微生物与制药综述

微生物制药的研究进展

姓名：李青嵘

班级：生工102

学号：1014200044

摘要

本文通过对历史文献的检索，从微生物生产维生素，微生物生产多价不饱和脂肪酸，微生物生产抗生素，微生物生产抗癌物质，微生物生产医用酶制剂等五个方面综述了微生物制药的研究进展。

关键词：微生物，制药，发酵工程

1.前言

随着生物技术的迅猛发展，在医药领域的许多方面取得了巨大的进展.，其中采用微生物制药，具有生产工艺简单，生产成本低廉，产品产量高，产品纯度高，可大规模工业化生产等优势，同样得到了巨大的发展。从传统工艺，如利用发酵工程生产抗生素、酶制剂以及B-胡萝卜素等；到现今的利用转基因技术生产干扰素、胰岛素、生长因子等几十种新药和疫苗。本文着重综述了微生物的发酵工程在医药研究和生产中应用的最近进展，主要包括生产维生素、多价不饱和脂肪酸、抗生素、抗癌物质医用酶制剂等五个方面。

2.研究内容

2.1.微生物生产维生素

维生素是六大生命要素之一, 为整个生命活动所必需。β-胡萝卜素、VC、VE 是目前应用最为广泛，效果最为显著的三种维生素，它们的作用分别是：β-胡萝卜素是强力抗氧化剂, 有抑制癌细胞增殖和提高机体免疫力等作用。V C 和V E 均是抗氧化剂, 前者可阻止、破坏自由基形成，还具有激活免疫系统细胞的活力，刺激机体产生干扰素以抵御外来侵染因子。至于VE可产生抗体，增强机体免疫力。目前，上述的“三素”以实现了微生物工业化生产。

目前，β-胡萝卜素主要是由三孢布拉霉菌生产，在1998年，陈涛等[1]已经针对三孢布拉霉菌的特点，优化发酵工艺，在3M3的发酵罐中发酵120h，生产的β-胡萝卜素产量已达到1146.5mg/L。虽然，传统的工艺生产β-胡萝卜素的产量高，生产周期比较短，但是传统的工艺复杂，成本过高，不利于大规模工业化生产。故,目前许多课题组专注于开发新的生产β-胡萝卜素的菌种或改进传统工艺。据近年所发表的期刊文献，目前，采用红酵母发酵生产β-胡萝卜素是一种工艺简单，成本低廉的方法，虽然在产量方面较传统方法的低很多，但是该方法仍具有很大的发展潜力。何海燕等[2]采用粘红酵母R3-35摇瓶发酵84h，生产的β-胡萝卜素到达12.21mg/L。胡萍等[3]采用酵红酵母Yh3发酵生产β-胡萝卜素，其生物量及色素产量最大值分别为9.89mg/L和10.38mg/L。

目前，工业生产VC采用二次发酵法，此法是在70年代初研究出来的，属于我国

首创，其先进性得到国际公认。该法[4]以D-山梨醇为底物，用生黑醋杆菌发酵生产

L-山梨糖，再采用假单胞菌发酵生产2-酮-L-古洛糖酸，最后通过化学转化生成维生素C，可达到产量130.92g/L。此后，国内外纷纷展开从D-葡萄糖串联发酵生产2-酮-L-古洛糖酸的新研究。伊光琳等[5]采用欧文氏菌和棒状杆菌从D-葡萄糖经中间体2，5-二酮-D-葡萄糖串联发酵生成2-酮-L-古洛糖酸获得成功，可达到产量106.3g/L。Anderson等[6]应用DNA重组技术使棒状杆菌2，5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶基因在欧文氏菌中表达，构建基因工程菌直接一部转化D-葡萄糖为2-酮-L-古洛糖酸。

