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EP6.0色谱分离技术(中文)

EP6.0色谱分离技术(中文)
EP6.0色谱分离技术(中文)

EP6色谱分离技术

色谱分离技术是多级分离方法,样品组分要分配到两相中,一种是固定相,一种是流动相。固定相可能是一种固体或者是固体上支持的液体或凝胶。固定相可以填充到柱中,或涂布为一层,或分散为一个薄膜等。流动相可能是气态或液体或超临界流体。分离原理可能是基于吸收、质量分布、离子交换等,或可能基于分子的理化性质不同,如粒度、质量、体积等。

本章包括系统适应性一般参数的定义和计算,以及一般适用性要求。在下列章节给出了分离原理、仪器和方法:

--纸层析(2.2.26)

--TLC色谱法(2.2.27)

--气相色谱法(2.2.28)

--液相色谱法(2.2.29)

--分子排阻色谱法(2.2.30)

--超临界流体色谱法(2.2.45)

定义

下列定义用于计算专论中的限度。

对于某些设备,某些参数(如信噪比)可以用生产商提供的软件计算。用户有责任确保软件中的计算方法与欧洲药典的要求相一致。如果不同,必需进行校正。

色谱图

一张色谱图是检测器响应值、流出浓度或其他数量的绘图的或其他标示,作为流出浓度、时间、体积或距离的一种测量。理想的色谱图是基线上出现高斯峰。

保留数据

保留时间和保留体积

洗脱色谱法中的保留测量可能是保留时间(t R),由色谱图中最大峰的位置直接进行定义。保留体积(V R)可以通过保留时间来计算:

V R=v×t R

t R=保留时间或沿基线从进针处到相应组分的最大峰垂直处之间的距离。

v=流动相的速率。

质量分布比率

质量分布比率(Dm)(也称为容量因子k’或保留因子k)规定如下:

固定相中溶质数量Vs

Dm==Kc

流动相中溶质数量V M

Kc=平衡分布系数(也称为分布常数)

Vs=固定相体积

V M=流动相体积

一个组分的质量分布比率可以使用下列公式从色谱图中测定:

t R-t M

Dm=

t M

t R=保留时间(或体积)或沿基线从进针处到相应组分的最大峰垂直处之间的距离。t M=保持时间(或体积):时间(或体积)或沿基线从进针处到一个未保留组分的最大峰垂直处之间的距离。

分布系数

在分子排阻色谱法中,一个特定柱子中的一个组分的洗脱性质可以通过分布系数(Ko)表示,计算公式如下:

t R-t o

Ko=

t t-t o

t R=保留时间(或体积)或沿基线从进针处到相应组分的最大峰垂直处之间的距离。t o=保持时间(或体积):时间(或体积)或沿基线从进针处到一个未保留组分的最大峰垂直处之间的距离。

t t=保留时间(或体积)或沿基线从进针处到相应的一个组分的最大峰垂直处之间的距离,这个组分可以全部通过固定相的小孔。

延迟因子

在平面色谱法中,延迟因子(R F)(也称为保留因子R f)是从原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。

b

R F=

a

b=分析物的移动距离

a=溶剂前沿的移动距离。

色谱数据

峰可以用峰面积(A)、或峰高(h)和半峰高的峰宽(w h)、或峰高和变形点之间的峰宽(w i)来定义。在高斯峰(图2.2.46.-1)中有如下关系:

w h=1.18w i

图2.2.46.-1

对称因子

一个峰的对称因子(As)(或拖尾因子)(图2.2.46.-2)计算如下:

w0.05

As=

2d

w0.05=在峰高的二十分之一处的峰宽,

d=最高峰的垂直处与二十分之一峰高处的的前边沿处之间的距离。

值1.0表示完全(理想)对称。

图2.2.46.-2

柱性能和理论板数

柱性能(表观效率)可以由在等温线、等度或等密度曲线的条件下获得的数据计算。理论板数(N)用下列公式表示,t R和w h必须用相同单位(时间、体积或距离)表

示。

N=5.54(t R/w h)2

t R=保留时间(或体积)或沿基线从进针处到相应组分的最高峰垂直处之间的距离。w h=半峰高处峰宽。

理论板数随组分、色谱柱和保留时间而变化。

分离数据

分离度(Rs)

用下面的公式计算两组分峰之间的分离度(Rs):

1.18(t R2-t R1)

Rs=

w h1+w h2

t R2>t R1

t R2和t R1=保留时间或沿基线从进针处到两个相邻峰的最高峰垂直处之间的距离。

w h1和w h2=半峰高处峰宽。

对应于基线分离的分离度应大于1.5.

如果峰之间不是基线分离,则上述公式不适用。

在定量平面色谱法中,使用移动距离代替保留时间。分离度可用下式计算:

1.18a(R F2-R F1)

Rs=

w h1+w h2

R F2和R F1是原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值(延迟因子)。

w h1和w h2是半峰高处的峰宽

a是溶剂前沿移动的距离。

峰谷比

在其它甾体检测中,当两峰之间的基线分离没有达到要求时,峰谷比(p/v)可以作为系统适用性的一个要求(图2.2.46.-3)。

p/v=Hp/Hv

Hp是较小峰的外推基线上的峰高;

Hv是两峰之间曲线的最低点与外推基线之间的高度。

相对保留时间

相对保留时间

相对保留时间(r)是由下式计算的:

t R2-t M

r=

t R1-t M

t R2是计算峰的保留时间

t R1是对照峰的保留时间(通常是样品峰)

t M是保持时间:沿基线从进针处到相应一个未保留成分最高峰垂直处之间的时间或距离。

未调整的相对保留时间(r G)是由下式计算的:

t R2

r G=

t R1

除非另有规定,专论中所指的相对保留时间是未调整的相对保留时间。

在平面色谱法中,使用延迟因子R F2和R F1代替保留时间t R2和t R1.

