高效液相实验报告

篇一：高效液相色谱实验报告

高效液相色谱实验报告

一、实验目的

1 了解液相色谱的发展历史及最新进展2学习液相色谱的基本构造及原理

3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过hplc 分离测定来对目标化合物的分析鉴定。

二、实验原理

液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离

的目的。当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微

小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。液相色谱与气相色谱相比，最

大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在

已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。

高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸

点及热稳定性差的有机化合物。 80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应

用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。

三、高效液相色谱的分类

吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色

谱法

四、高效液相色谱仪的基本构造

高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。 1 输液系统：

包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。贮液装置用于存贮足够量、符合hplc 要求的流动相。高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，

因此需要高压泵输送流动相。2进样系统：

将待测的样品引入到色谱柱的装置。液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证

柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、

进样两项功能。 3 分离柱：

色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。商品化的

hplc 微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换

树脂）等的粒度通常在3μ m、 5μ m、7μ m、以及 10μ m。采用的固定相粒度甚至可以达到1μ m，而制备色谱所采用的固定相粒度通常大于10μ m。 hplc 填充柱效的理论值可以达到50000/m～ 160000/m 理论板，一般采用100-300mm的柱长可满足大多数样品的分析的需要。

由于柱效内、外多种因素的影响，因此为使色谱柱达到其应有的效率。应尽量的减小系统的

死体积。 4 检测系统：

hplc 检测器分为通用型检测器和专用型检测器两类。通用型检测器可连续测量色谱柱流出物

（包括流动相和样品组分）的全部特性变化。这类检测仪器包括示差折光检测器、介电常数检

测器、电导检测器和磁光旋转检测器。这类检测器适用范围广，但是对于流动相有响应，

受温度变化、流动相流速和组成变化的影响，检测灵敏度低，不能用于梯度洗脱的分离模式。

专用型检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，可用于测量被分离组分某类特性的

变化。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、质谱检测器、放射性检测器。 5 数据处理系统：

数据处理系统可以分为数据处理系统和专用智能处理系统两类，前者可以完成一般的色谱数

据处理任务，有些软件可以实现部分仪器的控制功能。前者即一般的色谱工作站，后者通常

称之为专家系统。

五、实验数据

数据一：数据二：

1

1ｈｐｌｃ－ｌ

六、高效液相色谱的使用中的注意事项

流动相：

1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时

注意区分水系膜和油系膜的使用范围；

2、水相流动相需经常更换（一般不超过 2 天），防止长菌变质；样品：

1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；

2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动

相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；

手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～ 5 倍；色谱柱：1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如 ph 值范围、流动相类型等； 2 、

使用符合要求的流动相； 3 、使用保护柱；

4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。

5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6 、不要高压冲洗柱子；

7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；篇二：分析实验报告高效液相色谱

华南师范大学实验报告

学号：专业：年级班级：课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中

的苯和甲苯实验时间：

一、 [ 实验目的 :]

1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法 2 、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术二、 [ 实验原理 :]

高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相

色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速

分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。

其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的

分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，

通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。三、 [ 仪器和试剂 :]

1. 主要仪器：岛津液相色谱仪(lc-10at)[配有紫外检测phenomenexo 柱 ] ； 10 μ l 微量注射器 2 、试剂：甲醇、水

苯和甲苯混合待测溶液苯标准溶液： 2.0 μl/ml

甲苯标准溶液： 2.0 μl/ml苯、甲苯混合标准溶液： 1.0 μ l/ml、2.0 μl/ml 、5.0 μ l/ml 、10.0μ l/ml 四、 [ 实验步骤 ]

1、按操作规程开机。

2、 . 选择合适的流动相配比，优化色谱条件

通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。

调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min 。柱温 30℃，检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析

在最佳条件下，待基线走稳后，用 10μ l微量注射器分别进样10μ l 苯和甲苯混合待测溶液， 10μ l 苯标准溶液（ 2.0 μ l/ml ）和 10μ l甲苯标准溶液（ 2.0 μl/ml ）(微量注射器用甲

