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实验一 薄层层析板的制备

实验一 薄层层析板的制备
实验一 薄层层析板的制备

实验一薄层层析板的制备

一、实验目的

制备薄层层析板,使叶绿素在层析板上分离显色。

二、实验原理

薄层层析,常用 TLC(Chromatography)表示,又称薄层色谱,属于液-固吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法,它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品(几到几十微克,甚至 0.01 μg )的分离;另一方面若在制作薄层板时,把吸附层加厚,将样品点成一条线,则可分离多达 500mg 的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。

薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺和纤维素。其颗粒大小,一般要求直径为10~40μm。硅胶是无定形多孔性物质,略具酸性,适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为:“硅胶H ”—不含粘合剂;“硅胶G ”—含煅石膏粘合剂;“硅胶HF 254 ”—含荧光物质,可用于波长为 254nm 紫外光下观察荧光;“硅胶GF 254 ”—既含煅石膏又含荧光

剂等类型。粘合剂除上述的煅石膏(半水合硫酸钙: 2CaSO

4 · H

2

O )外,还

可用淀粉、羧甲基纤维素钠。

三、实验材料、器具

1、试剂硅胶、4‰的CMC溶液(羧甲基纤维素钠)

2、实验用具:药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒

四、实验步骤

1、载玻片要求平滑清洁,没有划痕,在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤,再用水冲洗干净。(干净的标准:水不是呈股流下,而是呈瀑布状态流下。)

2、与硅胶混合:CMC-Na溶液与硅胶的比例为3:1(3ml:1g)。取CMC-Na溶液倒入研钵中,然后加入硅胶,在研钵中研磨,按一个方向研磨,自下而上,然后自上而下,以赶尽气泡为佳。

3、铺板:将载玻片置于平台上,用药匙舀取糊状硅胶,均匀地铺在载玻片表面。铺板时,可以顺着板中间倒,也可以顺着某个边缘倒,也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上,倒时也要注意不要引入小气泡。尤其是载板的四个角,容易高出玻璃板其他部位,所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好的板,表面看上去要光滑平整,没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台面上,否则难保证板面硅胶的厚度均匀。(3g硅胶大约可铺7.5×2.5cm载玻片5-6块)

4、晾干:置水平台上于室温下晾干。

5、活化:将晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min,然后取出,放入干燥器中,备用。活化硅胶有利于提高硅胶的吸附性能,同时排除硅胶内部已吸收的水分及其他气体。通过活化硅胶,主要改变了硅胶内部的微孔结构,使其孔径的大小及微孔结构的排列得到进一步的改善。但是这样硅胶的吸附变大,可能会使样品分离困难。

下面先介绍一下配置方法:

1. CMC-Na溶液的配置:一般其浓度为0.3~0.5%,根据自己经验而定(我习惯用0.4%的)。具体方法如下:先将预用的水加热至60~70℃,然后加入CMC-Na,边加边搅拌,使之溶解,即得。

2. 与硅胶混合:CMC-Na溶液与硅胶的比例为3:1。具体方法如下:先将CMC-Na溶液倒入自动搅拌器或研钵中,然后加入硅胶,搅匀即可。若是在研钵中研磨,按一个方向研磨,自下而上,然后自上而下,以赶尽气泡为佳。

3. 铺板:手动或机械。手动铺出的板的薄厚与所加的混合后的硅胶量有关,而机械铺出的板的薄厚与机械所选用的钢板有关,可根据需要来定。但此过程中最关键的是板子边缘铺得好坏,手动铺板一定要将玻璃板边缘硅胶涂匀(我习惯用两头掂法,即板下方的中间垫一物体,两头悬空,两手均匀掂动)。而机械铺板要注意板与板之间平整性,或者由高到低排列。

4. 晾干:自然晾干。

5. 活化:将晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min,取出,放入干燥器中,备用。

这是实验室和检验室薄层层析板常用的制备方法之一,供大家参考!

层析英文名称:chromatography

定义1:基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时,各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。

定义2:利用某种类型的固定介质,根据混合物分子的电荷大小和分子量不同等性质,在流动相和固定相之间进行分离的一种生物化学技术。

层析(chromatography)是“色层分析”的简称。利用各组分物理性质的不同,将多组分混合物进行分离及测定的方法。有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析。层析利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例,达到分离目的的技术。层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力

在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相,把液体(与上述液体不相混合的)或气体作为移动相的系统中,使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动,利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差,将它们彼此分离开的定性与定量分析方法,称为层析,亦称色谱法。根据移动相种类的不同,分为液体层析、气体层析二种。用作固定相的有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等,或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体,也可使用其他物质。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析(column chromatogra-phy),在玻璃板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析(thin-layer chromatography),

