实验二 离子交换树脂柱层析分离混合氨基酸
实验二离子交换树脂柱层析分离混合氨基酸
【实验目的】
掌握层析装置的正确使用方法，学会装柱、洗脱、收集等离子交换柱层析技术。了解阳离子交换树脂工作原理。
【实验原理】
离子交换树脂是合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的活性基团分强酸、弱酸、强碱和弱碱。
离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对于生物大分子物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大分子可选用以糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。
【实验材料】
1．实验器材
层析柱（1.5×20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管（20根/组）及试管架；紫外可见分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(苯乙烯磺酸钠型树脂) ，玻璃漏斗、玻棒、水浴锅或（电炉+铝锅+温度计）等。
2．实验试剂
(1)2mol／L HCl 1000 mL
(2)2mol／L NaOH 1000 mL
(3)0.1 mol／L HCl 1000 mL
(4) 0.1 mol／L NaOH 1000 mL
(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml 4000mL
(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加0.2mol／L HAc 30ml 100 mL
(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮3000ml
(8) 氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸（均为2mg/ml）各10m1加0.1mol／L HCl 3ml 【实验方法】
1. 树脂的预处理
100ml烧杯中置约20g树脂，新鲜树脂用蒸馏水浸泡过夜，使之充分溶胀。倾倒去除悬浮物。加25ml 2mo1／L HCl至上述树脂中搅拌1h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。加25ml 2mol／L NaOH搅拌1h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡，备用。
2. 装柱
取一根1.5×20cm层析柱，并固定好。放好废液瓶，在层析柱内加入pH4.2柠檬酸缓冲液,至柱体积1/3时，打开开关，赶走接口处及胶管内气泡，关闭开关。用玻棒将树脂充分混匀，缓缓加入层析柱。柱内应无气泡、分层及断裂现象。当树脂沉积离层析柱口约3～5cm 处时，在树脂上端放置一薄层棉花层，并控制流速10～15滴／min。
3、平衡
用pH4.2柠檬酸缓冲液平衡10min，控制流速10～15滴／min。使流出液pH为4.2为
止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。
4. 加样、洗脱及洗脱液收集
打开旋塞使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将25滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部（从树脂中间加入），打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl（用滴管加为好），以10～15滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管3ml，逐管收存。当收集5根试管后，关闭旋塞，并同时检测（见下面），直到第一个氨基酸被洗脱下来。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10～15滴／min并注意勿使树脂表面干燥。
在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加1.5ml中性茚三酮溶液，1.5ml pH5醋酸缓冲液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫红色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。直到第二个氨基酸被洗脱下来。
于树脂顶部加入0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面继续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集(注意仍然保持流速10～15滴／min)，每管3ml。做洗脱液中氨基酸检验，直到第三个氨基酸被洗脱下来。
最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。
【注意事项】
1. 在树脂的处理过程中，酸碱处理时，树脂必须洗净残留的酸，碱。如用酸处理时，不洗
净就会产生白色沉淀，影响实验结果。
2. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。
3. 加样的样品直接加在树脂的表面上, 不能沾到管壁上，否则洗脱峰之间的界线不清，而且
拖尾长。
4. 一直保持流速10～15滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。
【思考题】
1. 为什么混合氨基酸从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来? 洗脱的顺序是什么？
2. 树脂如何保存?