醇润洗 3～ 5 遍 ) ，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。

定量分析

在最佳条件下，待基线走稳后，用10μ l 微量注射器分别进样 1.0 μ l/ml、 2.04 、苯、甲苯μl/ml 、 5.0

μ l/ml 10.0 μ l/ml的苯和甲苯混合标准溶液10μ l 。观察并记录各色谱图上的保留时间和峰

面积。绘制苯和甲苯混合标准溶液峰面积与相应浓度的标准曲线 5 、苯和甲苯混合待测溶液分析

根据得到的苯和甲苯混合待测溶液的液相色谱图上显示的峰面积值，从绘制的标准曲线上查

出苯和甲苯混合待测溶液中苯和甲苯的各自的浓度。六、实验数据处理及分析 1 、色谱条件优化

2.00

色谱

1.75

70%

1.50

1.251.00

0.75

0.50

0.250.00

min

分析：本次实验分别选择了甲醇：水 =60%： 40%， 70%： 30%，80%： 20%的溶剂配比，通过比较不同溶剂配比条件下，甲苯和苯的峰宽、保留时间从而确定采用甲醇：水 =80%：20%作为本次实验的最佳色谱条件。 2 、定性分析

5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0-0.5

μmin

分析：在同一色谱操作条件和进样量下，分别测定试样溶液中苯和甲苯组分及已知苯和甲苯

纯物质的保留时间，并将其色谱峰、保留时间与对应的已知苯和甲苯纯物质进行比较，两者

基本相同，从而确定混合样品中含有苯和甲苯。 3 、定量分析

苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为： 1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml。

4、未知样品浓度

七、结果讨论

1、实验中为什么采用标准曲线法作为定量的方法？

答：因为实验中待测溶液的组分只有苯和甲苯两种物质，组分比较简单。只要在实验过程中，严格控制且定量进样，就能采用操作、计算简便的标准曲线法得出准确的实验结果。若采用

归一化法或内标法，虽然能得到准确更高的实验结果，但由于实验操作、计算复杂，不能快

速分析，故实验中采用标准曲线法作为定量的方法。

2．在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液 - 液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。 3 ．选择流动相时应注意的几个问题

（ 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。

（ 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

（ 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还

应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

4．影响分离的因素与提高柱效的途径

1）．液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途

径，降低固定相粒度可提高柱效。

2）．液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质；（恒温） 3）．改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。 5. 高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：

(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；

(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；

(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动

相中约小 4~5 个数量级；

(4)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需

要，因而提高了高效液相色谱的分辨率（柱效能）；

(5)高效液相色谱采用 5~10lm 细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩篇三：高效

液相实验报告

化学与环境化学科学学院分析化学骆洪伟 20144015016 高效

液相实验报告

一、实验目的

1.了解高效液相的实验原理。

2.学习并掌握高效液相色谱仪(hplc) 的操作步骤。二、

实验原理

高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流

动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶

液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸

附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内

流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、 hplc 的介绍及操作步骤

高效液相色谱仪主要包括高压输送系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统及

梯度洗脱等辅助装置。其工作流程如图 1 所示。 1. 高压输液系统

高压进样系统的作用是提供足够恒定的高压，使流动相以稳定的流量快速渗透通过固定相。高

压输液系统由贮液器、高压泵、过滤器和梯度洗脱装置组成，其核心部件是高压泵，要求

高压泵具有输出压力 (1.5 × 107～ 4.5 × 107pa) ，输出流量恒定 ( 精度 0.1ml ·min-1) ，流量设定范围可调。梯度洗脱装置的作用是在分离过程中，按一定程序连续改变流动相中多种不同

