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高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。

特点

1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~350×105Pa。

2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于1h 。

3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。

4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。

5.适应范围宽:气相色谱法与高效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ~80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。

高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

根据分离机制的不同,高效液相色谱法可分为下述几种主要类型:

1 .液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同,避免固定液流失),有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱,溶质在两相间进行分配。达到平衡时,服从于下式:

式中,cs—溶质在固定相中浓度;cm--溶质在流动相中的浓度;Vs—固定相的体积;Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处,即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大;但也有不同之处,GPC中,流动相对K影响不大,LLPC流动相对K影响较大。

a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。

b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。

c. 液—液分配色谱法的缺点:尽管流动相与固定相的极性要求完全不同,但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力,会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后),可克服上述缺点。现在应用很广泛(70~80%)。

2 .液—固色谱法

流动相为液体,固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是:当试样进入色谱柱时,溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附(未进样时,所有的吸附剂活性中心吸附的是S),可表示如下:Xm + nSa ====== Xa + nSm

式中:Xm--流动相中的溶质分子;Sa--固定相中的溶剂分子;Xa--固定相中的溶质分子;Sm--流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时:

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中:K为吸附平衡常数。[讨论:K越大,保留值越大。]

3 .离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

以阴离子交换剂为例,其交换过程可表示如下:

X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)

当交换达平衡时:

KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]

分配系数为:

DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]

[讨论:DX与保留值的关系]

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

4 .离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)

离子对色谱法是将一种( 或多种) 与溶质分子电荷相反的离子( 称为对离子或反离子) 加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示:

X+水相+ Y-水相=== X+Y-有机相

式中:X+水相--流动相中待分离的有机离子(也可是阳离子);Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对(如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等);X+Y---形成的离子对化合物。当达平衡时:

KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相

根据定义,分配系数为:

DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相

[讨论:DX与保留值的关系]

离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题,诸如酸、碱和离子、非离子混合物,特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

5 .离子色谱法(Ion Chromatography)

用离子交换树脂为固定相,电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器,为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰,设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相,分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时,发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的逆过程):

抑制柱上发生的反应:

R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O

R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-

可见,通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水,消除了本底电导的影响;试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-,可用电导法灵敏的检测。

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。

6 .空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)

空间排阻色谱法以凝胶(gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用,但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后,随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,因此就直接通过柱子,首先在色谱图上出现,一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中,这些组分在柱上的保留值最大,在色谱图上最后出现。

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、.分离系统、检测系统和数据处理系统,下面将分别叙述其各自的组成与特点。

1.进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作,进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

2.输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47~

4.4X107Pa,流速可调且稳定,当高压流动相通过层析柱时,可降低样品在柱中的扩散效应,可加快其在柱中的移动速度,这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存错和梯度仪,可使流动相随固定相和样品的性质而改变,包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值,或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质(即使仅有一个基团的差别或是同分异构体)都能获得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10~50cm(需要两根连用时,可在二者之间加一连接管),内径为2~5mm,由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成,住内装有直径为5~10μm粒度的固定相(由基质和固定液构成).固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成,它们都有惰性(如硅胶表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔径可达1000?)和比表面积大的特点,加之其表面经过机械涂渍(与气相色谱中固定相的制备一样),或者用化学法偶联各种基因(如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等)或配体的有机化合物。因此,这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如,在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外,固定相基质粒小,柱床极易达到均匀、致密状态,极易降低涡流扩散效应。基质粒度小,微孔浅,样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析,基质粒度小,塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小,会提高分辨率的道理。

再者,高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C,通过改善传质速度,缩短分析时间,就可增加层析柱的效率。

4.检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。

(1)紫外检测器

该检测器适用于对紫外光(或可见光)有吸收性能样品的检测。其特点:使用面广(如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);灵敏度高(检测下限为10-10g/ml);线性范围宽;对温度和流速变化不敏感;可检测梯度溶液洗脱的样品。