定量的精确性

信噪比

信噪比(S/N)影响定量的精确性,由下式计算:

S/N=2H/h

H是图2.2.46.-4中对照溶液色谱图中相关成分对应峰的峰高,从最高峰到垂直的信号基线。

h是空白进样后色谱图中背景噪音的范围,

重复性

响应值的重复性是用标准溶液的连续系列进样或点板的相对标准偏差的百分数来表示,用下面的公式表示:

y i是内标法中用峰面积、峰高、或峰面积比率表示的单个值;

y是单个值的平均值;

n是单个值的数量。

最大允许的相对标准偏差(RSDmax)由一系列规定限度的对照溶液进行计算,公式如下:

K是常数(0.349),从公式得到,0.6/√2表示B=1.0时6次进样要求的相对标准偏差。

B是在专论中规定的上限减去100%。

n是对照液重复进样次数(3≤n≤6)。

T90%,n-1是带有n-1个自由度的90%的概率水平的t分布(也叫学生分布)。

系统适应性

系统适应性检测代表方法的一个完整部分,用以确保色谱系统足够的性能。表观效率、质量分布比率、分离度、相对保留时间和对称因子是评估色谱柱性能的参数。可能影响色谱行为的因素包括组成、离子强度、流动相的温度和表观pH、流速、柱长、温度和压力、以及包括多孔性、粒度、粒子类型、比表面积、在反相情况下的化学改性的程度(用封端、炭载等表示)在内的固定相特性。

不同的样品在仪器上使用,必须进行确认,能够达到检验所要求的精度。

除非在专论中另有规定,否则下列要求必需完全满足。

--主峰的对称因子应在0.8和1.5之间,除非在专论中另有规定。一般情况下,这要求适用于专论中的检测和含量测定。

--标准溶液重复进样最大允许的相对标准偏差不超过表2.2.46.-1的值。这要求只适用于含量测定,不适用于其它甾体的检测。

--峰的检测限(对应于一个信噪比3)应低于其它甾体检测的忽略限度。

--峰的定量限(对应于一个信噪比10)应等于或小于其它甾体检测的忽略限度。

表2.2.46.-1重复性要求

进样次数3456

B%最大允许的相对标准偏差

2.00.410.590.730.85

2.50.520.740.92 1.06

3.00.620.89 1.10 1.27

色谱条件的调整

色谱检验中不同参数可以被调整以满足系统适应性标准,但不能根本地修改方法,调整限度列在下面的信息中。专论建立的时候已经验证过色谱条件。其中包含了系统适应性检测,以确保检测或含量测定时能达到要求的满意性性能的分离。但是,一般情况下,固定相是规定的,商业上的产品有很多变化,伴随着色谱行为的不同,色谱条件可能需要做一些调整以达到规定的系统适应性要求。尤其在反相液相色谱方法中,多个参数的调整不一定导致满意的色谱结果。在这种情况下,有必要用相同型号的色谱柱取代这个柱子(例如ODS硅胶柱),以显示要求的色谱行为。

对于关键参数,专论中清楚的规定了调整,以确保系统适应性。

多个调整对系统性能造成的累加效果应避免。

TLC和纸色谱

流动相的组成:较小溶剂成分的总量可以调整相对±30%或绝对±2%,选用更大的一个;对于在流动相中10%的较小组分,相对±30%的调整允许一个范围是7-13%,而一个绝对±2%的调整允许一个范围是8-12%,所以相对值更大;对于在流动相中5%的较小组分,相对±30%的调整允许一个范围是3.5-6.5%,而一个绝对±2%的调整允许一个范围是3-7%,所以在这种情况下绝对值更大。其他成分允许调整绝对

±10%。

流动相水成分的pH:±0.2pH,除非专论中另有规定,或者±1.0pH,当样品是中性物质时。

流动相中缓冲成份的盐浓度:±10%。

点样量:规定量的10-20%,如果使用精细粒度板(2-10um)。

在高性能板上,溶剂前沿移动距离不能低于50mm或30mm

液相色谱法

流动相的组成:较小溶剂成分的总量可以调整相对±30%或绝对±2%,选用更大的一个(见上面例子)。其他成分允许调整绝对±10%。

流动相水成分的pH:±0.2pH,除非专论中另有规定,或者±1.0pH,当样品是中性物质时。

流动相中缓冲成份的盐浓度:±10%。

检测器波长:不允许调整。

固定相:

--柱长:±70%

--柱内径:±25%

--粒径:最大减少50%,不允许增加。

流速:±50%。如果在专论中主峰的保留时间已规定,色谱柱内径改变,则流速必须调整。在确认阶段,如果专论中使用理论板数,则不允许减低流速。

温度:±10%,最大60℃.

进样体积:如果样品峰的检测和重复性达到满足,可以减少。

梯度洗脱:仪器的结构可能会明显地改变检测方法中规定的分离度、保留时间、相对保留时间。如果这种情况发生,可能是负载体积过多。

气相色谱法

固定相:

--柱长:±70%

--柱内径:±50%

--粒径:最大减少50%,不允许增加。

--涂膜厚度:-50%至100%

流速:±50%。

温度:±10%。

进样体积:如果样品峰的检测和重复性达到满足,可以减少。

超临界流体色谱法

流动相的组成:对于填充柱:较小溶剂成分的总量可以调整相对±30%或绝对±2%,选用更大的一个。毛细管柱系统不允许调整。

检测器波长:不允许调整。

固定相:

--柱长:±70%

--柱内径:±25%(填充柱);±50%(毛细管柱)

--粒径:最大减少50%,不允许增加(填充柱)。

流速:±50%。

温度:±10%.