性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩

短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。此外，还附有加热

脱气、超声波脱气等装置，以排除溶解在流动相或试样中的气体。

2.进样系统

在高效液相色谱中，一般采用旋转式六通阀于高压下进样。采用旋转式六通阀进样的优点是

进样量可变范围大，耐高压，宜于进样自动化，但易造成色谱峰柱前扩展。

3.分离系统

液相色谱柱一般采用内壁抛光的优质不锈钢管或厚壁玻璃管。为使工作压力不致过高，柱长

都比较短，一般在 5～ 30cm，柱径为 4～ 5mm。柱子的填充取决于柱填料的性能，对于生物胶

或离子交换树脂等，因遇到溶剂会膨胀，所以必须采用匀浆湿法填充。为防止颗粒大的填料

先沉降而产生分层现象，可采用等密度溶剂 ( 四氯乙烷和四氯乙烯混合物 ) 配成匀浆。用高压泵将其快速压入装有流动相的色谱柱中，经冲洗后，即可使用。

4.检测记录系统

高效液相色谱检测器要求具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积小等特点，且

对温度和流量的变化不敏感。目前，液相色谱常用检测器有紫外光度检测器、示差折光检

测器、荧光检测器和电化学检测器等。

5.hplc操作步骤

(1)过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

(2)对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20 分钟。

(3)打开 hplc 工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 (4) 进入 hplc 控制界面主菜单，点击manual ，进入手动菜单。

(5)有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的

出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual 菜单下，先点击purge ，再点击start

，冲洗时速度不要超过10ml· min-1 。

(6)调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要

超过 2000。点击 injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

(7)设计走样方法。点击 file ，选取 select?users?and?methods ，可以选取现有的各种走样

方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测

器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括： a. 进样前的稳流，一般2-5 分钟； b. 基线归零； c. 进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

(8) 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走

完后，点击postrun ，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，

洗掉剩余物。

(9)关机时，先关计算机，再关液相色谱。

(10)登记。

四、注意事项

1.泵的使用和维护注意事项

为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：①防止任

何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，

因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常

用的方法是滤过，可采用millipore滤膜（0.2μ m或0.45μ m）等滤器。泵的入口都应连接

砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。②流动相不应含有任何腐蚀性物质，

含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓

冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由

于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞

等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶

剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇- 水）。

③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封

环，最终产生漏液。

④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无

法正常工作。

如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障：

①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵

在较大流量（如5ml/min ）下运转，将气泡排尽，也可用一个50ml 针筒在泵出口处帮助抽出

气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。②压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要

排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内

有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分

堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如 4mol/l硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。

③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。

检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

2.梯度洗脱

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须

充分重视：①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂

在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合

时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求

更高，以保

证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂

中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止

混合时产生气泡。

③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘度

都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两

倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。

④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30 倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

