各生理指标实验步骤
1丙二醛(MDA)含量得测定
丙二醛在酸性与高温得条件下,可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色得三甲川,在５3２nm处有最大光吸收。植物组织中可溶性糖与TＢA得显色反应产物在4５0nm与532ｎm处也有吸收。测定时要排除可溶性糖得干扰,因此分别测定5３2nm与４５0nm处得吸光值,直接求得植物样品提取液中MＤA得浓度;MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。
计算公式如下:
C(μｍol.Ｌ-１)=6。４5OD５3２-０、56OD4５0
进一步算出每克样品鲜重中丙二醛得含量(μmｏlg-1ＦＷ)、
试剂:
10%三氯乙酸(TCA) :10ｇ三氯乙酸定容于100ml
0。6％硫代巴比妥酸:０.６g用1０％三氯乙酸TCA定容于100ml
试验步骤:
(1)取植物材料用液氮迅速研磨成粉,取0、2ｇ左右材料,放入５ｍl离心管
内。
(2)加入5ml 10%得三氯乙酸,提取30mｉn后,1000０r／ｍin离心１5min。
(3)取上清液2ml,加入2ml 0、6％TBA,混匀,在100℃水浴中煮15min,
冷却,冷却后再测量。
(4)分别测定532nｍ与450nｍ处得吸光值、以２ml(加TBA,水)水代替
提取液作为对照管。
2蛋白质含量测定---—考马斯亮蓝G-２５0法
实验原理:考马斯亮蓝G-2５0在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色,前者最大光吸收在46５nm,后者在5９5nm。在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质一色素结合物在59５ｎm波长下得光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质得定量测定、
仪器与试剂:
牛血清白蛋白500微克/毫升:１0ｍｇ蒸馏水定溶至100mｌ
考马斯亮蓝G-２50:10mｇ溶于５mｌ90％乙醇中,加入１０ml85％得磷酸,用蒸馏水定溶于１００ml
操作步骤:
１.标准曲线得制作:
取4支试管,按下表配制不同浓度得牛血清白蛋白溶液各１毫升,加入5毫升考马斯亮蓝G－2５０试剂,摇匀,放置2分钟后用1０毫米光径得比色杯在５９5ｎm下比色。做出标准曲线。
管号１ 2 3 4
蛋白质含量(微克) ０50 100 １５0
５00微克/毫升牛血０0、１0.2０.３
清白蛋白量(毫升)
蒸馏水量(毫升)1、０0。9 0.8 0、7
考马斯亮蓝－G25０ 5 5 5 5
(毫升)
2。样品中可溶性蛋白质得提取测定:
称取植物叶片０、2克,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,过滤,取滤液ｌ.0ml(视蛋白质含量适当稀释)于试管中,加入5毫升考马斯亮蓝G—2５0试剂,摇匀,放置2分钟后用1０毫米光径得比色杯在595nm下比色,以空白管调零,测定吸光度。根据吸光度查标准曲线,求出样品中得蛋白质含量。
3、结果计算
样品中得蛋白质含量(ｍg/g)=(Ｃ·Vt)/(１0００Vs·ＷF)
式中:Ｃ--查标准曲线值(ug)
Ｖt一提取液总体积(ml)
WＦ一样品鲜重(g):
Vs一测定时加样量(mｌ)。
3脯氨酸(Ｐrｏ)含量得测定
药品:３%得磺基水杨酸:3ｇ磺基水杨酸溶在１0０ｍl水中。
２.5%酸性茚三酮显色液:冰乙酸与６mol／l磷酸以3:２混合,作为溶剂进行配制:即2.5ｇ茚三酮溶解在 60mｌ冰乙酸与40ml磷酸中,磷酸就是16.4ml与2３.6ml水中。
脯氨酸标准溶液:称取25mg脯氨酸,用蒸馏水定溶至250ｍl。
1。标准曲线制作
(1)取4支具塞刻度试管按下表加入各试剂。
试管号0 2 4 6
脯氨酸标准溶液(ml) 0０.2 0.6 1.0
水(ml) 1.0 0、8 0、4０
冰乙酸(mｌ) １ 1 １ 1
茚三酮显色液(ml) １、5 1.５1、51。5
脯氨酸含量(μg) 0 2 ６１0
混匀后在沸水中加热20miｎ。
(2)取出冷却后向各管加入５ｍl甲苯充分振荡,以萃取红色物质、静置待分
层后吸取甲苯层以０号管为对照在５20nm波长下比色。
(3)以消光值为纵坐标,脯氨酸含量为横坐标,绘制标准曲线,求线性回归方程。
２.样品提取测定(l)提取:剪碎叶片0.2g,置于大试管中,加入５ｍ1 3％磺基水杨酸溶液,管口加盖保鲜膜,于沸水浴中浸提l０min。
(２)取出试管,待冷却至室温后,吸取上清液２ｍｌ,加2m1冰乙酸、２m1水与４ml显色液,于沸水浴中加热４0min,下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取与比色。以甲苯为对照