后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析,即在固定相的一端,点上微量试料,在密闭容器中,使移动相(液体)从此端渗入,移动接近另一端。通过这种展开操作,各成分呈斑点状移动到各自的位置上,再根据Rf值的测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时,可利用适当的显色剂,或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开(这时的展开方向应与原方向垂直),使各成分分离完全的双相层析(two-dimensional chromatography)。分离后,将斑点位置的固定相切取下来,把其中含有来自试料的物质提取进行定量分析。但为制备与定量,柱层析则更为适宜。在柱层析中,移动相从加入试料的一端展开到达另一端后,继续展开使各成分和移动相一起向柱外分别溶出,这就是广泛使用的所谓洗提层析(elution chromatograph y)。层析根据固定相与溶质(试料)间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型(离子交换层析)等三种类型。但这并不是很严格的,有时常见到其中间类型。此外,近来也应用亲和层析,即将与基质类似的化合物(通常为共价键)结合到固定相上,再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。

按层析的机理划分:

吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

吸附层析:利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异,达到分离鉴定的目的。

分配层析:利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同,使之分离。

离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。

凝胶层析:利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

◆按流动相与固定相的不同划分:

气相层析、液相层析。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动相和固定相,划分为:气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等。

◆按操作形式划分:

柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。

柱层析:将固定相装于柱内,使样品沿一个方向移动而达到分离。

纸层析:用滤纸做液体的载体,点样后,用流动相展开,以达到分离鉴定的目的。

薄层层析:将适当粒度的吸附剂铺成薄层,以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。

以上划分无严格界限,有些名称相互交叉,如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析,纸层析是一种分配层析,柱层析可做各种层析。

基本原理

层析须在两相系统间进行。一相是固定相,需支持物,是固体或液体。另一相为流动相,是液体或气体。当流动相流经固定相时,被分离物质在两相间的分配,由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡,即不断经历吸附和解吸的过程。随着流动相不断向前流动,被分离物质间出现向前移动的速率差异,由开始的单一区带逐渐分离出许多区带,这个过程叫展层。

系数K是物质在两相中的浓度比。K值大,则在固定相中吸附牢,K值小吸附差。各物质间的K值差别大,则易被分离。不同类型层析的K值含义不同,可视为吸附平衡常数,分配常数或离子交换常数等。

研究层析现象而发展的塔板理论,与有机化学实验中的分馏法原理有些相似。被分馏的有机溶剂在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层,从而把低沸点溶剂先分馏出来,达到纯化的目的。在层析时用理论塔板数n

来衡量层析效能。

tR为物质在层析柱上的保留时间,W为洗脱下来的物质峰形的宽度。n 值愈大表示层析柱的效能愈高。如用理论塔板高度H表示,则包含了层析柱长度的因子。

式中L为层析柱的柱长。H值越大,则柱效越低。

此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等因素。因此选择层析固定相支持物的粒度、均匀度等物理性能,流动相的层析系统和温度等都是做好层析的关键

几种常用的层析

◆吸附层析

吸附剂的吸附力强弱,是由能否有效地接受或供给电子,或提供和接受活泼氢来决定。被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性,吸附就更牢固。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为:活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化。大多数吸附剂遇水即钝化,因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离,较少用于无机化合物。洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是:醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。为了能得到较好的分离效果,常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合,得到合适洗脱能力的溶剂系统,以获得最佳分离效果。

◆分配层析

在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等,这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解,但分配比率不同,展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。

◆离子交换层析

支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子,如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团的,如磺酸基(—SO3H)、羧甲基(—CH2COOH)和磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团的,如DEAE—(二乙基胺乙基)和QAE—(四级胺乙基)等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物,包括有机物和无机物。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后,能吸引水中被分离物的离子,各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态,各种离子有不同的交换常数,K值愈高,被吸附愈牢。洗脱时,增加溶液的离子强度,如改变pH,增加盐浓度,离子被取代而解吸下来。洗脱过程中,按K值不同,分成不同的区带。

◆凝胶过滤层析

支持物是人工合成的交联高聚物,在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层,凝胶周围的水为外水层。控制交联度以形成不同孔径的网状结构。交联度小的孔径大,交联度大的孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入,大于孔径的分子被排斥在外水层,最先被洗脱下来。而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。选择不同规格的凝胶,可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。这种方法曾被称为分子筛。目前常用的凝胶商品有:葡聚糖凝胶(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(bio-gel)、琼脂糖凝胶(sepharose)和聚苯乙烯凝胶(styragel)等。