3.溶剂过滤头的清洗

①取下过滤头放在(1:4,v/v)的硝酸溶液烧杯中超声清洗

清洗 10 分钟；

③用吸球吹出过滤头中的液体；

④再用蒸馏水超声清洗10 分钟；

⑤用吸球吹净过滤头中的水份；

⑥将过滤头重新插入溶剂瓶中( 正相系统注意将过滤头烘干

4.流动相的更换15 分钟；

) 。

②取出后用蒸馏水超声

①将新流动相置于储液瓶中；

②打开放空阀，启动泵使新的流动相从入空阀出口流出20ml 左右；

③关闭放空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接端卸开，用小容器放置于过样阀的出口处；

④启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出10ml 左右；

⑤重新连接色谱柱，设定适当流速，当流动相流出约30 倍于色谱柱体积，并且检测器基线平衡后，流动相更换完毕。

waters超高效液相色谱

超高效液相色谱(UPLC?)简介 UPLC原理基础 随着科学技术的进步，液相色谱用户对液相色谱技术的 要求也不断提高，他们需要“更快地得到更好的结果”。因 此超高效液相色谱（UltraPerformance LC?）概念的提出也 就十分自然；简单的说：UPLC是用HPLC的极限作为自己的起 点，把分离科学推向一个新领域。 沃特世公司引入UPLC的概念是由研究著名的van Deemter 方程式及其曲线开始。 由van Deemter曲线可以得到以下几点启示: 首先,颗粒度越小柱效越高；其次,不同的颗粒度有各自 最佳柱效的流速；最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高 流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。所以 降低颗粒度不但能提高柱效，同时还能提高分析速度。 使用更高的流速会受到色谱柱填料耐压及仪器耐压的 限制。反之；如果不用到最佳流速，小颗粒度填料的高柱效 就无法体现。 此外；更高的柱效需要更小的系统体积（死体积）、更快的检测速度等一系列条件的支持，否则小颗粒度填料的高柱效同样无法充分体现。 因此；要真正创建一个全新的分离科学领域－ UPLC，必须解决以下几个问题： 1. 大幅度提高色谱柱的性能:第一要解决小颗粒填料的耐压问题，第二要解决小颗粒填 料的装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。 2. 高压溶剂输送单元（超过15,000psi） 3. 完善的系统整体性设计，降低整个系统的体积，特别是死体积,并解决超高压下的耐 压及渗漏问题。 4. 快速自动进样器，降低进样的交叉污染 5. 高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问题 6. 系统控制及数据管理，解决高速数据的采集、仪器的控制问题 新型的色谱填料及装填技术 UPLC分离只有在新型的、耐压而且颗粒度分布范围很窄的1.7μm颗粒填料合成出来之后才有可能实现。 色谱柱技术应该涵盖几个方面的内容：首先是填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括：耐高压、耐酸碱等等。其次是颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料。最后是装填技术，以保证既能堵住颗粒不使其外流，又不至于引起反压的大幅升高。 沃特世公司的ACQUITY UPLC?BEH色谱柱使用了更严格的筛分技术,使1.7μm填料的分布很窄，并且使用了全新筛板（专利申请中）及其它色谱柱硬件（柱管及其连接件），在超过20,000psi的压力下装填。沃特世公司为此安装了一条新的色谱柱装填生产线及新的测试设备。因此；ACQUITY UPLC色谱柱的性能及质量比目前的HPLC柱有了质的飞跃。 基于1.7 μm小颗粒技术的UPLC，与人们熟知的HPLC技术具有相同的分离原理。不同的是：UPLC不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年来不得不在速度和分离度之间忍痛割舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和高反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。(见下图)

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。

4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省

(沃特世)UPLC超高效液相色谱介绍

UPLC超高效液相色谱（沃特世） 主要特点 超高速度 1.小颗粒填料色谱柱能超乎寻常地提高分析速度而不降低分离度 2.显著增加样品的通量，提高工作效率，降低分析成本 3.节省以往一向耗时的方法开发与认证的时间 超高灵敏度 1.小颗粒技术和整体化的仪器设计，UPLC?能在改善分离度的同时提高灵敏度 2.更高的柱效和更窄的色谱峰，意味着更高的色谱峰高和更高的灵敏度 3.在得到超高分离度和超高速度的同时能够得到超高灵敏度 超高分离度 1.利用高效创新小颗粒填料（1.7μL），获得超强分离能力 2.超低扩散体积，充分发挥小颗粒填料分离能力 3.超高分离度，适合复杂混合物的分离分析 超级创新 为满足色谱实验室对历史追踪不断增长的需求，每根ACQUITY UPLC?色谱柱出售时均带一个永久性的eCord，它能记录进样次数，最高的反压和柱温，其中还含有由沃特世公司提供的该色谱柱的分析测试合格证书。色谱柱安装后，智能化的芯片会自动地把关键参数采集进入色谱柱的历史文档，并记录色谱柱整个寿命周期的历史。该记录不能被删除。 技术参数 最大操作压力：15000psi（1mL/min） 溶剂输送精度：0.075%RSD或0.02minSD 流速范围：0.010-2.000mL/min，增量0.001mL/min 梯度曲线：11种。包括线性、凹线、凸线和两种步进梯度变化 有效系统体积:<140μL，与系统反压无关。带标准混合器 溶剂选择:最多四种。可在A1与A2和B1和B2之间选择 交叉污染:0.005%或2nL 进样范围:0.5-50μL 进样精度:<0.3%RSD 进样线性:>0.999 样品室温度控制:4 - 40℃ 色谱柱历史追踪:使用eCord技术 检测器配置:紫外可见检测器、光电二极管矩阵检测器、蒸发光散射检测器以及所有质谱检测器 超高速度,超高灵敏度,超高分离度,超级创新 为满足色谱实验室对历史追踪不断增长的需求，每根ACQUITY UPLC?色谱柱出售时均带一个永久性的eCord，它能记录进样次数，最高的反压和柱温，其中还含有由Waters公司提供的该色谱柱的分析测试合格证书。色谱柱安装后，智能化的芯片会自动地把关键参数采集进入色谱柱的历史文档，并记录色谱柱整个寿命周期的历史。该记录不能被删除。

