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植物抗旱生理指标测定原理及方法

生命科学学院

杨歌

一、

植物抗旱基因工程的研究进展1

来稿日期:20080831 基金项目:邯郸学院硕士博士启动基金(S2006002) 作者简介:葛水莲(19802),女,河北保定人,邯郸学院生物科学系教师,硕士. 植物抗旱基因工程的研究进展葛水莲1,薛晶晶1,陈建中2 (11邯郸学院生物科学系,河北邯郸056005;21邯郸市植物研究所,河北邯郸056005) 摘要:就植物的抗旱基因包括渗透调节,保护酶体系,抗旱基因及遗传特性等方面对植物抗旱机理的研究进行了综述.研究植物的抗旱性基因,有助于了解植物的抗旱机制,为中国节水抗旱农业的研究提供一些新的思路和新的手段. 关键词:抗旱机理;水分胁迫;基因工程中图分类号:S 33214 文献标识码:A 文章编号:167321492(2008)0620028204 干旱已是世界性的问题,世界干旱,半干旱地区已占陆地面积的三分之一以上,干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中占首位.显然,对植物抗旱机理的研究显得尤为重要.在长期的进化过程中,高等植物通过一系列生理变化来响应环境的水分胁迫.这些变化体现在渗透调节,保护酶体系,抗旱基因与遗传特性等方面.随着现代分子生物学与生物技术的发展,植物如何通过细胞感受逆境信号、传导逆境刺激、激活一系列分子途径并调控相关基因表达和生理反应以适应逆境,已成为科学家研究的热点[1].本文对上述几方面的研究进行了综述,旨在总结植物抗旱的新机制,以利于我们更好的进行抗旱工作. 1　渗透调节中脯氨酸的调节 111　植物体内脯氨酸的合成脯氨酸是一种小分子的渗透物质,是水溶性最大的氨基酸,许多植物受到盐渍时积累高水平的脯氨酸.植物的脯氨酸合成、累积及代谢是一个受非生物胁迫细胞内脯氨酸浓度调控的生理生化过程[2].脯氨酸积累可能是植物受到胁迫的一种信号.遭受胁迫的植物细胞内大量积累脯氨酸,已证明植物体内存在2条脯氨酸合成途径,根据起始氨基酸命名为Glu 途径和Orn 途径[3].胁迫导致水分亏缺时植物体内脯氨酸积累主要依靠Glu 途径,谷氨酸途径发生在胞质中,但脯氨酸降解为吡咯琳252羧酸(P5C )却发生在线粒体中,由脯氨酸脱氢酶(ProD H )催化,这种代谢的区室化分布避免了物质的无效循环.在正常情况下,脯氨酸作为一种反馈调节物质抑制了P5CS 的基因表达而诱导了ProD H 的基因表达.在胁迫条件下,P5CS 基因的表达活性超强,而ProD H 基因的表达活性却受到抑制.植物体内另一条脯氨酸合成途径为Orn 途径.鸟氨酸是在鸟氨酸6-氨基转移酶(62OA T )的作用下,生成谷氨酸半醛(GSA ),后通过Glu 途径生成脯氨酸[4]. 两条途径因植物和生长时期不同而各自起着重要的作用.从整体来说,在个体发育的早期阶段,异养型营养占优势,Orn -Pro 途径在脯氨酸合成中起重要作用,而谷氨酸作为脯氨酸合成的起始底物显然存在于个体发育的整个阶段,具体来说脯氨酸合成过程究竟是哪条途径居于主导地位有待研究.Roo sens [5]等研究表明,在盐胁迫和正常条件下,幼小植株的62OA T 活性和mRNA 都稍微高于较老植株,且该基因的表达与盐胁迫和脯氨酸产物密切相关.在拟南芥幼小植株中,游离脯氨酸含量、62OA T 活性以及62OA TmRNA 都受到盐胁迫处理而增加,这些结果表明对于拟南芥植物来说,在渗透胁迫过程中鸟氨酸途径和谷氨酸途径一样在脯氨酸的累积中发挥着重要的作用.另一方面4周龄的拟南芥植物虽然游离氨基酸的水平在盐胁迫条件下有所增加,但62OA T mRNA 的表达却没有检测到,相反P5CS mRNA 表达却达到较高水平.因此对于成年植株来说,游离脯氨酸的增加似乎只 ? 82?第24卷第6期2008年12月 (自然科学版)Journal of Hebei North University (Natural Science Edition ) Vol 124No 16 Dec.2008