目前，维生素E主要是通过天然的植物提取或精炼植物油生产，该工艺已经成熟，维生素E的产量也是众多维生素中发展最快的，1997年，世界天然维生素E的产量约为3500t，2000年约为5300t[7]。由于高等植物作为维生素E总含量低，高活性形式的α-生育酚比例也低，近年来，许多科学家把目光投向微生物生产生育酚。微生物是天然生育酚很好的来源，然而只有微藻等光合藻类能合成生育酚。在目前检测的56属285个微藻品种中，裸藻中生育酚含量最高，达1.12~7.35 mg/L以干重计，仅一生育酚可达生育酚总量的97%以上[8]，且裸藻无细胞壁，因此生育酚提取相对容易；Fujita T [9]等用光能异养的方法培养裸藻，6 d内细胞浓度可达19．7g/L，生育酚含量可达1.19 mg/L。

2.2.微生物生产多价不饱和脂肪酸

2 0碳5烯酸(EPA)和2碳6烯酸(DHA)均是多价不饱和脂肪酸，多存在于海鱼中，特别是海洋冷水鱼中含量更丰富，此类多烯脂肪酸是人类很有价值的医药。保健产品，有“智能食品”之称。目前，国内外对其开发十分活跃，不仅源于海鱼，而且通过某些微生物进行生产。利用海洋微藻生产多不饱和脂防酸的研究始于80年代初期，并且多以自养微藻生产DHA和EPA为主，其中的三角褐紫藻（P.tricornutum）、紫球藻(Porphyridium cruentum)、盐生微小绿藻(Nannochloropisis salina)、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、硅藻(Diatom)等当时被认为最有町能

实现微藻产业化美国、日本、以色列等曾率先采用户外开放大池培养这些自养微藻用以生产PUFA．其结果并不尽人意。开放大池培养微藻其扳低的产量和难以对一些高纯度、高价值的产品进行纯种培养的缺陷，使其住推广微藻大规模培养上受到诸多目素的限制。首先．能适应于大池培养的微藻种必须是在极端环境下能快速生长的藻种．然而能满足这些条件的藻种目前并不是太多，其次，培养过程受光照、温度等自然环境影响较大．并且易被真菌、原生动物和其他杂藻污染．同时水分蒸发严重，二氧化碳供给不足。此后，基于上述缺点，科学家们又开辟出新的培养方法，

主要有密闭式光生物反应器培养和异养培养。利用密闭式光生物反应器培养微藻。能够最大限度的控制养殖环境．减少污染发生，提高产量，据Cohen和Arad[10]报道，利用这一技术可使Porphyridium的产量增加60%~300%，同时还可以降低收获成本。另外，Johns等[11]则先后从众多积累PUFA的微藻中也筛选出能异养藻种．如：群孢小球藻(Chlorella sorckinana)，小球藻(C.saccharophia)，柯氏隐甲藻(Crypteodinium cohnil)，菱形藻(Nitzschia alba)．卡德藻(Tetraselmis suecian)．单衣藻(Chlamydomonas reinhardtn)。因此，选育富集DHA和EPA的异养藻种，设计适合的培养基及选择恰当的培养条件，实现微藻大规模异养培养生产PUFA是完全可能．而且也是可行的。2.3.微生物生产抗生素

自1929 年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡萄球菌生长以后，相继发现了链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素。在近几十年内，抗生素的研究又有了飞速的发展，已找到的抗生素有数千种，其中具有临床效果并已利用发酵法大量生产和广泛应用的多达百余种。同时抗生素的产量也大幅度提高，青霉素也由最初的100U/mL，通过诱变育种和优化发酵工艺的方法，目前以提高到105~106 U/mL。

随着抗生素的广泛使用，病原菌的耐药性也随之提高。人类迫切需要新一代抗菌药物来代替抗生素。抗菌肽是生物体内产生的一类具有生物活性的小分子多肽，最先从昆虫中发现，后来人们相继从细菌、真菌、两栖类动物、哺乳动物乃至人类中也发现并分离获得抗菌肽。研究表明，抗菌肽对细菌、真菌、病毒和原虫都具有杀灭作用，甚至对癌细胞也有杀伤作用。在医药方面，抗菌肽可望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。从昆虫等生物体内分离纯化获得的抗菌肽，数量很少，生产成本高，不能满足应用的需要。随着基因工程技术的迅速发展，对原有抗菌肽基因进行改造，再将其导入大肠杆菌或酵母菌等工程菌内，获得能产生重组抗菌肽的工程菌，为工业化生产抗菌肽提供了全新的途径。梁洁等[12]针对转基因酵母菌的生产及产素特点，优化抗菌肽发酵生产工艺，获得摇瓶发酵液的杀菌效价为5736