◆亲和层析

在一对有专一的相互作用的物质中,把其中之一联结在支持物上,用于纯化相对的另一物质。常见的亲和对如:酶和抑制剂,抗原和抗体,激素和受体等。支持物为琼脂糖或纤维素等。

◆气相层析

属于分配层析或吸附层析,仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。固定相是在惰性支持物(如磨细的耐火砖)上覆盖一层高沸点液体,如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物。外涂层约为支持物重量的20%。分析时操作温度范围,一般从室温到200℃。特殊的层析柱能达到500℃。流动相常用氦、氩或氮为展层气体。气相层析分离的区带十分清晰,是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡,所需分析时间大为缩短,一般为

数分钟至10余分钟。检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果,因而测定样品量可到微克和毫微克水平。具有快速、灵敏和微量的优点。气相层析也能用于分离制备样品,但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。

◆纸层析

以滤纸为支持物的分配层析。组成滤纸的纤维素是亲水物质,能形成水相和展层溶剂的两相系统,被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物,可做双向层析。1944年A.J.P.马丁第一次用纸层析分析氨基酸,得到很好的分离效果,开创了近代层析的发展和应用的新局面。70年代以后,纸层析已逐渐为其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法,如离子交换层析、薄层层析、高效液相层析等所代替。

◆薄层层析

在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1~2毫米的支持物,如纤维素、硅胶、离子交换剂、氧化铝或聚酰胺等,根据需要做不同类型的层析。聚酰胺薄膜是一种特异的薄层,将尼龙溶解于浓甲酸中,涂在涤纶片基上,当甲酸挥发后,在涤纶片基上形成一层多孔的薄膜,其分辨力超过了用尼龙粉铺成的薄层。薄层层析较纸层析优越在于分辨高,展层时间短。例如用纸层析做氨基酸分析,往往需要两天时间,而且对层析条件要求严格,不易得到满意的分离效果。如用薄层层析做,一般约需半小时,分离效果更好。薄层层析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制备样品。

◆高效液相层析(又名高压液相色谱)

70年代新发展的层析法。其特点是:用高压输液泵,压强最高可达5000psi(相当于34个标准大气压)。用直径约3~10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一层1~2微米的二氧化硅,经硫酰氯反应生成Si—Cl,进一步连接疏水的烷基,如Si—C18H37,或阳离子交换基团—Si(CH2)n—C6H4SO3H,或阴离子交换基团—Si(CH2)nNH2。这种支持物能承受很高的压力,化学性能稳定。用不同类型支持物的HPLC,可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析。其分析微量化可达10-10克水平。但用于制备,可以纯化上克的样品。展层时间短,一般需几分钟到10余分钟。其分析速度、精确度可与气相层析媲美。HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。而气相层析只适用于挥发性物质,两者互为补充,都是目前最为理想的层析法。HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪,数据处理的积分仪和记录仪等电子系统,成为一种先进的分析仪器,在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。

◆反相层析

在吸附层析中,高极性物质在层析柱上吸附较牢,洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的

烷烃类,洗脱液用极性强的溶剂,如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附,最先洗下来,得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反,故称为反相层析。目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱,即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团。

◆同系层析

在核酸分析中,将样品经核酸酶部分裂解成不同长度的核苷酸片段,用同位素标记后,在DEAE纤维素薄层上分离,用含有未标记的相同的核苷酸片段作展层溶剂,这样,未标记的核苷酸把标记过的核苷酸推进,使按分子量大小不同把标记核苷酸片段,按由小到大的次序排列,达到分离的目的。于是把这种层析法称为同系层析。同系层析和电泳相结合曾用于寡核苷酸的顺序分析。

纸层析是层析法的一种,要了解纸层法还得从层析法开始.层析法又称色层分析法或色谱法(Chromatography),是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同,使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如:我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异,使其在流动相与固定相之间的分配系数(或称分配常数)不同,达到彼此分离的目的。

层析法的最大特点是分离效率高,它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定,又可用于大量物质的分离纯化制备。因此,作为一种重要的分析分离手段与方法,它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在,它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。