植物生理学实验课程

《植物生理学实验》课程大纲一、课程概述课程名称（中文）：植物生理学实验（英文）：Plant Physiology Experiments 课程编号：18241054 课程学分：0.8 课程总学时：24 课程性质：专业基础课前修课程：植物学、生物化学、植物生理学二、课程内容简介植物生理学是农林院校各相关专业的重要学科基础课，是学习相关后续课程的必要前提，也是进行农业科学研究和指导农业生产的重要手段和依据。本实验课程紧密结合理论课学习内容，加深学生对理论知识的理解。掌握植物生理学的实验技术、基本原理以及研究过程对了解植物生理学的基本理论是非常重要的。本大纲体现了植物生理学最实用的技术方法。实验内容上和农业生产实践相结合，加强学生服务三农的能力。实验手段和方法上，注重传统、经典技术理论与现代新兴技术的结合，提高学生对新技术、新知识的理解和应用能力。三、实验目标与要求植物生理学实验的基本目标旨在培养各专业、各层次学生有关植物生理学方面的基本研究方法和技能，包括基本操作技能的训练、独立工作能力的培养、实事求是的科学工作态度和严谨的工作作风的建立。开设植物生理学实验课程，不仅可以使学生加深对植物生理学基本原理、基础知识的理解，而且对培养学生分析问题、解决问题的能力和严谨的科学态度以及提高科研能力等都具有十分重要的作用。要求学生实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期结果，操作关键步骤及注意事项；实验时要严肃认真专心操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果；及时将实验结果如实记录下来；实验结束后，根据实验结果进行科学分析，完成实验报告。四、学时分配植物生理学实验课学时分配实验项目名称学时实验类别备注植物组织水势的测定3学时验证性叶绿体色素的提取及定量测定3学时验证性植物的溶液培养及缺素症状观察3学时验证性植物呼吸强度的测定3学时设计性红外CO2分析仪法测定植物呼吸速率3学时设计性选修植物生长物质生理效应的测定3学时验证性植物种子生活力的快速测定3学时验证性

提升植物抗旱性

提高植物抗旱性的有效途径【摘要】：干旱、盐碱和低温(冷害)是强烈限制作物产量的3大非生物因素,其中干旱造成的损失最大,其损失量超过其他逆境造成损失的总和。干旱对植物生长和繁殖、农业生产和社会生活有着极其重要的影响,其对世界作物产量的影响,在诸多自然逆境中占首位,其危害程度相当于其他自然灾害之和。因此,干旱是制约植物生长发育的主要逆境因素,研究植物的抗旱性对农业生产实践及稳定荒漠生态具有极其重要的作用。另外,抗干旱植物对抵御风沙等自然灾害、稳定干旱区环境,亦起着不容忽视的作用。【关键词】：植物水分抗旱性干旱诱导蛋白渗透调节物质干旱胁迫水分胁迫【引言】：作为生态系统的一分子，植物无时尤刻小在同环境进行着物质、信息和能量的交流。环境中与植物相关的因子多种多样，且处于动态变化之中，植物对每一个因子都有一定的耐受限度，一旦环境因子的变化超越r这一耐受限度，就形成了逆境。因此，植物的生长过程中，逆境足不可避免的。植物在长期的进化过程中，形成了相应的保护机制：从感受环境条件的变化到调整体内代谢，直至发生有遗传性的改变，将抗性传递给后代。研究逆境对植物造成的伤害以及植物对此的反应，是认识植物与环境关系的一条重要途径，也为人类控制植物的生艮条件提供了可能性。【正文】：在植物生理学发展史上,植物水分与抗旱性当属最早开展的研究领域之一,一直备受关注。特别是近年来由于世界范围的干旱缺水日趋严重,加之分子生物学思想和方法的不断渗入,致使该领域的研究工作进入一个充满活力的新时期,但从旱区农业发展和改善环境的需求看,植物水分与抗旱的研究前路仍然很广阔。