从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度,按下式计算样品中脯氨酸含量
脯氨酸含量(μg?g-1)(鲜重)＝(Ｃ·V)·(a·W)—1
式中:C一提取液中脯氨酸含量,由标准曲线求得;
V一提取液总体积(mｌ);
a一测定时所吸取得体积(ｍｌ):
W一样品重(g)
4相对电导率得测定
1、取已处理得叶片,用打孔器取小圆叶片２0片(或称取0．５克) ,放入小烧杯中, 每个处理三次重复。
2。向烧杯中各加入25ml蒸馏水浸半小时、
3、用电导仪测各个处理松针外渗液得电导率与蒸馏水电导率。
４。各烧杯用保鲜膜盖上,于水浴锅中沸水浴半小时,冷却补充蒸馏水25ml,测
定煮沸电导率。令测蒸馏水电导率
叶绿素含量得测定:丙酮乙醇混合法
1 将丙酮、无水乙醇按照１:１=5ｍl:5ml比例配成混合浸提液。2。称取0．2克叶片,剪成细丝于盛有混合液得试管中,加保鲜膜盖于暗处,浸提,隔一定时间观察浸提情况,以材料完全变白为准,用混合液作空白调零,测定663nm、645nm处光密度,一般隔夜测定。
1取叶片剪碎0.2克,用少量80%得丙酮研磨至匀浆,过滤,用80%丙酮定溶至 25MＬ,测测定663nｍ、645nm处光密度、每次测量做3次重复。
4超氧化物岐化酶活性(SOD)得测定
其中:A CK:照光对照管得吸光度A E:样品管得吸光度VＴ:提取得酶液总体积Vｔ:反应时所用酶液体积ＷF:植物材料得鲜重
试剂:
（1）磷酸缓冲液ｐH=7.8:内含１％聚乙烯毗咯烷酮ＰVP微量
取Ａ:Ｎa2HPO4溶液91、5mｌ,取B:NaH2PO4溶液8、5ml,稀释至200ml 即为缓冲液。
A:Nａ2HPO4溶液:Nａ2HPO4１２Ｈ2O 71。64g,用蒸馏水定溶至1000m ｌ。
PO4溶液:ＮaＨ2PO４2H2O31.2g,用蒸馏水定溶至1000ml.
B:NａH
２
（2）0、０1３mol/L甲硫氨酸溶液(Met):称取１.9399ｇMｅｔ,用磷酸缓冲液溶解并定溶至100ｍl。自配
（3） 6.３×10—6氮蓝四唑(NBＴ):称取0.061３3gＮＢT,用磷酸缓冲液溶解并定溶至10０ｍｌ,避光保存、自配
（4）6、5×10-６ｍol L-1核黄素:称取0.007５g核黄素,定溶至100ｍｌ,避光保存,随用随配、自配
（5）１×１０-4mｏlL-１乙二胺四乙酸钠EDＴA—Ｎa２: 0。０03721g用磷酸缓冲液溶解并定溶至１０0ml.
反应液:０、3ml--——０.０13ｍoｌ/L甲硫氨酸,
０。3ｍl——--63×１０－６氮蓝四唑,
0。３ｍl-—－—１×10—４molL—１乙二胺四乙酸钠,
2、4mｌ——--磷酸缓冲液,
0.5ml－--—蒸馏水H２Ｏ,总计３、8ml。
试验步骤:
(1)取植物材料０。2g用磷酸缓冲液迅速研磨成粉,放入5ｍl离心管内。
(２)加入５ml磷酸缓冲液,提取30min后,在４℃下１00０0r/ｍiｎ离心15ｍin。
(3)取上清液０.1ml放在试管中,加反应液,加０。３ml核黄素,于3０℃、4级光照培养箱内反应７-８min、
(4)立即测定５60nｍ处得吸光值。另准备２个管,一个黑暗作为调零,一个作为对照照光。加入如下试剂(0.1ｍl 缓冲液,3。8ml反应液,加０。3ｍl核黄素)。
注意:做之前先做几个,瞧瞧酶液浓度,切勿大量做。
过氧化物酶活性(POD)得测定
磷酸缓冲液(100mmｏl/L PH＝6)配制: 12.3ml Ｎa
2ＨＰO
4
与87.７ml ＮaH
2
ＰO
4混合,稀释至２00mｌ。Na
2
HＰO
4
与NaH
2
PO
4
配法与ＳOD一样。
反应混合液: １０0ｍmol/L磷酸缓冲液100ｍｌ,加入愈创木酚56微升,于磁力
搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待冷却后加入30％ H
2O
2
38微升,
混合均匀,保存于冰箱中。
酶活性得测定:
取2只比色杯,一只中加入反应混合液3ml, 磷酸缓冲液１ｍl 作为校零对照,另一只加入反应混与液３ｍｌ,上述酶液1ｍl ,立即开动秒表计时,与分光光度计４7０nm波长下测量值,每隔1min读数一次,以每分钟ＯD变化值表示酶活性得大小,
ＰOD活性 = OD４70·Vt /w·ｖs·t·0、０1
ＯＤ4７0 –反应时间内吸光度得变化
W –叶片鲜重g
t——－反应时间mｉn
Vｔ提取液总体积
Vs 测定时取用酶液体积
CＡＴ过氧化氢酶得测定
粗酶液 0、２MＬ加ＰH7。8得缓冲液1.5ML,加蒸馏水１ML ,于2５度预热10mｉn,加０、3mｌ 0.1ｍｏl/l H2O2,立即计时比色,240nm下测定,每隔1ｍin 读数一次,４min、
0。1mol/l H2O２配制:取30％得Ｈ2O2溶液5、6mｌ,用蒸馏水稀释至1000ｍｌ.?