进样体积:如果样品峰的检测和重复性达到满足,可以减少。

定量

--检测器响应值:检测器灵敏性是信号输出除以进入检测器的流动相中的物质的单位浓度或单位质量。检测器相对响应因子,一般用响应因子作参照,表示检测器相对于一个标准物质的灵敏性。修正因子与响应值因子成反比。

--外标法:被测试成分的浓度可以通过对比样品液中响应值(峰)和对照液中响应值(峰)获得。

--内标法:被测成分的总量可以通过内标物加入样品液和对照液进行计算。内标物不应与被测物发生反应;内标物必需稳定,并且不含与被测物保留时间相似的杂质。被测物的浓度可以这样计算:对比样品液中被测物和内标物的峰面积比率或峰高比率与对照液中被测物和内标物的峰面积比率或峰高比率。

--归一化法:被测物中一个或多个成分的百分含量是由这个峰面积与所有峰的峰面积总和的百分比计算的,峰面积总和不包括溶剂峰、试剂峰和忽略限度下的峰。

--校验程序:被测量或被评估的信号(y)和物质(x)总量(浓度、质量等)的关系需要检测,校验功能被计算。依靠反函数,由测量到的被分析物信号或评估的被分析物信号计算分析结果。

对于成分的含量和定量检测,外标法、内标法或校验程序在专论中可能都有描述,一般不采用归一化法。在其他甾体的检测中,一般采用外标法或归一化法。然而使用归一化法或外标法时,当样品液稀释用于对照时,其他甾体的响应值与自身是相似的(响应因子0.8至1.0),否则,文中应有修正因子。

当其他甾体检测中规定了杂质总量或单个杂质的定量检测时,选择一个合适阈值设定和合适的峰面积积分条件是非常重要的。在这种检测中,忽略限度(如低于不被考虑进行计算的限度的峰面积)一般是0.05%。因此,数据收集系统的阈值设定应至少是忽略限度的一半。当杂质峰与主峰未完全分离时,这个杂质峰面积积分时更适宜用峰谷对峰谷的方法。溶解样品的溶剂峰也可以忽略。

有机化学实验十柱色谱

实验十柱色谱 一.实验目的: 1. 学习柱色谱的原理及方法。 二.实验重点和难点: 1.学习柱色谱的原理及方法。 实验类型:基础性实验学时:4学时 三.实验装置和药品: 主要实验仪器:色谱柱(或25mL碱式滴定管) 25mL锥形瓶 普通漏斗玻璃棉或脱脂棉量筒试管电子天平烧杯 主要化学试剂:石油醚(600C—900C)丙酮中性氧化铝(100--200目) 500g 菠菜色素95%乙醇 四.实验装置图: 五.实验原理: 柱色谱法是色谱方法之一。 图 1 柱色谱装置色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。 (一)色谱法的基本原理: 是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配) 的不同,或其它亲 和作用的性能的差异,使混合物的溶液流经该种物质,进行反复的吸附或分配等作用,从 而将各组分分开。 (二)色谱法的分类: 1.根据组分在固定相中的作用原理不同,可分为吸附善谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。 2.根据操作条件的不同,可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相 色谱等类型。 (三)柱色谱原理: 柱色谱是化合物在液相和固相之间的分配,属于固--液吸附层析。 图1就是一般柱色谱装置。柱内装有”活性”固体(固定相) 如氧化铝或硅胶等。液 体样品从柱顶加入流经吸附柱时,即被吸附在柱的上端,然后从柱顶加入洗脱溶剂冲洗。由于固定相对各组分吸附能力不同,以不同速度沿柱下移,形成若干色带。再用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出,分别收集各组分,再逐个鉴定。 1.吸附剂:常用的吸附剂有:氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般 要经过纯化和活性处理。选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。吸 附能力与颗粒大小有关。颗粒太粗,流速快分离效果不好。颗粒小,表面积大,吸附能力 就高,但流速慢,因此应根据实际分离需要而定。色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性 三种。 2.溶质的结构与吸附能力的关系:化合物的吸附能力与分子极性有关。分子极性越强,

色谱分离技术

亲和色谱 亲和色谱是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术,它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。亲和色谱的显著特点: 具有其他分离技术所不能比拟的高选择性,且色谱过程操作条件温和,能有效地保持生物大分子高级结构的稳定性,活性样品的回收率也比较高。 所以亲和色谱被广泛用于酶、治疗蛋白、抗体、核酸、辅助因子等生物大分子以及细胞、细胞器、病毒等超分子物质的分离与纯化。 特别是对分离含量极少而又不稳定的活性物质最有效,经一步亲和色谱即可提纯几百至几千倍。 亲和色谱的基本过程: 把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基,在不伤害其生物功能情况下,与不溶性载体结合,使之固定化,装入色谱柱,然后把含有目的物质的混合液作为流动相,在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入色谱柱。目的物质被吸附,杂质直接流出。变换过柱溶液,使配基与其亲和物分离,获纯化的目的产物。 亲和色谱分离中经常采用的生物亲和关系 ①酶:底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子; ②抗体:抗原、病毒、细胞; ③激素、维生素:受体蛋白、载体蛋白; ④外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞; ⑤核酸:互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白; ⑥细胞:细胞表面特异蛋白、外源凝集素。 亲和色谱操作中的洗脱方法 在亲和色谱洗脱操作中,洗脱方法有两类,即普通洗脱法和专一性洗脱法。 普通洗脱法:与其他色谱分离方法一样,可以通过改变溶剂或缓冲液的类型,改变缓冲液的pH和离子强度,改变洗脱温度,以及添加促溶剂等措施进行洗脱。 专一性洗脱法:是指溶液中的配基、抑制剂或半抗原等物质与亲和层析剂上的配基,同时对生物活性物质产生竞争性的结合,从而达到洗脱的目的。一般说来,专一性洗脱可以获得很高的分辨能力。 但是,专一性洗脱剂的价格都比较昂贵,所以常与普通洗脱条件配合作用。 离子交换色谱 离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂,树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心,待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换,形成离子交换平衡,从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心,并随着流动相的运动而运动,最终实现分离。