一．逆境对植物的影响 1.逆境引起的膜伤害 1．1影响膜透性及结构细胞膜作为联系植物细胞与外界的介质，它的组成、性质与细胞所处的环境息息相关，而外界环境对植物的胁迫危害，首先在膜系中有所表现。干旱、低温、冻害等几种胁迫，无论是直接危害或是间接危害，都首先引起膜透性的改变。至于膜上酶蛋白的变化以及脂类的组成也可随着胁迫的深化而有所改变，目前，这方面研究最深入的是低温引起膜脂相变的假说。1970年，Lyoll8和Raison提出，低温敏感植物的膜脂相变可能由于膜脂肪酸的不饱和程度较低，或饱和膜脂较多，低温下，膜脂以液晶相向凝胶相转变，造成细胞膜膜相分离，从而引起细胞生理活动的紊乱。在此之后，大最试验证明，膜脂的组分和结构与抗冷力密切相关。 1.2 发生膜脂过氧化作用逆境对膜的伤害，还表现在膜脂过氧化上。20世纪60年代末，Fridovic提出生物自由基伤害假说，植物在逆境条件下，细胞内产生过量自由基，这些自由基能引发膜脂过氧化作用，造成膜系统的伤害。主要反应是，活性氧促使膜脂中不饱和脂肪酸过氧化产生MDA。后者能与酶蛋自发生链式反应聚合，使膜系统变性晗。有多位研究者报道，当植物受到低温或高温等逆境的胁迫时，其细胞内自由基清除剂含量下降，而MDA含量上升；另一方面，热锻炼、冷锻练或外源激素处理提高植物的抗逆性也表现在彤汀的活性提高，膜稳定性增强。 1.3 影响离子载体功能的实现在细胞膜上存在着一些离子载体或通道，当外界刺激作用于细胞时，除了膜结构变化影响内部代谢紊乱外，膜上的离子载体首先接受了环境变化的信号，并通过刺激一信

植物生理生化测定

2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5% NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取其叶片测定其SOD 活性，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。 2.1.8.1主要试剂及配方（1）0.1 mol/l pH 7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A液（0.1 mol/l Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO4·12H2O 7.163 g，用少量蒸馏水溶解后定容至200 ml，4℃冰箱中保存备用； B液（0.1 mol/l NaH2PO4溶液）：称取NaH2PO4·2H2O 0.780 g，用少量蒸馏水溶解后定容至50 ml，4℃冰箱中保存备用；取上述A液183 ml与B液17ml充分混匀后即为0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液，4℃冰箱中保存备用。（2）0.026 mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液称取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388 g，用少量0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至100 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用1～2 d。（3）7.5 × 10-4 mol/l NBT溶液称取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153 g，用少量蒸馏水溶解后，定容至250 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用2～3 d。（4）含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液 A液：称取EDTA 0.003 g，用少量蒸馏水溶解； B液：称取核黄素0.075 g，用少量蒸馏水溶解； C液：合并A液和B液，定容至100 ml，此溶液即为含0.1 mmol/l EDTA的2 mmol/l 核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好），4℃冰箱中可保存8～10 d，当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液。（5）含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液取0.1 mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液50 ml，加入2 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶解后移入100 ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。 2.1.8.2提取及测定方法（1）称取1.0 g样品叶片于预冷的研钵中，加入4 ml预冷的提取介质（含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液），冰浴研磨匀浆，转入10 ml离心管，并用提取介质定容至