IU/mL，在500 L 发酵罐中培养，发酵液抗菌肽的最高效价可达到6734 IU/mL。

2.4.微生物生产抗癌药物

在微生物的代谢产物中，存在着许多有抗癌活性的物质。在美国，报道从紫杉树皮中获得一种叫安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae) 的真菌，有产紫杉醇的能力；紫杉醇主要是由红豆衫属树种产生的一种二萜类抗癌新药。经临床验证，具有良好的抗肿瘤作用，特别是对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。紫

杉醇是近年国际市场上最热门的抗癌药物，被认为是人类未来20 年间最有效的抗癌药物之一。，由于紫杉醇在植物体中的含量相当低，大约13.6kg 的树皮才能提出1g 的紫杉醇，治疗一个卵巢癌患者需要3－12 棵百年以上的红豆杉树，也因此造成了对红豆杉的大量砍伐，致使这种珍贵树种已濒临灭绝。而通过基因工程技术，微生物发酵等方法可以极大提高产量，降低成本，同时也保护了这些珍惜的植物品种。2001年，周东坡等[13]东北红豆杉中分离到3 株紫杉醇产生菌，其中HQD33通过紫外线、EMS、60Co-γ-ray、NTG 等诱变剂顺序诱变得到高产突变株NCEU-1 ，其紫杉醇产量到达314.07μg/L，远远高于原始出发菌株紫杉醇的产量（51.06μg/L－

125.70μg/L），王世伟等[14]采用双亲灭活原生质体融合的实验进一步提高了紫杉醇的产量，使紫杉醇的产量达到468.62μg/L；

2.5.微生物生产医用酶制剂

目前，我国每年约有60 万人死于冠心病，约120 万人死于脑梗塞、脑溢血，而美国每年约有15万人死于中风，约80% 的病例是由于阻止血液流向大脑的血凝块引起而导致突发性死亡。近年来, 除链激酶、链道酶、尿激酶、葡萄糖激酶、金葡激酶、组织型纤溶酶激活剂等之外，蚓激酶也得到开发[14]。它们都是溶血栓的有效药物，已进入临床实用。微生物生产的溶栓酶存在其优越性：只要有高产菌种，生产工艺条件确定以及产品的有效性或高效性，即可实现规模生产。蚓激酶(1umbrokinase，LK)，也称蚯蚓纤维蛋白水解酶(earthorm fibrinolytic enzymes，EFE)。是蚯蚓中一种纤溶性蛋白酶。大量体内外试验表明，多数LK具有抗凝、纤溶、抗血栓及溶血栓作用。陆琳等[15]采用健康志愿者进行I期临床试验的方法，研究注射用蚓激酶对人体的出凝血指标的变化情况。结果该注射用蚓激酶具有降纤和抑制血小板聚集的作用，且可同时作用于内源性凝血系统，使部分凝血活酶活化时间延长，短时间内就能起到溶栓作用。而直接从蚯蚓中提取蚓激酶的工艺复杂，成本高昂，不适合规模化生产，利用微生物发酵生产蚓激酶是目前的热点研究课题。姜琼等[16]通过载体构建，将蚓激酶基因转化到大肠杆菌中，并实现蚓激酶基因在大肠杆菌中的高效表达。张成瑶[17]将蚓激酶基因转化到毕赤酵母中，实现蚓激酶基因在毕赤酵母中的高效表达。

纳豆在日本已有1000多年的食用历史，它除了被当作食品食用，民间还可作为药品，以预防和治疗心脑血管性疾病。1987 年，Sumi等[18]报道纳豆提取物含有一种溶解血栓的酶，并定名为纳豆激酶(Nat-tokinase)。该酶能显著溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间，并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂。作为一种新型的溶血栓药物，纳豆激酶与当前使用的溶血栓药物相比，具有众多优点，