(2)示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示差折光检测器检测。目前,糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单,但灵敏度低(检测下限为10-7g /ml),流动相的变化会引起折光率的变化,因此,它既不适用于痕量分析,也不适用于梯度洗脱样品的检测。

(3)荧光检测器

凡具有荧光的物质,在一定条件下,其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此,这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定,其灵敏度很高(检测下限为10-12~10-14g/ml),痕量分析和梯度洗脱作品的检测均可采用。

(5)数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。

高效液相色谱分析原理及流程

高效液相色谱分析原理及流程 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础,是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大,传质扩散慢,因而柱效低,分离能力差,只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来,在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等

常见色谱仪的色谱分离原理

常见色谱仪的色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1.液固色谱法:使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2.液液色谱法:使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相,如C18、 C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法:采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。 反相色谱法:一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8),太高的pH

色谱法的分类及其原理

色谱法的分类及其原理 (一)按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 (二)按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) :柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱,试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法(paper chromatography):纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体,把试样点在滤纸上,然后用溶剂展开,各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现,根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) :薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层,然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 (三)按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同,又可将其分为:

1、吸附色谱法:利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物(例如,分离醇类与芳香烃)。 2、分配色谱法:利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法:利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法,利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离,而且广泛地应用于有机和生物物质,如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法:是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法,体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻,较早的淋洗出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。这样,样品分子基本按其分子大小先后排阻,从柱中流出。被广泛应用于大分子分级,即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法:相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相,利用与固定相不同程度的亲和性,使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质(或抑制剂)、抗原与抗体,激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用,使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物,

液相色谱仪的工作原理

液相色谱仪的工作原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。特点 1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~ 350×105Pa。 2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于 1h 。 3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。 4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。 5.适应范围宽:气相色谱法与高效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于 400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的 75% ~ 80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同,高效液相色谱法可分为下述几种主要类型: 1 .液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为:液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法(液-固吸附色谱法) 固定相是固体吸附剂,它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂:一些多孔的固体颗粒物质,其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后,在随载液流动的过程中,发生如下交换反应: X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相) 其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为: K值较小:溶剂分子吸附力很强,被吸附的溶质分子很少,先流出色谱柱。 K值较大:表示该组分分子的吸附能力较强,后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡,就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂:薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律:对于固定相而言,非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱,分配比k较小,保留时间较短;但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强,分配比k大,保留时间长。 对流动相的基本要求: 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相:甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不;数量官能团的有机化合物,以及有机化合物的不同的异构体;但液-固色谱法不宜用于分离同系物,因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法(液-液分配色谱法) 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时,在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较快;在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较慢,从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同,均服从分配定律:K=C固/C液 K值大的组分,保留时间长,后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相,非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相,极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相。

高效液相色谱原理

高效液相色谱法(HPLC) 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法

其工作流程为:高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系,在色谱柱之前通过进样器将样品导人,流动相将样品依次带入预柱、色谱柱,在色谱柱中各组分被分离,并依次随流动相流至检测器,检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。

HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点(HPLC) 与经典柱色谱原理相同,是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中,根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分

配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用,提高了柱效率,降低了检出限,缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质,弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比,各有所长,互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品,一般不用液相色谱法,因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 (1)固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 (2)流动相(淋洗液) 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用,选用的流动相具有廉价、易购的特点外,还应满足下列要求: ①与固定相互不相溶,并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度,以防所含微量杂质在柱中积累,引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力,以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度(可减少溶质的传质阻力,提高柱 效)和适当低的沸点。

高效液相色谱原理和操作详解

高效液相色谱 我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表: 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多,因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I.概论 (3) 一、液相色谱理论发展简况 (3) 二、HPLC的特点和优点 (4) 三、色谱法分类 (5) 四、色谱分离原理 (5) II.基本概念和理论 (10) 一、基本概念和术语 (10) 二、塔板理论 (17) 三、速率理论(又称随机模型理论) (19) III.HPLC系统 (22) 一、输液泵 (23) 二、进样器 (27) 三、色谱柱 (29)