植物抗旱研究进展

植物抗旱性研究进展摘要：本文主要总结了一些与植物抗旱相关的因素，比如叶片结构、小分子代谢物、激素以及抗旱相关的基因等，探讨植物抗旱研究的进展、存在问题及发展趋势。关键词：抗旱叶片小分子代谢物植物激素抗旱基因 Abstract：This article mainly talks about the factors of drought-resistant, such as leaf structure, small molecule metabolites, phytohormone, and other drought-related genes and exploring the progress of the study, existing problems and developing trends. Key words: drought-resistant leaf small molecule metabolites phytohormone drought-related genes 干旱是一个长期存在的世界性难题，全球干旱半干旱地区约占陆地面积的35%，遍及世界60多个国家和地区。我国是一个干旱和半干旱面积很大的国家，干旱半干旱的面积约占国土面积的52. 5%，其中干旱地区占30.8%，半干旱地区占21.7%。而干旱胁迫造成农作物减产，给农业生产带来极大的经济损失。因而对植物抗旱性的研究就显得尤为重要。 1. 植物叶片与抗旱性植物吸收的水分主要是通过叶片蒸腾作用散失到体外，因此叶片的结构以及生理特征对植物的抗旱有着重要的作用。不同的植物筛选出的抗旱性评价指标不尽相同，通常认为，叶片的角质层越厚，表皮层越发达，栅栏组织越厚且排列紧密，气孔密度大，栅栏组织/海绵组织厚度比值较大，叶片组织结构紧密，上表皮细胞较小者抗旱性较强[1][2]。肖冰雪等[3]对牧草叶片解剖结构与抗旱性关系研究中表明，“阿坝”硬秆仲彬草、“阿坝”垂穗披碱草旱生结构特点明显：角质层厚、气孔下陷、维管束导管发达，具有较强的抗旱能力。刘红茹等[4]对延安城区10种阔叶园林植物叶片结构及其抗旱性研究中表明10种植物叶片均具备抵抗干旱环境的解剖结构，表皮、角质层、栅栏组织、叶脉、维管束等较为发达，气孔主要分布在下表皮。另外，叶片的一些其它结构也与抗旱相关，比如泡状细胞在植物缺水时，发生萎蔫，叶片内卷成筒状以减少水分蒸腾作用[5]，发达的叶脉促进植物吸水率从而有利于植物贮藏水分[6]。

植物生理生化指标测定

小黑豆相关生理指标测定 1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个重复。株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测6个重复。主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。 2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）和H2O2含量测定样品处理：取0.5g样品（叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净），速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCl（pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4℃，12000rpm离心15min，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于总蛋白、丙二醛（MDA）、可溶性糖和H2O2含量测定。总蛋白测定（Bradford法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X代表OD595)，计算得出蛋白含量。可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空白对照（1ml蒽酮+180ul ddH2O），测定OD625后带入标准曲线：Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625，X代表可溶性糖含量（ug）) 蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O）.注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。丙二醛（MDA）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA）反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA含量。MDA的计算公式为：MDA（umol/L）=6.45OD532-0.56OD450. 反应体系为：400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品，80℃水浴10min后，测OD532和OD450。对照用Tris-HCl. 0.6%TBA配方：称取硫代巴比妥0.6g，溶于少量1M NaOH中，待其完全溶解后用10%TCA（称取10gTCA三氯乙酸，溶于100ml蒸馏水中，待其溶解即可）定容至100ml。 H2O2测定（二甲酚橙法）：样品反应体系（82ul溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10）+150ul样品提取液），30℃水浴30min，测OD560。标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560，X代表H2O2含量)

植物生理生化指标测定(精)