高效液相色谱法测定甲硝唑的含量

实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤

Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

高效液相色谱法测定氨基酸

脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案 1、仪器与试药 1.1 仪器 1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH 型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-Pak TM C18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国） 1.2 药品与试剂 16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制品检定所提供。 脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013. 乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果 2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluent A浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml 1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤，超声，脱气，备用。）；流动相B为60% HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。

时间 (min) 流速 (ml/min) % A % B 曲线 起始 1.0 100 0 * 0.5 1.0 98 2 6 15.0 1.0 93 7 6 19.0 1.0 90 10 6 32.0 1.0 65 35 6 33.0 1.0 65 35 6 34.0 1.0 0 100 6 37.0 1.0 0 100 6 38.0 1.0 100 0 6 42.0 1.0 100 0 6 2.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表 所示的混合溶液。 名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）门冬氨酸 4.80 苏氨酸 1.20 异亮氨酸 1.10 丝氨酸 2.60 丙氨酸 2.50 亮氨酸 2.70 谷氨酸 6.20 脯氨酸 2.00 苯丙氨酸 1.20 甘氨酸 2.40 缬氨酸 1.60 色氨酸0.40 组氨酸0.90 甲硫氨酸 1.00 精氨酸 1.20 赖氨酸 3.45 取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。 衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定, 取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor 衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂2B 1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor 衍生稀释剂2B 1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。 2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸

超高效液相色谱仪技术参数

超高效液相色谱仪技术参数 原装进口 1. 工作条件 1.1 电源：220V，50Hz 1.2 操作环境 15?C-28?C 1.3 湿度：20-80% 2.技术参数 *2.1 二元高压泵结构：四压力传感器，数控直线驱动色谱双泵。四个压力传感器能够准确的监控泵系统的压力，并对泵做出相应调整，保证流量精度的重复性和稳定性。（需在投标文件中提供泵结构示意图予以证明并加盖仪器制造商公章，并标明四压力传感器示意图位置和真实位置）。 2.1.1 泵类型：数控直线驱动色谱双泵 2.1.2 泵输出压力：≥20000 psi *2.1.3 泵驱动马达：≥4 2.1.4 柱塞杆与马达联接方式：刚性直连 *2.1.5 泵压力传感器数量：≥4 2.1.6 1-4路溶剂任意混合 2.1.7可配内置溶剂选择阀，扩展到9路溶剂 #2.1.8 真空脱气:六通道在线真空脱气机 #2.1.9 流量：最小流量范围≥0.0100，最大流量范围≤2.000mL/min，以0.001mL/min 为增量 *2.1.10 最大操作压力：≥17,800psi（须提供厂家英文官方原版指标及应用证明文件，并加盖仪器制造商公章。 #2.1.11 梯度模式：线性、步进、凹线、凸线四种类型 2.1.12 柱塞清洗：自动，可编程 2.1.13 流量精度：+/-0.02min SD,（全流速范围内）,不随反压变化 2.1.14 流速准确度：±1.0% 2.1.15 梯度准确度：± 0.5%，不随反压变化 2.1.16 梯度精度：±0.15%RSD，不随反压变化