硅胶吸附柱色谱技术实际应用

硅胶吸附柱色谱技术实际应用 2009-10-11 23:36:02| 分类:化工交流|字号订阅 色谱法,又称层析法.是一种以分配平衡为机理的分配方法.色谱体系包含两个相,一个是固定相,一个是流动相.当两相相对运动时,反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异,最后达到彼此分离的目的. 色谱法从发明到现在已有八十多年的历史.它是纯化和分离有机或无机物的一种方法. 色谱法按固定相的状态可分为柱色谱.平板色谱和棒色谱三种而实验室中最常用的是柱层析和薄层层析,以及它们之间的配合应用.[1] 柱层析[2] 1 吸附色谱地原理 在一定条件下,硅胶与被分离物质之间产生作用,这种作用主要是物理和化学作用两种.物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的范德华力.化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用. 2操作步骤 2.1 硅胶准备[3] 硅胶一般选用250-400目(即40-63μm直径的硅胶颗粒),根据ΔRf选用硅胶的用量. 2.2 实验仪器准备 一支玻璃色谱柱,一个铁架台,烧杯,锥形瓶,径口直径较大的玻璃漏斗,一支玻璃棒, 2.3 装柱[4] 2.3.1 吸附剂的加入 ①干法:将吸附剂一次加入色谱管,振动管壁使其均匀下沉,然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相,或将色谱管下端出口加活塞,加入适量的流动相,旋开活塞使流动相缓缓滴出,然后自管顶缓缓加入吸附剂,使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。

②湿法:将吸附剂与流动相混合,搅拌以除去空气泡,徐徐倾入色谱管中,然后再加入流动相,将附着于管壁的吸附剂洗下,使色谱柱表面平整。俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下,液面将柱表面相平时,即加试样溶液. 2.3.2试样的加入 ①将试样溶于层析时使用的流动相中,再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽后使呈松散状;将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解,可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。 2.4洗脱 [5] 除另有规定外,通常按流动相洗脱能力大小,递增变换流动相的品种和比例,分别分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不再含有时,再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。 2.5 检测 2.5.1 初步检测 当冲洗溶剂流出一定量后,可对流出液进行初步检测,并且将锥形瓶更换成小试管进行收集.一般只进行初步的快捷检测,因此通常是取一小薄层板,用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块,并安一定的次序编号.取一根内径为 0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液,点于薄层板的一个小格内,待半点干后,然后用物理的或化学的方法检测. 2.5.2 正式检测 ①点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样,如果冲洗溶液太稀,浓度太小,可先浓缩.点样的容器一般用玻璃毛细管,点样斑点的直径一般为 3-5mm. ②展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上行展开. ③展开剂:实用冲洗溶液. ④显色:一般常用物理检测法和化学检测法.物理检测法中首先有紫外光法,紫外光常用两种波长(254nm与365nm).其次是碘蒸气显色法.化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾.显色剂有通用显色剂和专用显色剂.通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液,喷雾后,有的化合物立即反应,但多数化合物需加热后经历数分钟才显色,不同化合物的反应不同,所以颜色也往往不同.专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂,利用化合物本身的特有性质,或

气相色谱分离技术

第三章气相色谱分离技术 第一节气相色谱系统 气相色谱法是一种很重要的,以气体为流动相,以液体或固体为固定相的色谱方法,气相色谱法(GC)有以下特点: (1)高选择性GC能够分离分析性质极为相近的物质。如氢的同位素,有机物的异构体。 (2)高效GC可在较短的时间内同时分离分析极其复杂的混合物。如用空心毛细管柱一次可以分析轻油中的200个组分。 (3)高灵敏度由于使用了高灵敏度的检测器,可以检测10-11-10-13克物质。检测浓度可达到ppt级。 (4)分析速度快GC一般只要几到几十分钟的分析时间,某些快速分析,一秒可以分析十几个组分。 GC法的应用相当广泛,在一千万个化合物中,大约有20%的物质可以用GC方法进行分析,如: 生物化学分析:GC一开始就是用于生物化学领域,气-液GC的创始人Martin首先进行了脂肪酸和脂肪胺的分析。 石油化工分析:用200m的毛细管GC法一次可以分析200个化合物。 环境分析:如水中有机物分析。 食品分析:如粮食中残留农药的分析。 药物临床分析:氨基酸、兴奋剂的分析。 法庭分析:各种物证鉴定。 空间分析:如飞船中气氛分析。 军工分析:如火药、炸药分析。