小黑豆相关生理指标测定 1. 表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积鲜重 :取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量,每个测 6个重复。株高 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度,记录,每个测6个重复。主根长 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最远点长度,记录,每个测6个重复。叶面积 :取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面积,叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长, 测叶片最窄处长度作为叶的宽, 叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测 6个重复。 2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量测定样品处理:取 0.5g 样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净 ,速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4℃, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20℃下,上清液可用于总蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含量测定。总蛋白测定(Bradford 法 :样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 , 空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准曲线 Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。可溶性糖测定:样品反应体系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul样品提取液 ; 空白对照 (1ml 蒽酮 +180ul ddH2O , 测定 OD625后带入标准曲线 : Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量(ug

植物抗旱机理研究进展

植物抗旱机理研究进展水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有20％的耕地受到盐害威胁，43％的耕地为干旱、半干旱地区。干旱与盐害严重影响植物的生长发育，造成作物减产，并使生态环境日益恶化。在我国，仅2001年华北、西北和东北地区的466.7万hm2稻的种植面积就因为缺水而减少了53.3万hm2。在自然条件下，由于环境胁迫而严重影响了作物生长发育，其遗传潜力难以发挥，干旱、盐渍不仅影响了作物的产量，而且限制了植物的广泛分布，因此，提高作物的抗旱、耐盐能力已经成为现代植物研究工作中急需解决的关键问题之一。现将植物特殊生理结构功能综述如下。 1植物形态结构特征对其耐旱机制的影响 1.1根系植物根系是植物直接吸收水分的重要器官，它对植物的耐旱功能具有至关重要的作用。纵深发达的根系系统可使植物充分吸收利用贮存在土壤中的水分，使植物度过干旱期。对高粱的根系解剖学研究发现，高粱根系吸水每天以3.4 cm的稳定速率下伸，直到开花后约10 d，在有限水分条件下，吸水的多少由根系深度决定，深层吸水差是由于根长不够所致。此外，根水势能也能反映根系的吸收功能。根水势低，吸水能力强。据报道，高粱根水势一般为-1.22～1.52 Mbar，而玉米仅为-1.01～1.11 Mbar，高粱的吸水能力约是玉米的2倍(Cnyxau，1974)，对干旱的耐受能力也强于玉米。一般认为抗旱性强的植物，根水势低，利于水分吸收。 1.2叶片作为同化和蒸腾器官的叶片，在长期干旱胁迫下，叶片的形态结构会发生变化，其形态结构的改变与植物的耐旱性有着密切的关系。主要表现在：叶片表皮外壁有发达的角质层，角质层是一种类质膜，其主要功能是减少水分向大气散失，是植物水分蒸发的屏障。厚的角质层可提高植物的能量反射与降低蒸腾，从而增强植物的抗旱性；具有表皮毛，可以保护植物避免强光照射，减少蒸腾；具有大的栅栏组织/海绵组织比和小的表面积/体积比，发达的

植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。 Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料任何植物鲜样或干样。（二）试剂 1. 80 ％乙醇。 2. 葡萄糖标准溶液（100 μg/mL ）：准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。 3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。（三）仪器设备分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。三、实验步骤 1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～100 mg ），放入大试管中，加入15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min ，取出冷却，过滤入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。 2. 标准曲线制作取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10 min ，取出冷却，在620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。 3 ．样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。