四、检测器 (35) 五、数据处理和计算机控制系统 (41) 六、恒温装置 (42) IV.固定相和流动相 (43) 一、基质(担体) (43) 二、化学键合固定相 (46) 三、流动相 (49) 1.流动相的性质要求 (49) 2.流动相的选择 (50) 3.流动相的pH值 (51) 4.流动相的脱气 (52) 5.流动相的滤过 (53) 6.流动相的贮存 (54) 7.卤代有机溶剂应特别注意的问题 (54) 8.HPLC用水 (55) V.HPLC应用 (56) 一、样品测定 (56) 二、方法研究 (58) 附件:高效液相色谱法(HPLC)复核细则 (58) 一、对起草单位的要求: (58) 二、对复核单位的要求: (59)

I.概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用 液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography,HSLP)。也称现代液相色谱。

液相色谱仪的原理和分析方法

液相色谱仪的原理及分析方法 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。 特点: 1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~350×105Pa。 2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于1h 。 3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。 4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。 5.适应范围宽:气相色谱法与高效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ~80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

高效液相色谱法基本原理

高效液相色谱法基本原理 一、实验目的 1. 了解高效液相色谱法分离的基本原理; 2. 了解高效液相色谱仪的基本构造; 3. 了解高效液相色谱仪的基本操作。 二、基本原理 高效液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20%,而80%则需用高效液相色谱来分析。 高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同,它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。 高效液相色谱分析原理: (一)高效液相色谱分析的流程:由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程:同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。 三、系统构成 1.主机:Waters Allance 2695高效液相色谱仪,分为①分离单元Allance2695;②紫外-可见检测器2487;③荧光检测器2474;④示差折光检测器2414。 2.操作控制系统:DELL Dimmsen 4550微机;Waters Millunnium32 V4.0 色谱管理器软件。 3.打印机:HP LaserJet 1000激光打印机。 四、实验步骤 1. 系统开机准备 (1)接通电源。

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。 特点 1.高压:液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。一般可达150~350×105Pa。 2. 高速:流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于1h 。 3. 高效:近来研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。 4.高灵敏度:高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外,用样量小,一般几个微升。 5.适应范围宽:气相色谱法与高效液相色谱法的比较:气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ~80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好,且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同,高效液相色谱法可分为下述几种主要类型: 1 .液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同,避免固定液流失),有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱,溶质在两相间进行分配。达到平衡时,服从于下式: 式中,cs—溶质在固定相中浓度;cm--溶质在流动相中的浓度;Vs—固定相的体积;Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处,即分离的顺序取决于K,K大的组分保留值大;但也有不同之处,GPC中,流动相对K影响不大,LLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。