图3-1是GC的流程示意图。 9 图3-1气相色谱流程示意图 1—高压瓶,2—减压阀, 3—净化器,4—气流调节阀,5—进样口,6—气化室,7—色谱柱,8—检测器, 9—记录仪 气相色谱仪的种类很多,但主要由分离系统和检测系统组成。 3.1.1 分离系统 分离系统主要由气路系统、进样系统和色谱柱组成,其核心为色谱柱。 1.气路系统 气路系统指流动相载气流经的部分,它是一个密闭管路系统,必须严格控制管路的气密性,载气的惰性及流速的稳定性,同时流量测量必须准确,才能保证结果的准确性。载气通常用N2,He,H2,Ar等。 2.进样系统 进样系统包括进样装置和气化室。气体样品可以用注射器进样,也可用旋转式六通阀进样。气化室必须预热至设定温度。 3.色谱柱

柱层析分离的实验方法和技巧

柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。 一:柱子可以分为:加压,常压,减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二:关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm ×20cm的柱子);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等。

第九章凝胶渗透色谱讲解

凝胶色谱分析二〇一一年九月九日

第九章凝胶色谱分析 凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography, GPC),又称尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography, SEC),其以有机溶剂为流动相,流经分离介质多孔填料(如多孔硅胶或多孔树脂)而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱(GPC)的创立历程如下[2,5]: 1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质,观察到分子尺寸排除现象;1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品;1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料,以连续式高灵敏度的示差折光仪,并以体积计量方式作图,制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪,从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。 近年来,光散射技术(如图9-1所示,一束光通过一间充满烟雾的房间,会产生光散射现象。)广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱(GPC)分离技术相结合,可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数,也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前,该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具,在美国,日本及欧洲广为使用,国内近年来亦引进了此项技术。 入射光 散射光 图9-1光散射现象 9.1 基本原理 9.1.1凝胶渗透色谱分离原理 让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱,柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙(较大)和粒子内的通孔(较小)。如图9-2、图9-3所示,当待测聚合物溶液流经色谱柱时,较大的分子只能从粒子间的间隙通过,被排除在粒子的小孔之外,速率较快;较小的分子能够进入粒子中的小孔,通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后,不同相对分子质量的物质就被区分开了,相对分子质量大的在前面流出(其淋洗时间短),相对分子质量小的在后面流出(淋洗时间长)。从试样进柱到被淋洗出来,所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后,溶质的淋出体积与其分

柱色谱分离的操作和注意事项

特别注意:有机溶剂对身体特有害别是心肺;肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行!!!柱色谱是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望对大家能有所帮助。 1、柱子可以分为:加压,常压,减压压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 2、关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×20cm的柱子);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等。 3、关于无水无氧柱,适用于对氧,水敏感,易分解的产品可以湿柱,也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。这个我分离的次数很少,一般都是通过紫外灯查看的。 4、关于湿法、干法上样 湿法省事,一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。有的上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会出现,是因为硅胶对样品的吸附饱和这就应该先重结晶,得到大部分的产品后再柱分,如果不能重结晶那就不管它了,直接过就是了,样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差,能溶解的溶剂又不能上柱(比如DMF,DMSO等,会随着溶剂一起走,显色是一个很长的脱尾),这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1:1,我觉得是越少越好,但是要保证在旋干后,不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样品没有吸附在硅胶上)。溶剂的选择。当然是最便宜,最安全,最环保的了。所以大多选用石油醚,乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的,太贵了。二氯甲烷也有用的,但是要知道,它和硅胶的吸附是一个放热过程,所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡,天气冷的时候会好一些。甲醇,据说能溶解部分的硅胶,所以产品如果想过元素分析的话要留神,应该经过后继处理,比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少,要依个人的不同需要选择了。由于某些原因,用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛),我们这里是用2.5 L的塑料桶装的。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用,一方面环保,另一方面也能节省部分经费,当然比较忙的时候我是不回收的,太费事了。这里要注意的是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化,一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较合适,正好极性越

色谱技术简介

色谱技术简介 发布者:杭州科晓化工仪器设备有限公司发布时间:2007年1月30日 Audo look6.0下载引言 色谱法是1906年俄国植物学家Michael Tswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子,企图分离它们时而发现并命名的。各种色素以不同的速率通过柱子,从而彼此分开。分离开的色素形成不同的 色带而易于区分,由此得名为色谱法(Chromatography),又称层析法。其后的一个重大进展是1941年Martin和Synge 发现了液-液(分配)色谱法[Liquid-Lipuid(partition)Chromatography,简称LIC]。他们用覆盖于吸附剂表面的并与流动相不混溶的固定液来代替以前仅有的固体吸附剂。试样组分按照其溶解在两相之间分配。Martin和Synge 因为这一工作而荣获1952 年诺贝尔化学奖。在使用柱色谱的早期年代,可靠地鉴定小量的被分离物质是困难的,所以研究发展了纸色谱法(Paper Chromatography,简称PC)。在这种“平面的”技术中,分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。然后由于充分考虑了平面色谱法的优点而发展了薄层色谱法(Thin-Layer Chromatography,简称TLC),在这种方法中,分离系在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。 在Stah-l于1958年进行了经典性的工作将技术和所用材料加以标准化之后, 薄层色谱法方赢得了声誉。为了帮助提高纸色谱法或薄层色谱法对离子化合物的分离效率,可以向纸或板施加电场。这种改进了方法分别称作纸上电泳或薄层电泳。 新近发展起来的色谱法 气相色谱法是Martin和James于1952 年首先描述的,现已成为所有色谱法中最高级和最广泛使用的一种方法,它特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体,即便对于很复杂的混合物,其分离时间也仅为几分钟左右,这已属司 空见惯。高分辩率、分析迅速和检测灵敏等几种优点之综合使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种常规 方法。近年来,因为新型液相色谱仪和新型柱填料的发展以及对色谱理论的更深入了解,又重新引起对密闭柱液相色 谱法的兴趣。高效液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography,简称HPLC)迅速成为与气相色谱法一样广泛使用的方法,对于迅速分离非挥发性的或热不稳定的试样来说,高效液相色谱法常常是更可取的。 色谱法分类 色谱法有多种类型,也有多种分类方法。 (一)按两相所处的状态分类 液体作为流动相,称为“液相色谱”(liquid chromatograp-hy);用气体作为流动相,称为“气相色谱”(gas chromatogr-aphy)。固定相也有两种状态,以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相,所 以层析法按两相所处的状态可以分为: 液-固色谱(liquid-solid chromatography) 液-液色谱(liquid-liquid chromatography)