植物抗旱性处理方式

植物抗旱性干早处理方法干旱是世界范围内普遍存在的问题，全球约三分之一的土地面积处于干早和半干旱地区，因此，国内外学者在植物对干早胁迫响应方面进行了大量的研究。根据试验内容和对试验进度控制的需求，干旱处理方法大致分为以下几种：(l)‘盆栽法通过人为控制盆栽植物的土壤含水量，以达到模拟植物所处的干旱环境。草坪护栏根据控制水分的方式的不同，又分为控水法和缓慢干旱法。①控水法，即控制土壤含水量，使植物处于几种水分胁迫梯度下，以监测、对比不同水分胁迫梯度植物的生长和生理活动情况，从而分析植物对不同水分梯度的响应情况；②缓慢干旱法，根据植物的生长发育阶段，人为控制土壤含水量每日的脱水量和速率，经一定时间达到干旱程度，从而根据时段进行观测植物对干旱环境的响应。目前盆栽方法的优点是试验进程较容易控制，结果可靠，但由于室内外环境差异，势必与田间植物生长存在差异.东莞护栏。 (2)大气干早处理法研究外界干旱气候环境对植物产生的影响中，空气湿度是造成干早环境的主要因子，此方法主要通过使植物生长在能控制空气湿度的干旱室中，或给作物叶面喷施化学干燥剂等方法模拟干早环境，经过设置不同时间的处理，形成不同程度的干旱环境，从而分析植物对外界空气湿度变化的响应情况。此方法的优点是制造干旱环境较为精确，但需要的资金也相对较多，难以大面积、大批量进行试验，同时依旧存在与田间自然环境条件存在差异的问题.(3)高渗溶液处理法使用不同浓度的高渗溶液如聚乙二醇、甘露醇、蔗糖、生理盐水等，对植株进行处理，形成植物生理干早，从而进行测定相应的生理指标。目前此方法存在争议较大。 (4)田间试验鉴定法此方法是指在田间进行栽植和测定指标试验，根据控水方式的不同分为两类，一类是将供试种在不同地区的试验地上栽种，以自然降水造成干旱胁迫，直接按照植物产量或生长状况来评价植物种的抗旱性；另一类是将供试种直接种于一个地区的田间试验地，以人工灌水来控制土壤含水量，形成有差异的水分环境，使植物生长受到影响，以此来评价植物种的抗旱性。这种方法主要以产量指标来评价植物的抗旱性。此方法较简便易行，即能反映出植物在真实地田间干旱环境下的生长情况，又有产量指标，结果较有说服力，但受环境的影响较大，尤其是降水，年际间变幅较大，使每年鉴定的结果难以重复。 (5)分子生物学方法分子生物学法是近年来主要研究的方法，结果精确，其主要特点是不需要经过干早胁迫，直接找出标记指示植物抗旱的基因，或与抗旱性状相近的基因，用基因追踪技术(如限制性片段长度多态性盯LP)，对抗旱基因进行定位和标记，通过基因鉴别来反映植物抗旱性。但此方法目前尚处于研究阶段，成本较高

植物抗旱抗旱机理及其相关基因研究进展

植物抗旱机理及其相关基因研究进展摘要：提高植物的抗旱能力已经成为现代植物研究工作中的关键问题之一。近年来，随着分子生物学的应用与发展，该领域的研究也已引起国内外学者广泛的兴趣和重视，在抗旱机理研究及相关基因克隆及表达调控方面已取得可喜进展。本文综述了植物对于干旱胁迫在细胞水平、生理生化水平以及基因表达调控水平上的响应，重点介绍了基于细胞信号转导和基因调控的抗旱基因工程以及渗透保护物质积累的抗旱基因工程的新进展，最后对通过基因工程改善植物抗旱性所存在的问题进行了探讨，并对其前景进行了展望。关键词：抗旱机理；渗透调节；信号转导；基因调控；渗透保护物积累。Progress of the Research on Plant Drought-resistant Mechanism and Related Genes Abstract: In recent years，with the application and development of molecular biology，the research in the drought-resistant mechanism and the relevant gene cloning and expression regulation have aroused wide interest and attentionamong domestic and foreign scholars，which has made gratifying progress. In this article, the plant responses to drought stress at cell, physiological and biochem ical levels as well as geneexp ressed and regulated levels, and mainly introduced the latest advances of drought stress tolerance engineering of plantbased on signal transduction, gene regulation and accumulation of osmotic adjustments1were summarized. In addition, the problem s of improving drought stress tolerance of plant through gene engineering were discussed, and the outlook was alsoanalyzed in paper1 Key words: Drought-resistant mechanism; Osmotic regulation; signal transduction; gene regulation; accumulation of os-motic adjustments 干旱已是世界性的问题，世界干旱，半干旱地区已占陆地面积的三分之一以上，干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中占首位。显然，对植物抗旱机理的研究显得尤为重要。在长期的进化过程中，高等植物通过一系列生理变化来响应环境的水分胁迫。这些变化体现在渗透调节，保护酶体系，抗旱基因与遗传特性等方面. 随着现代分子生物学与生物技术的发展, 植物如何通过细胞感受逆境信号、传导逆境刺激、激活一系列分子途径并调控相关基因表达和生理反应以适应逆境，已成为科学家[1]研究的热点。本文对上述几方面的研究进行了综述，旨在总结植物抗旱的新机制，以利于我们更好的进行抗旱工作。 1 植物对干旱生理生化上的响应干旱胁迫的环境下，通常会造成植物在生理、生化代谢途径上的改变，在细胞水平上主要表现为:细胞膨胀的消失，细胞膜流动性的改变，细胞内可溶物浓度的变化，以及蛋白和蛋白，蛋白和脂类间的相互作用[2]。植物也能通过自身的调节和适应来避免体内水分的丧失。例如，光合作用效率降低[3],细胞内有