主要表现在[19]：1. 纳豆激酶来源于食品纳豆，安全性可靠；2. 纳豆激酶分子量远远小于UK、t-PA，是一个单链蛋白，易被人体吸收，且作用时间长（大于8h），因此有可能成为口服性药物；3. 纳豆激酶直接作用于纤维蛋白，对纤维蛋白有特异性，但不会破坏体内的纤维蛋白原；4. 纳豆激酶可促使血浆中t-PA含量明显增加，从而进一步增加人体的纤溶活性；5. 纳豆激酶可以通过液体发酵生产，造价低廉。由此可见，纳豆激酶在治疗血栓病方面前景十分广阔。目前，纳豆激酶已经可以通过微生物发酵获得，鲍时翔等[20]通过纳豆菌液体发酵，生产纳豆激酶。发酵72h后，通过纤维平板法检测得，产酶量相当于786尿激酶IU/mL。

参考文献

[1].陈涛，陈宗胜，马国华．三抱布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素的研究［J］．微生

物学通报．1998，25，（2）：79~81．

[2].何海燕，覃拥灵，覃勇荣．粘红酵母R3-25发酵生产胡萝卜素的研究［J］．粮食

与饲料工业．2008，10：29~31．

[3].胡萍．红酵母发酵生产胡萝卜素培养条件的优化研究［J］．食品科学．2000，21，

（9）：19~21．

[4].宋友礼．水溶性维生素微生物合成法进展［J］．中国医药工业杂志1995，26，（6）：

278~282．

[5].王毅武，伊光琳，维生素C发酵新工艺中2-氧代-L-古洛糖酸发酵液絮凝处理研

究．中国医药工业杂志．1997，28，（6）：243-288．

[6].Anderson S，Marks C，Lazarics R，et．Al．Production of 2-ke-to-L-gulonate，an

intermediate in L-ascorbate synthesis，by a genetically modified Erwinia herbicola ［J］．science，1985，230：144．

[7].李海娜，高仁喜，田胜军，刘艳．天然维生素生产技术现状．湿法冶金［J］．2003，

22，（9）：113~117

[8].Tani Y，Tsumura H，Screening for toeopherol-producing microorganisms and α

-tocopherol production by Euglena gracilis Z．Agric Biol Chem，1989，53：305~312．[9].Fujita T，Ogbonna J．C，Hideo H．et al．Effect of mixed organic substrate on α

-tocopherol production by Euglena gracilis in photoheterotrophic culture．Appl Microbiol Biotechnol．2008，79：371—378．

[10].Cohen E. Arad(Malis) S. A closed system for outdoor cultivation of Porphyridium

cruentum［J］．Biomass，1989，18：59-67．

[11].Tan C.K Johns M.R Screening of diacoms for hererotrophic ecosapentaenoic acid

production［J］．J Appl Phycol，1996，8：59-64．

[12].梁洁，彭中健，梁淑娃，李运南．转基因酵母菌深层发酵生产抗菌肽的研究

现代［J］．食品科技2009，25，(6)．

[13].周东坡，孙剑秋，于寒颖，平文祥，郑喜群．中国一新记录属多节孢属．菌

物系统，2001．20(2)：277-278．

[14].王世伟，马玉超，赵凯，张建，齐晓辉，周东坡．紫杉醇内生真菌的生物多

样性．菌物研究，2003，1(1)：28-32．

[15].陆琳，徐以南，刘健，等．注射用蚓激酶临床药效观察[J]．南京医科大学学

报（自然科学版）．2007，27，(11)：45~48．

[16].姜琼，易增兴，陈武．蚓激酶基因在大肠杆菌中的表达[J]．安徽农业科

学．2008，36，(31)：13557~13558．

[17].张成瑶．蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达．天津大学，硕士学位论文．2007．

[18].Sumi H，Hamada H，Tsuhima H，et al．A novel fibrinolytic enzyme (nattckinase)

in the vegetable cheese Natto a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]．Experientia，1987，43，(10)：1110．

[19].Urano T，Ihara H，Umemura K，et al．The profibrinolytic enzyme subtilisin NAT

punified from Bacillus subtilis Cleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1[J] ．J Biol Chem，2001，276，(27)：24690．

[20].鲍时翔，田艳，黄惠琴，凌华，吕家森．纳豆菌液体发酵生产纳豆激酶的研

究[J]．药物生物技术．2002，9，（6）：322~325．