层析根据固定相基质的形式分类,层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析。

实验一薄层层析板的制备

实验一薄层层析板的制备 一、实验目的 制备薄层层析板,使叶绿素在层析板上分离显色。 二、实验原理 薄层层析,常用 TLC(Chromatography)表示,又称薄层色谱,属于液-固吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法,它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品(几到几十微克,甚至0.01 μ g )的分离;另一方面若在制作薄层板时,把吸附层加厚,将样品点成一条线,则可分离多达 500mg 的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。 薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺和纤维素。其颗粒大小,一般要求直径为10~40μm。硅胶是无定形多孔性物质,略具酸性,适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为:“硅胶H ”—不含粘合剂;“硅胶G ”—含煅石膏粘合剂;“硅胶HF 254 ”—含荧光物质,可用于波长为 254nm 紫外光下观察荧光;“硅胶GF 254 ”—既含煅石膏又含荧光 剂等类型。粘合剂除上述的煅石膏(半水合硫酸钙: 2CaSO 4 · H 2 O )外,还 可用淀粉、羧甲基纤维素钠。 三、实验材料、器具 1、试剂硅胶、4‰的CMC溶液(羧甲基纤维素钠) 2、实验用具:药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒 四、实验步骤 1、载玻片要求平滑清洁,没有划痕,在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤,再用水冲洗干净。(干净的标准:水不是呈股流下,而是呈瀑布状态流下。) 2、与硅胶混合:CMC-Na溶液与硅胶的比例为3:1(3ml:1g)。取CMC-Na溶液倒入研钵中,然后加入硅胶,在研钵中研磨,按一个方向研磨,自下而上,然后自上而下,以赶尽气泡为佳。 3、铺板:将载玻片置于平台上,用药匙舀取糊状硅胶,均匀地铺在载玻片表面。铺板时,可以顺着板中间倒,也可以顺着某个边缘倒,也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上,倒时也要注意不要引入小气泡。尤其是载板的四个角,容易高出玻璃板其他部位,所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好的板,表面看上去要光滑平整,没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台面上,否则难保证板面硅胶的厚度均匀。(3g硅胶大约可铺7.5×2.5cm载玻片5-6块) 4、晾干:置水平台上于室温下晾干。 5、活化:将晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min,然后取出,放入干燥器中,备用。活化硅胶有利于提高硅胶的吸附性能,同时排除硅胶内部已吸收的水分及其他气体。通过活化硅胶,主要改变了硅胶内部的微孔结构,使其孔径的大小及

氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为静止相,他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值) Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。 用混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有甘氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,中间画两个圆点(原点)。 2、取毛细管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在上面两个点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层(大约2~3小时)。 4、取出滤纸,用铅笔记下溶剂前沿,然后用热风吹干(或烘箱60℃)烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液,注意使溶液不倒流,不间断。 6、用吹风机吹干,观察层析点,确定其几何中心。 7、量取数值,计算各自的Rf值,与表中标准氨基酸Rf值比较,确定样品氨基

氨基酸的薄层层析

实验4 氨基酸的薄层层析 一、实验原理 薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点,已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域,对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。 薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样,不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样,点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同,因而可以彼此分开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行,而将样品各组分分离开。本实验应用硅胶作为固相支持物,用羧甲基纤维素钠作为粘合剂,以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂,测定混合氨基酸中各分离斑点的R f值(R f值详见第一篇第三章第五节),以分离和鉴别混合氨基酸的成分。 氨基酸的显色反应:茚三酮水化后生成水化茚三酮,它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛,与此同时,还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。 二、实验材料 (一)样品 1.氨基酸标准溶液: (1)0.01mol/L丙氨酸:称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 (2)0.01mol/L精氨酸:称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 (3)0.01mol/L甘氨酸:称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 2.混合氨基酸溶液:将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。 (二)试剂

1.硅胶G(C.P.) 2.0.5%羧甲基纤维素钠(CMCNa):取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中,煮沸,静置冷却,弃沉淀,取上清备用。 3.展开溶剂:按80:10:10比例(V/V)混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水,临用前配制。 4.0.1%茚三酮溶液:取茚三酮(A.R.)0.1g溶于无水丙酮(A.R.)至100ml。 5.展层-显色剂:按照10:1比例(V/V)混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。 (三)仪器及器材 1.层析板(6×15cm); 2.小烧杯; 3.量筒(10mL); 4.小尺子; 5.吹风机; 6.毛细玻璃管; 7.层析缸; 8.烘箱。 三、实验步骤 (一)实验流程 (二)操作步骤 1.制板 ↓(1)调浆:称取硅胶3g,加0.5%的羧甲 基纤维素钠8ml,调成均匀的糊状。 (2)涂布:取洁净的干燥玻璃板a均匀涂 a. 玻璃板要清洁平整,无油污。 b. 粘在玻璃板侧面边上的硅胶 粉应去掉,否则在层析时会有较