柱色谱实验操作方法

一、液-固色谱原理 液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术,柱色谱属于液-固吸附色谱。 当混合物溶液加在固定相上,固体表面借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分,以不同的作用强度被吸附在固体表面。 由于吸附剂对各组分的吸附能力不同,当流动相流过固体表面时,混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少,吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动,吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动,在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配,新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程,结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面,吸附强的组分移动在后面,吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动,各种化合物在色谱柱中形成带状分布,实现混合物的分离。 二、柱色谱分离条件 (1)固定相选择 柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。

吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时,非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用,吸附较弱;极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用,有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为: 成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强,在氧化铝上的吸附越强。 常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等(表1)。 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4~4.5,用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质;中性氧化铝pH值为7.5,用于分离中性物质,应用最广;碱性氧化铝pH为9~10,用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。

吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低,活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 硅胶是中性的吸附剂,可用于分离各种有机物,是应用最为广泛的固定相材料之一。 活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。 吸附剂的粒度越小,比表面越大,分离效果越明显,但流动相流过越慢,有时会产生分离带的在重叠,适得其反。 (2)流动相选择 色谱分离使用的流动相又称展开剂。 展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。 在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配,强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多,弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多,随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。 在氧化铝柱中,选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带,流出色谱柱。 当一种溶剂不能实现很好的分离时,选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物,对其它组分不能展开洗脱,需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。 三、柱色谱分离操作

柱色谱分离技术

实训操作规程 柱色谱分离技术操作规程 1.装柱 装柱的好坏直接影响分离效率。装柱之前,先将空柱洗净干燥,然后将柱垂直固定在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔,就取一小团脱脂棉,用玻璃棒将其推至柱底,再在上面铺上一层厚0.5~1cm的石英砂,然后进行装柱。 装柱的方法有湿法和干法两种。 ①湿法装柱:将吸附剂用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状,在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂,再将调好的吸附剂边敲打柱身边倒入柱中,同时打开柱子的下端活塞,在色谱柱下面放一个干净并干燥的锥形瓶,接收洗脱剂。当装入的吸附剂有一定的高度时,洗脱剂流下速度变慢,待所用吸附剂全部装完后,用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂,并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。在此过程中,应不断敲打色谱柱,以使色谱柱填充均匀并没有气泡。柱子填充完后,在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂或覆盖 一片比柱内径略小的圆形滤纸。 ②干法装柱:在色谱柱上端放一个干燥的漏斗,将吸附剂倒入漏斗中,使其成为细流连 续地装入柱中,并轻轻敲打色谱柱柱身,使其填充均匀,再加入洗脱剂湿润。 2.加样 液体样品可以直接加入到色谱柱中,如浓度低可浓缩后再进行分离。固体样品应先用少量的溶剂溶解后再加入到柱中。在加入样品时,应先将柱内洗脱剂排至稍低于石英砂表面后停止排液,用滴管沿柱内壁把样品一次加完。在加入样品时,应注意滴管尽量向下靠近石英砂表面。样品加完后,打开下旋塞,使液体样品进入石英砂层后,再加入少量的洗脱剂将壁上的样品洗脱下来,待这部分液体的液面和吸附剂表面相齐时,即可打开安置在柱上装有洗脱剂的滴液漏斗的活塞,加入洗脱剂,进行洗脱。 3.洗脱 在洗脱过程中,样品在柱内的下移速度不能太快,如果溶剂流速较慢,则样品在柱中保留的时间长,各组分在固定相和流动相之间能得到充分的吸附或分配作用,从而使混合物,尤其是结构、性质相似的组分得以分离。但样品在柱内的下移速度也不能太慢(甚至过夜), 因为吸附剂表面活性较大,时间太长有时可能造成某些成分被破坏,使色谱带扩散,影响分离效果。因此,层析时洗脱速度要适中。通常洗脱剂流出速度为每分钟5~10滴,若洗脱剂下移速度太慢可适当加压或用水泵减压,以加快洗脱速度,直至所有色带被分开。 4.收集 如果样品中各组分都有颜色时,可根据不同的色带用锥形瓶分别进行收集,然后分别将洗脱剂蒸除得到纯组分。如果没有颜色的,只能分段收集洗脱液,再用薄层色谱或其他方法鉴定各段洗脱液的成分,成分相同者可以合并。 1.吸附剂的选择及处理 吸附剂分为无机吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙,有机吸附剂如纤维素、淀粉、蔗糖、聚酰胺等。一般来说,所选择吸附剂应有较大的比表面积和足够的吸附能力:对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力,即有足够的分辨力;与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应;吸附剂颗粒均匀。 吸附剂一般先经过筛获得均匀的颗粒(100-200目),对含有杂质的吸附剂可用有机