#2.1.17缓冲盐浓度和pH值调节：自动配置缓冲盐浓度和自动调节pH值2.1.17.1配置方式:自动比例混合 2.1.17.2计算方式:梯度曲线 2.1.17.3 pH精度: ±0.01 2.2 自动进样器系统 2.2.1密封在线针进样 2.2.2 耐压: 18,000psi 2.2.3 进样模式：任意体积直接注射进样 2.2.4 样品瓶数：≥90 位 2.2.5 进样精度：<0.3%RSD #2.2.6 样品交叉污染度：<0.001% 2.2.7 进样体积：0.1-50μL，以 0.1μL 为增量 2.2.8 进样线性度：>0.999 2.2.9 自动进样循环时间：<30 秒 2.3 柱温箱及色谱柱 2.3.1 温度范围：室温以上 5℃-90℃，增量：0.1℃ 2.3.2加热方式:电加热 2.3.3 预热方式：主动式 2.3.4 色谱柱颗粒度：≤1.7 um 2.3.5 色谱柱与柱温箱上带有使用信息记录装置 2.4紫外/可见光检测器 *2.4.1波长范围：190～700nm 2.4.2波长准确度：±1nm 2.4.3测量范围：0.0001～4.0000AUFS 2.4.4基线噪音：6.0×10-6 AU, 2.4.5基线漂移: ≤5.0x10-4AU/hr/℃ 2.4.6线性范围：2.5AU 2.4.7吸收范围：0.0001 to 4.0000 AUFS 2.4.8光源：氘灯，寿命2000小时

高效液相色谱仪操作三要点

高效液相色谱仪操作三要点 高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC 也已成为不可或缺的分析仪器。和其它分析仪器一样，你若想让HPLC 很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，最重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC 分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。 一、脱气 流动相脱气对于避免HPLC 系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC 系统内是不希望有气泡存在的。HPLC 泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS 不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE 管）渗透进 流动相中。如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种： 1. 吹氦脱气法。 利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa 压力下，以约60 mL/min 流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L 氦气通过1L 流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。 2. 加热回流法。 此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。 3. 抽真空脱气法。 此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa 即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。4. 超声波脱气法。

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

高效液相色谱（HPLC ）法测定邻苯二甲酸酯 一、实验目的： 1. 了解高效液相色谱仪原理； 2. 学习高效液相色谱仪的基本操作方法； 3. 利用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸酯、邻苯二乙酸酯、邻苯二丁酸酯的峰图和含量。 二、实验原理： ① 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC ）是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱法有“四高一广”的特点：高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围广。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： R ＝ 2[t (R2)-t (R1)] /1.7*(W 1＋W 2) //式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间；t (R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1 及W 2为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。 ② 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE ，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。同时也有一定的致癌作用。 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC 分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul 微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用） ，高纯水，样品。 出峰次序 样品组成 1 邻苯二甲酸二甲酯（DMP ） 2 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 3 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)