超高效液相色谱原理

超高效液相色谱原理:分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、 压力有关。在不同的色谱分离机制中,K有不同的概念:吸附色谱法为吸附系数,离子交换色谱法为选择性系数,凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。 在条件一定,样品浓度很低时时,K只取决于组分的性质,而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件,在这种条件下,得到的色谱峰为正常峰;在许多情况下,随着浓度的增大,K减小,这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。因此,只有尽可能减少进样量,使组分在柱内浓度降低,K恒定时,才能获得正常峰。 超高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法,高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成,其整体组成类似于气相色谱,但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。 超高效液相色谱时,液体待检测物被注入色谱柱,通过压力在固定相中移动,由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同,不同的物质顺序离开色谱柱,通过检测器得到不同的峰信号,最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。由于HPLC具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。 超高效液相色谱主要类型: 1.液液分配色谱分离原理:分配色谱法的原理与液液萃取相同,都是分配定律。 2.液固吸附色谱分离原理:液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行混合物分离的,其固定相是固体吸附剂。 3.键合相色谱分离原理:正键合相色谱分离远离:使用的是极性键和固定性,溶质在此类固定相上的分离机理属于分配色谱。 畜禽中瘦肉精分析 瘦肉精是盐酸克伦特罗的俗称,将其添加到饲料中可使动物生长速率、饲料转化率和胴体的瘦肉率提高10%以上,并降低其脂肪含量。长期使用会使该药蓄积在动物的组织中,造成组织中残留药物的浓度很高,人食用这种组织后15min~6h就可出现中毒症状。气相色谱技术可用于动物毛发、尿液及组织中盐酸克伦特罗的定性定量分析。样品从预处理到得出结果需要2天时间,检测下限为0.5μg/kg。 色谱技术的不断发展,以及高科技的应用,气相色谱技术将越来越完善。因其特别适用于气体混合物或易挥发性的液体或固体检测,即便对于很复杂的混合物,其分离时间也很短。其高分辨率、分析迅速和检测灵敏等显著优点使之成为每个分析检测实验室已采用的常规检测方法。因大多数食品中对人体有毒有害物质的组分复杂且是易挥发的有机化合物,所以,气相色谱技术在食品安全检测中有着非常广泛的应用前景。 气相色谱法是以惰性气体(N2或He)为载体将样品带入气相色谱仪进行分析的色谱法,而利用气相色谱仪对气体或液体样品进行组分分析的技术被称之为气相色谱技术。它特别适用于气体混合物或易挥发性的液体或固体检测,即便对于很复

色谱法分离原理教案

第十四章色谱法分离原理 一.教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二.重点与难点 1.塔板理论,包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数 (n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三.教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线(色谱峰)所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法 四.学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有

碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相;自上而下运动的一相(一般是气体或液体)称为流动相;装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度,可将色谱法分类如下: 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱(G C) 根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的 一薄层有机化合物液体),又可分为气固色谱(G S C)和气液色谱(GL C)。液体为流动相的色谱称液相色谱(LC) 同理液相色谱亦可分为液固色谱(L SC)和液液色谱(L LC)。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱(SF C)。随着色谱工作的发展,通过化学反应将固定液键合到载体表面,这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱(CB PC). 2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法,称为吸附色谱法。 利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法,称为离子交换色谱法。

液相色谱原理

高效液相色谱分析原理 2009年05月12日星期二 17:46 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础,是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大,传质扩散慢,因而柱效低,分离能力差,只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。 高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来,在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。高效液相色谱分析原理(一)高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度, 而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。

(二)高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。高效液相色谱的类型(一)吸附色谱 在吸附色谱中,样品的极性官能团牢固地保留在填料的吸附活性中心上,非极性烃基几乎不予保留。所以,要清楚地辨别极性功能团的种类、数量和位

比较气相色谱法与高效液相色谱法分离原理、仪器构造及应用范围的不同点

比较气相色谱法与高效液相色谱法分离原理、仪器构造及应用范围的不同点。 一、分离原理: 1.气相:气相色谱是一种物理的分离方法。利用被测物质各组分在不同两相间分配系数(溶解度)的微小差异,当两相作相对运动时,这些物质在两相间进行反复多次的分配,使原来只有微小的性质差异产生很大的效果,而使不同组分得到分离。 2.液相:高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,在技术上,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。 二、应用范围: 1.气相:气相色谱法具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。一般对500℃以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或裂解法。 2.液相:高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(些物质几乎占有机物总数的75% ~80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%。 三、仪器构造: 1.气相:由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控制状态。 1.1 柱箱:色谱柱是气相色谱仪的心脏,样品中的各个组份在色谱柱中经过反复多次分配后得到分离,从而达到分析的目的,柱箱的作用就是安装色谱柱。 由于色谱柱的两端分别连接进样器和检测器,因此进样器和检测器的下端(接头)均插入柱箱。 柱箱能够安装各种填充柱和毛细管柱,并且操作方便。 色谱柱(样品)需要在一定的温度条件下工作,因此采用微机对柱箱进行温度控制。并且由于设计合理,柱箱内的梯度很小。 对于一些成份复杂、沸程较宽的样品,柱箱还可进行三阶程序升温控制。且程序设定后自动运行无需人工干预,降温时还能自动后开门排热。 1.2 进样器: 进样器的作用是将样品送入色谱柱。如果是液体样品,进样器还必须将其汽化,因此采用微机对进样器进行温度控制。 根据不同种类的色谱柱及不同的进样方式,共有五种进样器可供 选择: 1.填充柱进样器 2.毛细管不分流进样器附件 3.毛细管分流进样器附件 4.毛细管分流/不分流进样器 5.六通阀气体进样器 1.3检测器:

气相色谱的分离基本原理

一、气相色谱的分离基本原理是什么? 1.利用混合物中各组分在流动相和固定相中具有不同的溶解和解吸能力,或不同的吸附和脱附能力或其他亲和性能作用的差异。 2.当两相作相对运动时样品各组分在两相中反复多次受到各种作用力的作用,从而使混合物中各组分获得分离。 二、简述气相色谱仪的基本组成。 基本部件包括5个组成部分。 1.气路系统;2.进样系统;3.分离系统;4.检测系统;5.记录系统。 简述气相色谱法的特点? 1、高分离效能; 2、高选择性; 3、高灵敏度; 4、快速; 5、应用广泛。 三、什么叫保留时间? 从进样开始至每个组分流出曲线达极大值所需的时间,可作为色谱峰位置的标志,此时间称为保留时间,用t表示。 四、什么是色谱图? 进样后色谱柱流出物通过检测器系统时,所产生的响应信号时间或载气流出气体积的叫曲线图称为色谱图。 五、什么是色谱峰?峰面积? 1、色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线称为色谱峰。 2、出峰到峰回到基线所包围的面积,称为峰面积。 六、怎样测定载气流速? 高档色谱仪上均安装有自动测试装置,无自动测试装置可用皂膜流量计测,将皂膜流量计连接在测检测出口(也可将色谱柱与检测器断开皂膜流量计测接在色谱柱一端),测试每分钟的流速。测完后色谱升温压力表指示会升高,原因是温度升高色谱柱对气体的阻力增加,不要把压力调下来,当色谱温度升高稳流指示不会改变。测试载气流速在室温下测试。 七、怎样控制载气流速? 载气流速的控制主要靠气路上高压钢瓶上的减压阀减压,然后经仪器的稳压阀稳压,再经稳流阀以达到控制载气流量稳定,减压阀给出的压力要高出稳压后的压力。非程序升温色谱一般没有稳流阀,只靠稳压阀控制流速。 八、气相色谱分析怎样测其线速度? 1、一般测定线速度实际上是测定色谱柱的死时间; 2、甲烷作为不滞留物,测定甲烷的保留时间(TCD检测器以空气峰), 3、用色谱柱的长度除以甲烷的保留时间得到色谱柱的平均线速度。 九、气相色谱分析中如何选择载气流速的最佳操作条件? 在色谱分析中,选择好最佳的载气流速可获得塔板高度的最小值。因此,从速率理论关于峰形扩张公式可求出最佳流速值。通常色谱柱内径4mm,可用流速为30ml/min 十、气相色谱分析中如何选择载气的最佳操作条件? 1、载气的性质对柱效和分析时间有影响; 2、用相对分子质量小的载气时,最佳流速和最

色谱法分离原理word版

色谱法分离原理 一.教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二.重点与难点 1.塔板理论,包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数(n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三.教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线(色谱峰)所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法

四.学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相;自上而下运动的一相(一般是气体或液体)称为流动相;装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度,可将色谱法分类如下: 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱(G C) 根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的

