茄果肉进行脱水处理。经食盐一次脱水处理后,番茄果肉里仍然有一定量水分,致使所用提取溶剂还是无法进入细胞内很好地将类胡萝卜素溶出,故选用弱极性溶剂丙酮对之进一步脱水,同时也会溶出部分类胡萝卜素。为了最大限度地减少类胡萝卜素的损失,故应将前两步脱除下来的水分及这一步的丙酮浸提液都滤入分液漏斗中合并处理。经丙酮处理后的番茄果肉便可直接加有机溶剂浸提。

如果用番茄酱或胡萝卜作原料提取;类胡萝卜素,食盐脱水及丙酮进一步脱水处理这些步骤便可省去。

2、浓缩提取液时应当用水浴加热蒸馏瓶;最好用减压蒸馏,而且不可蒸得太快、太干,以免类胡萝卜素受热分解破坏。

3、如用乙酸乙酯提取类胡萝卜素提取液浓缩至1~2ml 后,应停止蒸馏,拆卸仪器,将蒸馏瓶敞口,让剩余的乙酸乙酯挥发至干,然后再加适量石油醚溶解,所得溶液即为类胡萝卜素样品,用于下一步实验。切不可将经过浓缩的乙酸乙酯提取液直接用于柱色谱分离。