植物生理学实验指导

植物生理学实验指导主编胡君艳陈国娟张汝民浙江农林大学植物学科 2013年8月

实验一植物组织水势的测定水势与渗透势的测定方法可分为3大类：⑴液相平衡法，包括小液流法、重量法测水势，质壁分离法测渗透势；⑵压力平衡法（压力室法测水势）；⑶气相平衡法，包括热电偶湿度计法、露点法等。 Ⅰ小液流法【实验目的】了解采用小液流法测定植物组织水势的方法。【实验原理】水势表示水分的化学势，像电流由高电位处流向低电位处一样，水从水势高处流向低处。植物体细胞之间，组织之间以及植物体和环境间的水分移动方向都由水势差决定。当植物细胞或组织放在外界溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度变化，然后根据公式计算渗透势。【实验器材与试剂】 1.实验材料：八角金盘、大叶黄杨等。 2.实验试剂：0.05、0.10、0.15、0.20、0.30mol·L-1蔗糖溶液、甲烯蓝溶液。 3.实验仪器：试管10支、微量注射器、镊子、打孔器、垫板。【实验步骤】 1.取干燥洁净的试管5支为甲组，标记1~5，各支中分别加入0.05~0.30mol·L-1蔗糖溶液5mL。另取5支干燥洁净的试管为乙组，标记1'~5'，各试管中分别加入0.05~0.30mol·L-1蔗糖溶液2ml。 2.取待测样品的功能叶数片，用打孔器打取小圆片约50片（避开叶脉），混合均匀。用镊子分别夹入10个小圆片到乙组试管中。并使叶圆片全部浸没于溶液中。放置约30~60min，为加速水分平衡，应经常摇动试管。 3.到时间后，在乙组试管中加入甲烯蓝溶液1~2滴，并用微量注射器取各试管糖液少许，将注射器插入对应浓度甲组试管溶液中部，小心地放出一滴蓝色溶液，并观察蓝色小液流的