3. 多糖基离子交换树脂适合于什么物质的分离？
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将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 2、蛋白质样品洗脱曲线：
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原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮，贮于棕色瓶中
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在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用 （2）在医药工业的应用
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色谱分离法的分类 （按组分在固定相中的作用原理不同） 色谱法的应用 色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几个方面： （1）分离混合物 （2）精致提纯化合物 （3）利用比移值（Rf）鉴定化合物 (4)跟踪反应进程 柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者以硅胶，硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收大量的液体为固定相。 当加入的洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗脱过程中，不同组分或不同色带就能分别收集，从而达到分离纯化的目的。
1 吸附剂 常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭或纤维素粉。选择吸附剂的首要条件：不与被分离物或展开剂发生化学反应。 吸附能力与以下几点有关： （1）吸附剂颗粒大小 （2）吸附剂含水量 柱色谱 2 溶剂 通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附活性等来考虑。先将带分离的样品溶于尽量少的非极性溶剂中，从柱顶流入柱中，依次增大溶剂的极性，将不同化合物依次洗脱。 常用洗脱剂的极性： 石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸 三实验步骤及注意事项 （1）取一支色谱柱，在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花，注意松紧要适度。然后在棉花上铺一层粗硅胶或石英砂。 （2）将色谱柱垂直固定在铁架台上，往柱内加适量70%乙醇溶液，打开活塞，赶走气泡。 （3）再向柱中倒入适量70%乙醇溶液，打开活塞，控制滴速为1滴／秒，用小锥型瓶承接，同时通过漏斗慢慢装入5gAl2O3，使其逐渐沉入底部。 【在装吸附剂的过程中，应用质软的物体如试管夹、吸耳球等轻轻敲击柱身，促使吸附剂装填紧密，排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整，无凹凸面。】（4）加完吸附剂后，在吸附剂上再盖一张直径大小合适的小滤纸。 （5）当溶剂的液面刚好流至滤纸面时关闭二通活塞，立即用移液管加入1mL亚甲基蓝和荧光黄的乙醇混合液，尽量免待分离混合液粘附在柱的内壁上。 （6）打开二通活塞，等柱内的溶剂恰好流到滤纸面时，关闭二通活塞，向柱内加入70%乙醇，打开二通活塞进行洗脱。 （7）用锥形瓶收集蓝色的亚甲基蓝溶液。【洗脱时切勿使溶剂流干！】 （8）当蓝色溶液收集完后，等柱内的70%乙醇溶液恰好流到滤纸面时，关闭二通活塞，加入适量2%氨水作为洗脱剂。打开二通活塞收集黄绿色的荧光黄溶液，直到其完全被洗出。 （9）用量筒分别量取所分离出来的亚甲基蓝和荧光黄溶液的体积后，倒入指定的回收瓶中。 （10）分离结束后，应先让溶剂尽量流干，然后倒置，用吸耳球从活塞口向管内挤压空气，将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里，切勿倒入水槽，以免堵塞水槽。 四操作注意事项 特别注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！！柱色谱是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望对大家能有所帮助。 1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间
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离子交换柱层析操作 （包涵体蛋白） 1.装柱： 1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子； 1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水； 1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱， 1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积； 2.柱的平衡与上样： 2.1用0.02M TB bufferB 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6； 2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合； 3洗杂蛋白： 3.1用0.02M TB bufferB 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.3用含20mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.4用含40mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.5用含60mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.6用含80mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测； 3.2用含100mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流
实验七 氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、?原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1.配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展??用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸 目的和要求 掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 原理 层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时，各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱，故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高度分辩力，从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。 根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类：1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析；2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析；3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。 纸层析所依据的原理是分配层析，故属于分配层析的范畴。 ㈠分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内，再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱，同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相，把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体物质把它吸牢，这种固体物质本身对分离无作用，对溶质也几乎没有吸附能力，称为支持物。进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢，结果得以分离。 显然，分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同，分配系数(α)的定义是：α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L) 滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素，其–OH基为亲水性基团，可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。通常把有机溶剂作为流动相(L)。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂作为流动相自上而
柱色谱分离染料实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除柱色谱分离染料实验报告 篇一：柱色谱实验报告 柱色谱分离实验报告篇二：色谱实验报告色谱实验报告项目一：气相色谱流出曲线的研究一：实验目的 1、2、3、 掌握气相色谱仪的基本结构及工作原理理解色谱流出曲线中各参数的表示方法掌握气 相色谱中定性、定量分析方法 二、实验原理 气相色谱的固定相是涂布在载体表面的固定液，试样气体由载气携带进入色谱柱，与固 定液接触时，气相中各组分便溶解在固定液中。随着载气的不断通入，被溶解的组分又从固 定液中挥发出来，挥发出的组分随载气向前移动时又再次被固定液溶解。由于各组分在固定 液中的溶解能力不同，随着载气的流动，各组分在两相间经过反复的溶解-挥发过程，经过一
段时间，最终实现彼此分离。色谱图是指被测组分从进样开始，经色谱柱分离到组分全部流过检测器后，所产生的响 应信号随时间分布的图像。色谱图上有一组色谱峰，每每个峰代表试样中的一个组分。色谱 流出曲线是以组分流出色谱柱的时间或载气流出的体积为横坐标，以检测器对各组分的电信 号响应值为纵坐标的一条曲线。三、仪器与试剂1、仪器气相色谱仪2、试剂乙醇、正丁 醇 四、实验步骤1、调试气相色谱仪2、分别进行进样 3、进乙醇和正丁醇的混合物样品，分别记录保留时间 五、实验记录 1、色谱条件:50m柱经：320μm固定液：聚乙二醇载气：氮气检测器类型：fid检测器温度：150℃柱温：95℃气化室温度：165℃气体流量：载气30ml／min 2、色谱图参数六：实验结果分析 从实验结果所占百分比可以看出该实验出峰效果较明显，乙醇先出峰，正丁醇后出峰。 在做实验时我们应注意一些问题，比如说乙醇和正丁醇要按一定的比例来混合，柱温要设置 合理，最低要高于正丁醇的沸点，也不能过高，否则会
离子交换层析柱的装填及处理