实验一 薄层板的制备

实验一 薄层板的制备、活度测定及应用 1. 目的要求 1.1 掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法 1.2 掌握吸附剂活度测定的原理及方法 1.3应用薄层层析法检测以中草药化学成分 2.实验原理 2.1薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定,也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。根据分离的原理不同,薄层层析可以分为两类:用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析;用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层,属于分配薄层层析。薄层层析中以吸附簿层为多用,吸附薄层中常用的吸附剂为氧化销和硅胶。 2.2 吸附簿层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同,及展开剂对它们的解吸附能力的小同,使各成分达到分离。吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力,还受被吸附成分的性质影响,更与展开剂的性质有关。 2.3分配簿层层析的原理是,用极性溶剂吸附在同体支持剂上所形成的混合物,铺成簿层(或装柱),然后活化、点样(或上样),再用极性较弱的展开剂(或洗脱剂)进行展开。在展开过程中,各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配。由于各成分在两相间的分配系数不同,因而可以达到相互分离的目的。 2. 4由于化合物的极性不同,吸附能力不相同,在展开剂上移动,进行不同程度的解析,根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离,计算比移值(R f ): f R =溶质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离 化合物的吸附能力与它们的极性成正比,具有较大极性的化合物吸附较强,因此R f 值较小。在给定的条件下(吸附剂、展开剂、板层厚度等),化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的,即R f 值是化合物的物理常数,其大小只与化合物本身的结构有关,因此可以根据R f 值鉴别化合物 2.5薄层层析可适用小量样品(几到几十微克甚至0.01g μ)的分离:也可用于多达500mg 样品的分离,是近代有机化学中用于定性、定量的一种重要手段。特别适用于那些挥发性小的化合物,以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。

纸层析法分离氨基酸实验报告

纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法,是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分,流动相为不与水相溶的有机溶剂;也可使纸吸留其他物质作为固定相,如缓冲液,甲酰胺等。将试样点在纸条的一端,然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后,各组分移动距离不同,最后形成互相分离的斑点。将纸取出,待溶剂挥发后,用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较,进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下,以溶剂溶出组分,用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。

在环境分析测试中,有时用纸层析法分离试样组分,它用于一些精度不高的分析,如3,4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎,浸出绿色液体,将液体与层析液(石油醚)混合,将滤纸一段进入混合液体,四种色素在层析液中的溶解度不同,在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离,叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b,它们在层析液中的溶解度不同,溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快,反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带,所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位,广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一,氨基酸的需求量越来越大,品种变更越来越快,工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨,而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起,氨基酸的应用在食品工业占61,,在饮料工业占30,,医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: (1)在食品行业的应用 (2)在医药工业的应用

薄层色谱TLC(点板)的基本原理

薄层色谱(点板)的基本原理 ★★ 薄层色谱,或称薄层层析(thin—1ayer chromatography),是以涂布于支持板上的支持物作为固定相,以合适的溶剂为流动相,对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法,从50年代发展起来至今,仍被广泛采用。 (一)基本原理 薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板,也可用涤纶布等)上形成薄层,然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同,分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面,吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上,都可能发生吸附现象。

物质分子之所以能在固体表面停留,这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部,分子之间相互作用的力是对称的,其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的,向内的一面受到固体内部分子的作用力大,而表面层所受的作用力小,因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响,就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的,被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡,称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂,其主要原理是吸附力与分配系数的不同,使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时,带着样品中的各组分一起移动,同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同,以及吸附剂对它们的吸附能力的差异,最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开,则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定,同时也可以进一步采用某些方法

薄层色谱操作注意事项

薄层色谱操作注意事项 影响薄层色谱分析的因素有很多,比如样品处理方法、薄层板制备技巧、点样方法、展开剂的遴选、温湿度的掌控等等很多方面,在这里对其操作要点作一下简单介绍: 1铺制薄层板:铺板用的匀浆不宜过稠或过稀:过稠,板容易出现拖动或停顿造成的层纹;过稀,水蒸发后,板表面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1:2~3,硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间,根据经验来定,与空气湿度有关,一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断,越稠越难下滴。匀浆的稀稠除影响板的平滑外,也影响板涂层的厚度,进一步影响上样量。涂层薄,点样易过载;涂层厚,显色不那么明显。通常,板的质量对薄层鉴别的影响不是很大,影响最大的是展开剂的配制和展开系统的饱和。 2点样:尽量用小的点样管。如果有足够的耐性,最好只用1微升的点样管。这样,点的斑点较小,展开的色谱图分离度好,颜色分明。样品溶液的含水量越小越好,样品溶液含水量大,点样斑点扩散大。样品溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥器里晾干。 薄层色谱用于定量时,点样是最主要的误差来源。 供试液的溶剂均有不同程度的洗脱力,所以在点样的同时,样品在原点就可是成环形展开,原点直径的扩散促进了这种展开,Kaiser称之为“上样环形色谱效应”。如果样品在溶剂中的溶解度很大,原点将变成空心环。这种效应对随后的先行展开造成很不利的影响。 供试液的溶剂在原点的残留,也会改变展开的选择性,特别是供试液的溶剂与展开剂的极性相差较大时更明显。再者,亲水性溶剂残留在原点吸收大气中的水分(特别在高湿度环境)对色谱的影响也不可低估。因此点样时的同步干燥或继后干燥以除去原点残存的溶剂是需要的。但应尽可能避免高温加热,如用吹风筒加热,样品变为固态后,部分或全部强烈的吸附在吸附剂的颗粒上,而促进了硅胶的有催化作用的活性表面故态化学反应,导致样品的变性(尤其热不稳定物质),至少移动相在展开时对这部分样品的溶解速度比移动速度慢得多而形成拖尾(斑点拖尾的原因之一)。