4抗坏血酸(维生素c)含量得测定——滴定法
维生素c具有很强得还原性,染料2,6—二氯酚靛酚具有较强得氧化性,在酸性溶液中呈红色,在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此当用蓝色得碱性2,6—二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸得草酸溶液时,其中得抗坏血酸可以将2,6－二氯酚靛酚还原成无色得还原型。但当溶液中得抗坏血酸完全被氧化之后,则再滴2,６-二氯酚靛酚就会使溶液呈红色。借此可以指示滴定终点,根据滴定用去得标准2,6－二氯酚靛酚溶液得量,可以计算出被测样品中抗坏血酸得含量。
植物材料:
试剂: 2%草酸:
２,６-二氯酚靛酚溶液:50mg2,6-二氯酚靛酚溶解于２0０ｍl含有５2mg得NaHCO
3
得热水中,冷却后,稀释至２5０mｌ。
标准抗坏血酸溶液:5０mg抗坏血酸溶解于少量得2%得草酸溶液中,然后用2％草酸定溶至500ml。
操作方法:
(1)称取样品10g,放在研钵中加入2％草酸溶液研磨,定容100 ml,过滤,滤液备用。
(2)染料得标定:取10 ml标准抗坏血酸溶液至蒸发皿中,以2,6—二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色,并在3０ｓ内不褪色为终点。计算l ml染料相当于抗坏血酸得毫克数(重复２次,取平均值)。
(3)样品滴定:取滤液10 ml于蒸发皿中,用已标定过得2,6—二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色,并且在3０s内不褪色为止,记下染料得用量(重复2次,取平均值)。
(4)空白滴定:取２％草酸10 ｍl于蒸发皿中,用已标定过得2,6—二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色,并且在30s内不褪色为止,记下染料得用量
式中:W为１00g样品中含维生素c得毫克数;
Ｙ0为滴定空白所用染料毫升数;
y１为滴定样品所用染料毫升数;
Ａ为与1mｌ染料溶液相当得抗坏血酸得
毫克数;
B为样品得克数;
Ｘ为滴定时吸取样品溶液得体积,ml;
Z为样品溶液定容后得总体积。
植物体内可溶性糖含量得测定(蒽酮法)
(1)2０0μｇ/ml蔗糖糖: 100ｍｇ,蒸馏水溶解,定容至5００ｍl
(2)蒽酮试剂:0。5g蒽酮,用乙酸乙酯溶解,定容至2５mｌ,棕色瓶避光(3)浓硫酸:
实验方法1、葡萄糖标准曲线得制作: 取6支20ml具塞试管,编号,按下表数据配制一系列不同浓度得标准葡萄糖溶液。在每管中均加入０.5ｍl蒽酮试剂,再缓慢地加入5ｍl浓H2S O4,摇匀后,打开试管塞,置沸水浴中煮沸10分钟,取出冷却至室温,在630nm波长下比色,测各管溶液得光密度值(OD),以标准葡萄糖含量为横坐标,光密度值为纵坐标,作出标准曲线。
2。样品中可溶性糖得提取:称取0.２克、加入5ML蒸馏水提取置沸水浴中加盖煮沸10分钟,冷却备用。
3、糖含量测定:用移液管吸收0.１ml提取液于2０mｌ具塞刻度试管中,加1、5ml水与０. 5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓Ｈ2SO４(注意:浓硫酸遇水会产生大量得热！),盖上试管塞后,轻轻摇匀,(比色空白用2ｍｌ蒸馏水与0.５ml蒽酮试剂混合,在波长６3０nm下比色,记录光密度值。查标准曲线上得知对应得葡萄糖含量(μg)。
五、结果计算
六、附注
(1)加浓H2SＯ4时应缓慢加入,以免产生大量热量而爆沸,灼伤皮肤,如出现上述情况,应迅速用自来水冲洗。(2)水浴加热时应打开试管塞。