离子交换层析柱的装填及处理 一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：R-SO3H＋M+ R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－— R-NH3CL＋OH －这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1、2cm，3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。
四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0、45N，PH5、3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸 （C6O7H8?H2O）；186g97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0、85 ml TiCL3（15%）显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时， A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见 7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。
实验六 氨基酸的纸层析法
氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。
氨基酸的纸层析
氨基酸的纸层析 一、实验目的 1、了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、实验原理 1、纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团， 滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。 2、所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2）， 唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用脯氨酸、甘氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度 3、Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件 下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。
4、显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最 后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。 三、试剂 1.酸性层析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：2
2.显色储备液：0.4mol/L茚三酮—异丙醇：甲酸：水=20：1：5
柱层析和薄层层析试验报告
柱层析和薄层层析实验报告 篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素 一、【实验目的】 1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。 2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。 二、【实验原理】 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中
提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利 用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据 混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解供参考． 度不同将各组分分 离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面 积很大，经过活化的多孔性物质
或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液 流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合 物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速 度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过 程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中
（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚 提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附 柱上排列成为不同的色层，再利用供参考． 吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行 洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。 三、【实验材料】 原料： 新鲜的菠菜叶
氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离（纸层析法） 一、实验原理 1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。 操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示： 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，值是常数，故可根据值作定 性依据。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。 三、实验试剂 1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2 2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。 戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色
离子交换层析柱子的选择
离子交换层析技术 离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 （一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl ，DEAE ）纤维素。在纤维素上结合了DEAE ，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N +H ，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy ，CM ）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO 一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正 电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH 值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH 值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH 值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH 值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH 值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH 值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH 值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl ）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl 一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl 一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH 值。pH 值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH 值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH 值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH 值。 （二）常用离子交换剂的种类与特性 1. 离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1 所示。 表1-1 离子交换剂的类型与特点
生化实验报告模版
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
凝胶层析实验报告
凝胶层析实验报告 一.实验目的:将血红蛋白与鱼精蛋白混合物进行分离 二.实验原理: 凝胶是一种具有多孔,网状结构的分子筛. 分子量不同通过凝胶柱的速度也不同,利用这种凝胶分子筛对大小不同的分子进行层析分离. 当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱; 反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱.从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱. 这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离. 三.主要仪器和试剂: 铁架台层析柱胶管交联葡聚糖凝胶G-50 血红蛋白鱼精蛋白混合物(aq) 四.操作步骤: 1 连接装置:将层析柱固定在铁架台上,保持与水平面垂直,底部与胶管连接.胶管下端置于烧杯中. 2 装柱:将尼龙网放入层析柱底部, 使其水平固定;夹住胶管向柱中注水,松手放水,使水流到剩一厘米,让气泡流出,夹住胶管. 3 灌胶:将凝胶搅拌均匀,用玻璃棒引流将凝胶溶液一次性倒入层析柱约20ml;夹住胶管片刻,然后打开夹子,让凝胶沉淀约20分钟(凝胶与水分层),当水流至离凝胶约5mm处时,夹住胶管.用玻璃棒取滤纸一片伸入层析柱,放置于凝胶表面之上水面之下,打开夹子,当露出滤纸,关闭夹子. 4 加样:用胶头滴管取血红蛋白’鱼精蛋白混合液,滴入层析柱,约两滴. 5 洗脱:当待分离混合液渗入滤纸后,加少量水,开夹放水,(水面始终位于滤纸之上),反复两三次;关闭止水夹到入大量水,再开夹.等待分离 6 回收:将洗净的凝胶回收以便再次利用 五.实验现象: 观察看到红色的液体先被分离,流至烧杯中;黄色液体流速很慢,最终流入烧杯.
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