实验四-氨基酸的纸层析法

姓名:郭沈杰年级专业:2012级生物科学同组者:蔡萍萍 学号:12050011012 实验四氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为固定相,它与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。 在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(R f值) R f=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 氨基酸无色,利用茚三酮反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 8、铅笔 9、直尺 四、实验试剂 1、精氨酸、苯丙氨酸、混合氨基酸(精氨酸、苯丙氨酸) 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,在上面相同间隔画3圆点(原圈直径约5mm)。 2、取毛细管3支,分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许,在原圈处点样,样点

薄层色谱法实验报告

实验报告 一、实验目的 掌握薄层色谱的基本原理及其在有机物分离中的应用。 二、实验原理 有机混合物中各组分对吸附剂的吸附能力不同,当展开剂流经吸附剂时,有机物各组分会发生无数次吸附和解吸过程,吸附力弱的组分随流动相迅速向前,而吸附力弱的组分则滞后,由于各组分不同的移动速度而使得她们得以分离。物质被分离后在图谱上的位置,常用比移值R f表示。 R f 原点至层析斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离 三、实验仪器与药品 5.0cm×15.0cm硅胶层析板两块,卧式层析槽一个,点样用毛细管。 四、物理常数 五、仪器装置图

“浸有层析板的层析槽”图 1-层析缸,2-薄层板,3-展开剂饱和蒸汽,4-层析液 六、实验步骤 (1)薄层板的制备: 称取2~5g层析用硅胶,加适量水调成糊状,等石膏开始固化时,再加少许水,调成匀浆,平均摊在两块5.0×15cm的层析玻璃板上,再轻敲使其涂布均匀。(老师代做!)固化后,经105℃烘烤活化0.5h,贮于干燥器内备用。 (2)点样。 在层析板下端2.0cm处,(用铅笔轻化一起始线,并在点样出用铅笔作一记号为原点。)取毛细管,分别蘸取偶氮苯、偶氮苯与苏丹红混合液,点于原点上(注意点样用的毛细管不能混用,毛细管不能将薄层板表面弄破,样品斑点直径在1~2mm为宜!斑点间距为1cm) (3)定位及定性分析 用铅笔将各斑点框出,并找出斑点中心,用小尺量出各斑点到原点的距离和溶剂前沿到起始线的距离,然后计算各样品的比移值并定性确定混合物中各物质名称。

实验注意事项 1、铺板时一定要铺匀,特别是边、角部分,晾干时要放在平整的地方。 2、点样时点要细,直径不要大于2mm,间隔0.5cm以上,浓度不可过大,以免出现拖尾、混杂现象。 3、展开用的烧杯要洗净烘干,放入板之前,要先加展开剂,盖上表面皿,让烧杯内形成一定的蒸气压。点样的一端要浸入展开剂0.5cm 以上,但展开剂不可没过样品原点。当展开剂上升到距上端0.5-1cm 时要及时将板取出,用铅笔标示出展开剂前沿的位置。 讨论: 七、思考题