高效液相色谱原理

高效液相色谱原理 1、概述 在所有色谱技术中,液相色谱法(liquid chromatography,LC)是最早(1903年)发明的,但其初期发展比较慢,在液相色谱普及之前,纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期,将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来,使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进,使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此,这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC),也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物,而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质,如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在,HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱,位居色谱法之首。 2、液相色谱流程图 3、原理 液相色谱根据不同的种类其原理也不相同,但是其大致过程不外乎根据不同化学物质的性质不同,把这些物质用色谱柱的方式分离再进行定性定量分析的过程。下表主要为液相色谱的种类及其原理和相对应的应用。

4、关于HPLC软件 高效液相色谱软件在数据处理方面是以时间为横坐标,以探测器探测的信号的强度为纵坐标形成一系列谱图。 高效液相色谱研发的难点不在软件,而在于电气电路控制系统的开发。 5、HPLC在不同领域的主要应用 HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用,可以用于绝大多数物质成分的分离分析,它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术,HPLC在部分领域的主要分析对象物质列于下表: 总之:高效液相色谱是一种应用范围相当广泛的测试仪器,不同种类的高效液相色谱有不同的原理。但是其结构基本上一致,因此只要更换其中的部分零件,就可以用于测试不同的物质。高效液相色谱从1969年至今,其发展速度令人惊奇,其应用的范围也逐渐拓展。在中国的市场上,随着医药、化工、环保行业的发展,其市场前景不可限量。 张红平 2011年9月2日

实例解析——高效液相色谱(HPLC)

实例解析——高效液相色谱(HPLC) 一、原理 利用不同物质在两相中(液液、液固、离子交换、尺寸排阻)具有不同的分配系数,当二者相对运动时候,物质在两相中反复多次分配,从而使得物质得到完全分离 二、适用范围 高沸点、热不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物、离子型样品、生化样品三、特点 高压、高效、高灵敏度 四、仪器组成 流动液贮存提供脱气,输液系统、进样系统、分离系统、检测系统,控制记录系统贮液瓶、高压泵、进样器、分离柱、检测器、记录仪 五、仪器选择 由实验条件确定是选用二元高压还是四元低压、一般来说,二元高压的准确度较高。四元低压是先将样品按比例混合再泵入,而二元高压是先泵入不同比例的溶剂再混合。确定采用的脱气系统,一般采用在线脱气。确定进样方式,人工手动六通阀进样,还是进样针自动进样,一个适用于少量样品,一个适用于大量样品。 选择检测器,如果是有较强的紫外吸收的可用紫外可见检测器(二极管阵列检测器),如果是芳香族化合物,可选用荧光检测器,对于离子可采用电导检测器。 六、实验条件优化 配置待测物质的标准溶液 1、色谱柱的确定 分析样本确定是采用何种类型的色谱柱 (1)分配色谱,两项间分配系数 流动相选用极性的物质(甲醇、乙腈、水)则固定相选择非极性物质。一般用 C18 ODS柱。 (2)吸附色谱, (3)离子交换色谱 各种离子与树脂上交换集团的交换能力不同。固定相:离子交换树脂,流动相 为无机酸、无机碱。常用于分离离子或者可解离的化合物 (4)排阻色谱法 配置含待测物质的标准品溶液,采用不同C18柱分离,检测,对照不同色谱图像,可得到分离效能最高的色谱柱 2、最佳流动相梯度洗脱程序的确定 梯度洗脱:按照一定的程度,不断改变流动相中个溶剂组成的比例以改变流动相的 极性。将色谱柱上不同的组分洗脱出来。 配置不同的梯度洗脱方案,用标准溶液进行试验,并选取能达到最高分离效能的梯 度洗过方案作为最佳流动相梯度洗脱程序 3、流动相的确定 在分离效能相似条件下选择更经济、毒性小的流动相 4、流速确定 流速太大,待分离组分来不及与固定相充分作用,故其中的组分较易被洗脱下来,出峰时间变短,而且柱压比较高,会引起泵负荷的增加,进而导致色谱柱的使用命

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