蛋白质色谱分离方法

蛋白质色谱分离方法 摘要蛋白质是生命有机体的主要成分,在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以分离和检测蛋白质一直是人们研究的热点。依据蛋白质的物理、化学及生物学特性,已有多种分离手段,如:超滤法、SDS-PAGE、亲和层析等,其中,液相色谱分离技术由于具有重复性好、分辨率高等优势在蛋白质分离检测中得到了广泛的应用。 关键词高效液相色谱高效离子交换色谱反相高效液相色谱高效凝胶过滤色谱高效亲和色谱 一、引言 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务,到目前为止,还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质完全的从复杂的混合物中提取出来,但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。 1、蛋白质纯化的总战略考虑 蛋白质回收要采用简便易行的方法尽可能多地将目标蛋白从细胞培养上清液、细菌破碎液或组织匀浆中提取出来,收率至少达到90%以上。然后进一步作精纯化,这第一步要求去掉大部分杂蛋白,同时要使样品的体积得到充分浓缩,一般要求要浓缩几十到几百倍,粗提液的体积大大缩小,便于下一步精纯化。而且每一步都要做电泳判断纯化效果。 2、蛋白质分离纯化技术的选择 要尽可能多地了解目标蛋白的结构、氨基酸组成、氨基酸序列,以及蛋白质的空间结构所决定的物理、化学、生物化学和物理化学性质等信息,根据不同蛋白质之间的性质差异或者改变条件使之具有差异,利用一种或多种性质差异,在兼顾收率和纯度的情况下,选择最佳的蛋白质提纯方法。 二、色谱技术简介 1、色谱分离技术基本概念 色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术,是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数,当两相作相对运动时,这些物质随流动相一起运动,并在两相间进行反复多次的分配,从而使各物质达到分离。当流动相中携带的混合物流经

色谱分离技术原理及其的应用

色谱法的最早应用是用于分离植物色素,其方法是这样的:在一玻璃管中放入碳酸钙,将含有植物色素(植物叶的提取液)的石油醚倒入管中。此时,玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗,随着石油醚的加入,谱带不断地向下移动,并逐渐分开成几个不同颜色的谱带,继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素,并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。现在的色谱法早已不局限于色素的分离,其方法也早已得到了极大的发展,但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理:由以上方法可知,在色谱法中存在两相,一相是固定不动的,我们把它叫做固定相;另一相则不断流过固定相,我们把它叫做流动相。色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。使用外力使含有样品的流动相(气体、液体)通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时,混合物中的各组分与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异,与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同,随着流动相的移动,混合物在两相间经过反复多次的分配平衡,使得各组分被固定相保留的时间不同,从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合,实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法:色谱分析法有很多种类,从不同的角度出发可以有不同的分类方法。从两相的状态分类:色谱法中,流动相可以是气体,也可以是液体,由此可分为气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。固定相既可以是固体,也可以是涂在固体上的液体,由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。高效液相色谱法是继气相色谱之后,70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相色谱法,流动相在常压下输送,所用的固定相柱效低,分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论,流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9 107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。因此,高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。 液相色谱法 气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果,而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时,定性鉴定就很困难,这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。 原理和分类 液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同,液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式,液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来,在液相柱色谱系统中加上高压液流系统,使流动相在高压下快速流动,以提高分离效果,因此出现了高效(又称高压)液相色谱法。 液固吸附色谱 高效液相色谱中的一种,是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有

色谱法的分类及其原理

色谱法的分类及其原理 (一)按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法2、液液色谱法 (二)按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography):柱色谱法是将固定相装在一 金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱,试样从柱 头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法(paper chromatography ):纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体,把试样点在滤纸上,然后用溶剂展开,各组分在滤纸的不同位置 以斑点形式显现,根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC):薄层色谱法是将适 当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层,然后用与纸色谱法类 似的方法操作以达到分离目的。 (三)按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同,又可将其分为: 1、吸附色谱法:利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物(例如,分离醇类与芳香烃)。

2、分配色谱法:利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色 谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法:利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法,利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离,而且广泛地应用于有机和生物物质,如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法:是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法,体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻,较早的淋洗出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。这样,样品分子基本按其分子大小先后排阻,从柱中流出。被广泛应用于大分子分 级,即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法:相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相,利用与固定相不同程度的亲和性,使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质(或抑制剂)、抗原与抗体,激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用,使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物,用来作为层析用固定相,将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获,达到纯化的目的。可用于分离活体高分子物质、过滤性病毒及细胞。或用于对特异的相互作用进行研究。 (四)按原理 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程,不同的物质在两相之间的分配会不同,这使其随流动相运动速度各不相同,随着流动相的运动,混合物中的不同组分在固定相上相互分离。

色谱法分离原理

第十四章色谱法分离原理 一.教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二.重点与难点 1.塔板理论,包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数 (n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三.教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线(色谱峰)所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法 四.学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有

碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相;自上而下运动的一相(一般是气体或液体)称为流动相;装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度,可将色谱法分类如下: 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱(G C) 根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的 一薄层有机化合物液体),又可分为气固色谱(G S C)和气液色谱(GL C)。液体为流动相的色谱称液相色谱(LC) 同理液相色谱亦可分为液固色谱(L SC)和液液色谱(L LC)。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱(SF C)。随着色谱工作的发展,通过化学反应将固定液键合到载体表面,这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱(CB PC). 2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法,称为吸附色谱法。 利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法,称为离子交换色谱法。