薄层层析方法与注意问题

薄层层析 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上,成为薄层,把样品点到薄层上,用适宜的溶剂展开,从而使样品各组分达到分离的层析技术。如果支持剂是吸附剂,如硅胶、氧化铝、聚酰胺等,则称之为薄层吸附层析;如果支持剂是纤维素、硅藻土等,层析时的主要依据是分配系数的不同,则称之为薄层分配层析;同理,如果支持剂是离子交换剂,则称为薄层离子交换层析;薄层若由凝胶过滤剂制成,则称为薄层凝胶层析。 薄层层析的操作与纸层析相似,但比纸层析速度快,一般仅需15-30min,分辨力比纸层析高10-100倍,它既能分离0.01μg的微量样品,又能分离500mg 基至更多的样品作制备用。薄层的制备可规格化,样品滴加后可立即展开,不受温度影响。其缺点是Rf值的重现性比纸层析差,对生物大分子物质的分离效果不大理想。 一、支持剂的选择与处理 薄层层析的支持剂种类很多。使用时应根据欲分离物质的种类进行选择。 支持剂颗粒大小要适当。颗粒大,展开速度快。但颗粒过大时,分离效果不好;而颗粒过小,则展开速度太慢,容易出现拖尾现象。一般有机类支持剂如纤维素粉的颗料为70-140目(直径0.1-0.2mm),薄层厚度为1-2mm;无机类支持剂如氧化铝、硅胶等的颗粒一般为150-300目,薄层厚度为0.25-1mm。 在薄层层析中,使用较多的是硅胶、氧化铝等吸附剂,其处理方法同吸附柱层析。同样,用离子交换剂,凝胶过滤剂等为支持剂时,支持剂均要按柱层析处理填料的相应方法处理。 二、薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑,用前应洗净、干燥。 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等),调成糊状物所制成的薄层板为硬板,用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上,调成糊状物喷显色剂时不会冲散,可以直立展开,而软板只能接近水平展开。

氨基酸的薄层层析

生物化学实验报告 姓名: 学号: 专业年级: 组别: 生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称氨基酸的薄层层析 实验日期2018-11-7 实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握薄层层析法的一般原理。 2、掌握氨基酸薄层层析法的制版、点样、层析和显色等基本操作技术。 3、掌握如何根据移动速率(Rf值)来鉴定被分离的物质(即本次实验中氨基酸混合液)。 二、实验原理 1、薄层层析原理(色谱分析技术的一种): 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样,不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样,点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同,因而可以彼此分开。(即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行,而将样品各组分分离开来) 2、氨基酸与茚三酮的显色反应: 茚三酮水化后生成水化茚三酮,它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛,与此同时,还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 3、以相对迁移率-Rf值来判定氨基酸的种类: 层析中,物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到对应斑点前沿的距离 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的,故移动速率(Rf值)也是恒定的,因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与方法: 1、实验材料: (1)实验试剂:氨基酸的异丙醇溶液:丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 分析样品:混合氨基酸溶液 吸附剂:硅胶 粘合剂:0.5%的羧甲基纤维素钠 展开-显色剂(正丁醇、乙酸、茚三酮溶液) (2)实验器材:天平、层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻璃棒、量筒、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱 2、实验方法: (1)实验流程: ( 2)实验步骤: 步骤操作 ①制作硅胶层析板1、调浆称取硅胶3克,加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫 升,调成均匀的糊状。 2、涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥将玻璃板水平放置,室温下自然凉干。 4、活化70℃烘干30分钟。切断电源,待玻璃板面温度 下降至不烫手时取出。 ②在层析板上加氨基酸样品1、标记:用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。 2、取样:用毛细管分别吸取氨基酸溶液,取样量为毛细

薄层层析板

薄膜层析是用作分离和辨识化学物质的层析分析方法中最具多样性 的方法之一。这是一个简单,快速且有效的分离工具,用作量化或质 量分析。身为全球市场的领导者,默克提供您值得信赖的TLC 产品, 并拥有广泛的化学性质,尺寸和背景物质可以符合所有您应用的需 要。我们的薄膜板结合了机械性和表面同相性,呈现了不被干扰的分离效能。供自动化使用的HPTLC 设立了质量控管中可信赖且快速分析的标准。我们持续增加新的具创新性的产品以符合今日TLC 应用的需求。为您的分离工作选择最好的TLC 板,进一步了解默克TLC 板如何能让您的实验结果比从前更值得信赖。 高效硅胶薄层层析板(HPTLC) TLC平板自制备用鬆散吸收剂 超薄单石型硅平板(UTLC) 制备级层析片(PLC) CN-, Diol-, NH2- 修饰硅平板(TLC和HPTLC) 氧化铝薄层板(TLC) 混合层平板(TLC) 纤维素层析板(TLC and HPTLC) Concentrating Zone Plates (TLC, HPTLC和PLC) HPTLC特纯度平板 Multiformat Plates (TLC和HPTLC) GLP平板(TLC和HPTLC) 配套产品 流动相 经典硅胶薄层层析板(TLC) RP修饰硅平板(TLC和HPTLC) 胜肽分析平板 LiChrospher? 球状颗粒HPTLC平板 高效硅胶薄层层析板(HPTLC) These HPTLC plates deliver fast and quantitative analysis of complex samples for manual or automated use. Merck’s HPTLC silica plates wor k three times faster than conventional TLC plates –and they’re more sensitive. This makes our HPTLC plates perfect for advanced separations. HPTLC and TLC plates use the same type of silica gel 60. But in HPTLC particle sizes range between 4-8 μm, and the mean particle size measures 5-6 μm. This yields a smoother surface and a higher separation power than conventional TLC plates. Highly compact sample bands (thanks to lower band diffusion) and an thin 200 μm layer translate into greatly enhanced sensitivity. 目录编号产品 105547 HPTLC silica gel 60 ( 高效硅胶层析板) 25 Aluminium sheets 20 x 20 cm 105631 HPTLC Silica gel 60 ( 硅胶薄层层析板) 25 Glass plates 10 x 10 cm 105641 HPTLC Silica gel 60 ( 高效硅胶层析板) 50 Glass plates 20 x 10 cm 105633 HPTLC Silica gel 60 ( 高效硅胶层析板) 100 Glass plates 10 x 10 cm 105556 HPTLC Silica gel 60 F254 ( 高效硅胶薄层层析板) 20 Aluminium sheets 5 x 7.5 cm