Agilent-1290-超高效液相色谱仪标准操作规程

Agilent 1290 超高效液相色谱仪标准操作规程 一、目的 制定Agilent 1290超高效液相色谱仪使用操作规程，确保操作人员能正确规范地操作液相色谱仪。 二、范围 适用于Agilent1290超高效液相色谱仪的使用。 三、操作规程 1 开机 1.1 打开计算机，进入 Windows画面。 1.2 打开 1290INFINITY HPLC 各模块电源。 1.3 待各模块自检完成后，双击“Instrument 1 Online”图标，化学工作站自动与 12001290INFINITY HPLC 通讯。 1.4 从“View”菜单中选择“方法和运行控制”画面，点击”视图”菜单中的“样品视图 “系统视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 1.5 点击泵下面的瓶图标，选择‘瓶填充‘如下图所示，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也 可输入停泵的体积。点击“Ok”。 1.6 从菜单“视图”中，选中“在线信号”，选中“信号窗口 1”，然后点击“改变…”钮， 将所要绘图的信号移到右边的框中，点击“确定”。(如同时检测二个信号，则重复选中“信号窗口 2”) 2 排气 2.1 首先在方法编辑中，泵的参数设置部分，选好需要排空的通道（保证是开的） 2.2 点击仪器状态视图中泵的图标，选择控制，出现如下图 2.3 勾上吹扫，并且输入流速，时间，比例就可以 purge 泵头。排空的时候阀会自动切换， 无需人为介入。 2.4 当我们发现泵头里面有气泡出不来的时候，选择预备---开。然后点击确定。此时泵会 用很强烈的方式朝外泵液体，并持续 20 次自动停止。 3 编辑数据采集方法 3.1 开始编辑完整方法： 从“方法”菜单中选择“编辑完整方法…”项，如下图所示选中除“数据分析”外

通则0512高效液相色谱法

高效液相色谱法： 系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测， 由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。 色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。 超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、 高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱： 以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱： 用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶 和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。 （2）检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器， 其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器， 其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关； 蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器， 对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一 定范围内呈线性关系， 但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。 紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外－可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求； 采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。 蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱法测定有机化合物的含量

实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。

色谱分析(中国药科大学)超高效液相色谱(UPLC)

超高效液相色谱(UPLC) 超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC）是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及快速检测手段等全新的检测技术。在全面提升HPLC的速度、灵敏度及分离度的同时，保留其原有的实用性及原理。基于小颗粒技术的UPLC，并非普通HPLC系统改进而成。它不但需要耐压、稳定的小颗粒填料（可达1.7μm），而且需要耐压的色谱系统(>15,000psi)、最低交叉污染的快速进样器、快速检测器及优化的系统体积等诸多方面的保障，以充分发挥小颗粒技术优势。这就需要对系统所有硬件和软件的进行全面创新。世界第一个商品化UPLC产品是Waters ACQUITY UPLC TM超高效液相色谱系统，它于2004年3月投入市场。 图1：填料技术的沿革 1．小颗粒填料改善分离的理论与科学基础 液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒大小的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产生直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分

离度不断提高。事实上，上述规律的理论基础是著名的Van Deemeter方程。Van Deemeter方程是色谱科学家预测颗粒度变化而引起的色谱变化的根本依据。Van Deemeter曲线（见图2）预测最佳柱效与相应的流动相流速。由Van Deemeter方程得知：随着颗粒度减小，相应的理论塔板高度（HETP）也下降，得到的柱效会更高。还应该注意到1.7 μm颗粒的HETP最小值区域扩大了（见图2），这表明可以在比大颗粒更宽的流量范围内得到最高的柱效，结果可以不损失高分离度的同时来适当提高流动相的流速（分析速度）。小颗粒填料为色谱分离带来如此的高柱效和速度优势，使得利用小颗粒技术成为色谱科学家梦寐以求的目标。然而HPLC系统的设计，一直难于发挥出最小颗粒的优点。小颗粒技术的运用，不但要求仪器在超出目前限度（6000 psi/ 400 bar）的压力下工作，同时要求仪器系统的死体积要更小，以便不影响梯度性能，而且还要检测器能高速检测出峰宽只有几秒的色谱峰。 在利用杂化颗粒技术合成出耐压的新一代小颗粒色谱填料之后，UPLC超高效液相色谱系统的设计，充分利用了小颗粒填料的所有优点，弥补传统HPLC系统的不足。

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项 一、操作步骤： 1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能） 注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。 3.排气结束后，关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。 注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同） 4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。 二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。 注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。