生理指标测定

生理指标测定_16种 1、冻害指数——3~5株观察形态【４种常绿水生鸢尾抗寒性的初步研究】张京，2012 李刚，姜卫兵，翁忙玲，等．木兰科６种常绿树幼苗抗寒性的初步研究［Ｊ］．园艺学报，２００７，３４（３）：７８３－７８６．描述叶色变化：在最冷月( 2月中旬) , 所有供试树种均有不同程度的冻害表现, 乐东拟单性木兰受冻害最轻,只有部分植株的少量叶片有些许水渍状, 大部分植株完好无损, 冻害指数为041, 基本不受冻害;阔瓣含笑也长势良好, 有少部分叶片出现褐色水渍状, 冻害指数为14, 受轻度冻害; 金叶含笑受到了中度水平的冻害, 部分植株的叶片整个叶面呈现红褐色水渍状, 冻害指数为25; 红花木莲、醉香含笑和观光木受到了重度冻害, 大多数植株的部分叶片呈焦黄、褐色脱落, 有的整个植株呈萎蔫状,长势非常差, 冻害指数分别为3.2、3.9、4.3. 2、相对含水量叶片相对含水量采用饱和称重法［21］测定。选取各处理部位一致、成熟完好的叶片迅速称其鲜重，再用蒸馏水浸泡8~24 h，使组织吸水达到饱和状态，取出后吸去表面水后立即称其饱和重，然后在105 ℃下杀青30min，在80 ℃下烘干至恒重（1h~24h），放在干燥器中冷却，称其烘干重。根据公式计算:LRWC( %) = [ (鲜重－干重) /(饱和重－干重) ] × 100%

3、光合参数（光合仪测定）光合速率、CO2浓度、光合有效辐射、叶绿素或用95%乙醇浸泡法，浸泡4~5d，测定叶绿素。《植物生理生化实验原理和技术》 4、膜质过氧化：相对电导率（略）、MDA MDA（丙二醛）的测定试剂：三氯乙酸10% （TCA 溶液）：称取100g溶于1L 蒸馏水中； 0.6％硫代巴比妥酸溶液（6%TBA）：1.8g溶于300ml TCA 溶液中（加热溶解）称取植物叶片0.3克, 先加入2ml TCA和少量石英砂研磨至匀浆，再加入4ml 10%三氯乙酸(TCA)进一步研磨（总体积为6ml），然后以4000g离心10min, 取上清液待测。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6% TBA，混匀物于沸水浴上反应15分钟，迅速冷却后再离心(在冰箱中冷却较快)。取上清液测定在532，600和450nm波长下比色。公式C MDA (nmol L-1)＝[(A532－A600)-0.0571×(A450-A600)]/0.155计算MDA量（排除多糖干扰），用每克干（鲜）重中MDA的量表示MDA的含量，单位μmol g-1干（鲜）重或nmol g-1干（鲜）重。 1、含量计算双组分光光度计法：已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm波长下的比吸系数分别为 85.40,7.40；MDA与 TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，其吸收系数为0，532nm下比吸收系数为155，根据双组分光光度计法建立方程组，计算公式如下： C 1（mmol/L）=11.71 D 450 C 2 =[6.45(D 532 —D 600 ) — 0.56 D 450 ]X提取液总体积/测定时用的提取液体积*样品鲜重 C 1:可溶性糖的浓度, C 2 为MDA的浓度, D 450 D 532 D 600 分别代表450,532,600nm下的消光度值. 参：Brege J G.Microsomal lipid peroxiodation. Methods in Ezymmology.1978,52:302-306 J.G. Buege and S.D. Aust, Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol.52(1978), pp. 302–306. 注: 沸水浴时,可使用小试管,然后上部用保鲜膜包扎.(如橡皮筋) 附4.1 MDA、可溶糖含量—硫代巴比妥酸加热显色法【原理】植物遭遇逆境胁迫或衰老过程中，由于自由基、活性氧的积累引起膜脂过氧化，产生脂质自由基，进一步诱发膜脂连续过氧化并导致蛋白质交联变性，而引起细胞损伤或死亡。MDA 是膜脂过氧化的最终产物，通过其含量的测定可了解膜脂氧化伤害的程度，比较不同植物抗逆性的差异。在酸性和高温条件下，MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红棕色的产物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮）。该产物在532nm处有最大吸收峰，测定反应产物在532nm处的光密度值，可计算出MDA含量。但植物组织中的可溶性糖亦与TBA产生颜色反应，其产物对532nm 光的吸收干扰测定。采用双组分光光度法及其计算式，可排除干扰，计算出MDA的含量。【器材】分光光度计离心机水浴锅研钵剪刀试管