毛细管胶束电动色谱分离技术

基本原理 毛细管电色谱(Capillary electrochromatography, 简称CEC)是在毛细管中填充或在管壁涂布、键合液相色谱的固定相,然后在毛细管的两端施加高压直流电,在电场作用下产生电渗流(Electroosmotic flow ,简称EOF),流动相在电渗流的驱动下通过色谱柱。对中性化合物,其分离过程和HPLC类似,即通过溶质在固定相和流动相之间的分配差异而获得分离;当被分析的物质在流动相中带电荷时,除了和中性化合物一样的分配机理外,自身电泳淌度的差异对物质的分离也起相当的作用。 毛细管电色谱(capillary electro chromatography,CEC)以内含色谱固定相的毛细管为分离柱,兼具毛细管电泳及高效液相色谱的双重分离机理,既可分离带电物质也可分离中性物质。毛细管电色谱法是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法。 因此,毛细管电色谱法可以说是HPLC和HPCE 的有机结合,它不仅克服了HPLC 中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展,而且柱内无压降,使峰扩展只与溶质扩散系数有关,从而获得了接近于HPCE 水平的高柱效,同时还具备了HPLC 的选择性。 HPLC是用压力驱动流动相。流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。流速在管中呈抛物线轮廓,因而造成了色谱峰谱带的展宽,降低了柱效。而CEC是采用电场推动流动相。其线速度是与柱的直径和填微粒的大小无关的,因而在毛细管中几乎没有流速梯度。谱带展宽效应相应的就十分小。这点是CEC与HPLC的本质差别,也是CEC

效率高于HPLC的根本。 依靠电渗流(EOF)和电渗流结合压力流推动流动相,使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附、分配平衡常数的不同和电泳速率不同而达到分离分析。 仪器设备: 毛细管电色谱的早期研究是在改装的CE商品仪器上进行的,随着研究的深入和对研究前景的良好预期,现在已有商品仪器既可进行电泳模式也可方便地进行电色谱研究。目前,主要是Beckman 公司的P/ACE 系列和HP公司的HP3D系列。检测器根据分析样品性质的不同,可选UV 检测器( 包括DAD ) 、电化学检测器、LIF 及CE-MS等。 类型:在毛细管电色谱(CEC)中,色谱柱是电色谱的心脏,按照固定相的装填方式不同可以分为[7]:填充毛细管电色谱(PCCEC),开管毛细管电色谱(OTCEC),整体式毛细管电色谱(MCEC)。PCCEC是将固定相装填在毛细管中,OTCEC是将固定相涂渍或键合在毛细管内壁上,MCEC是通过在毛细管内原位聚合或固化的方法,制成的具有多孔结构的整体式固定相。根据分离过程中驱动力的不同可以将毛细管电色谱分为电驱动和压力驱动电色谱。前者是靠电渗流作为驱动力,这种情况下样品区带可以保持塞状流型,分离效率比较高。在最初的研究中人们都使用电驱动电色谱。压力驱动是指除了使用电渗流作为驱动力外,同时可以使用压力作为驱动力,这样可以加快分析速度,便于梯度洗脱,减小气泡生成的可能性。其缺点是流体力学所引起的抛物线流型使柱效有所损失,一般的操作过程中所使用的压力都

分离技术思考题

现代分离技术思考题 1、分离混合物的一般方法有哪些?试提出分离下列混合物的满意方法: ①环己酮与醋酸; ②对硝基苯酚和邻硝基苯酚; ③苯甲醛和水杨醛。 2、简要叙述色谱法的分离原理及其特点。 3、什么是色谱分离法?其本质和特点是什么? 4、试述塔板理论在解释色谱分离过程中的作用及其的不足。 5、试述Van Deemter方程的理论根据及其式中各项的含意。 6、程序升温气相色谱法适用于哪些类型样品的分析? 7、裂解气相色谱分析的基本原理是什么?它在应用上有哪些局限性? 8、从分离原理、仪器构造、及应用范围简述GC与HPLC的异同点。 9、CC、TLC和HPLC之间的相同与不同是什么?HPLC为什么不能完全代替CC和TLC? 10、利用色谱方法进行定量分析时,为什么要加入内标物?什么情况下可以不加内标物? 11、什么叫梯度洗脱?它与气相色谱中的程序升温有何异同? 12、什么是化学键合固定相?它的突出优点是什么? 13、高效液相色谱法是如何实现高效和高速分离的(与经典的柱色谱比较)? 14、在液相色谱中,提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 15、在气相色谱定量分析中为什么要测校正因子?如何测量?什么情况下可以不测? 16、什么是键合固定相?它与机械涂渍的固定相相比有哪些特点? 17、在分配色谱中,如何调整保留因子k? 18、简述在气相色谱和液相色谱中如何调整选择因子? 19、在以氧化铝为填料的HPLC中,用苯/丙酮为流动相进行梯度洗脱,试指出在不断冲洗 柱子的过程中,应该增加还是降低苯的比例?为什么? 20、根据联用技术的,你认为液相色谱与质谱联用时,在接口处应考虑哪些问题? 21、什么是抑制柱?为什么要使用它? 22、何谓气体的超临界温度和超临界压力?何谓超临界流体? 23、超临界流体的哪些性质在色谱分离中是重要的? 24、试指出超临界流体的仪器与气相色谱仪和液相色谱仪有哪些区别? 25、与液体萃取相比较,超临界流体萃取有何优点? 26、当用超临界CO2为流体时,试指出下述的改变将如何影响超临界流体色谱中的洗脱时 间? (1)恒定压力和温度,增加流速; (2)恒定温度和流速,增加压力; (3)恒定压力和流速,增加温度。 27、在超临界流体萃取中,(1) 在线和离线过程有何区别?(2) 静态和动态萃取有何不同? 28、毛细管区带电泳的原理是什么?

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