薄层层析及纸层析常用显色剂配制及显色方法

薄层层析及纸层析常用显色剂配制及显色方法 通用试剂 (1) 重络酸钾-硫酸:检查一般有机物. 喷洒剂:5克重络酸钾溶于100毫升40%硫酸中. 薄层检查:喷洒后加热到150℃至班点出现 (2) 荧光素-溴:检查不饱和化合物 喷洒剂:0.1克荧光素溶于100毫升乙醇中 溴试剂:5%的溴的四氯化碳溶液 喷洒后处理:喷洒荧光素溶液后,放置存有溴溶液的缸内,可于紫外线分析灯下检查荧光,荧光素与溴化和成曙红(Eosin)(无萤光),而不饱和化合物则成溴加成物,保留了原有荧光;若点样较多,则呈黄色斑点,底板呈红色. (3) 碘:检查一般有机物. 方法:a 层析谱放密闭缸内或瓷盘内,缸内预先放有碘结晶少许,大部分有机 化合物呈棕色斑点。 B 层析谱放碘蒸气中5分钟(或喷5%碘的氯仿溶液)取出置空气中待过量的碘 蒸气全部挥发后,喷1%淀粉的水溶液,斑点转成蓝色。 (4)硫酸:通用 喷洒剂:5%的浓硫酸乙醇溶液,或15%浓硫酸正丁醇溶液,或浓硫酸-醋酸(1: 1) 喷洒后处理:空气中干燥15分钟,再热至110℃直至出现颜色或荧光。 (5)硝酸银-氢氧化铵(Tollen-Zaffaroni)试剂:检查还原性物质。 溶液I : 0.1%N硝酸银; 溶液II: 5N氢氧化铵 喷洒剂: I和II以1:5混合(临用前混合) 喷洒后处理: 105℃加热5~10分钟,至深黑色斑点出现. (6)磷钼酸或磷钨酸,硅钨酸:检查还原性物质,类脂体,生物碱,甾体 喷洒剂: 5~10%磷钼酸或磷钨酸或硅钨酸乙醇溶液 喷洒后处理: 120℃加热至斑点出现. 沉淀试剂: 1克硅钨酸溶于20毫升水中,加10%盐酸至强碱性. 生物碱 (7)硫酸??=硫酸:检查生物碱及含碘化合物 喷洒剂: 0.1克硫酸?混悬于4毫升水中,加入1克三氯醋酸,加热至沸,逐滴加入 浓硫酸至澄清. 喷洒后处理: 110℃加热数分钟至斑点出现. (8)碘化铋钾(Dragendorff)试剂:检查生物碱及其他含氟化合物. 溶液I: 0.85克次硝酸铋溶于10毫升冰醋酸40毫升水中 溶剂II: 8克碘化钾溶于20毫升水中. 制备液I+II,等体积混合.可用于棕色瓶中保存较长时间,一般制备液可作沉淀试剂 用. 喷洒液: 制备液1毫升与2毫升醋酸,10毫升水混合即得 (9).碘化汞钾(Mayer)试剂: 检查生物碱. 制备液: 13.55克氯化汞和49.8克碘化钾各溶于20毫升水中,等体积混合并用水 稀释至1000毫升.

【实验报告】纸层析的实验报告

纸层析的实验报告 前言 纸层析法纸层析法又称纸色谱法,是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分,流动相为不与水相溶的有机溶剂;也可使纸吸留其他物质作为固定相,如缓冲液,甲酰胺等。将试样点在纸条的一端,然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后,各组分移动距离不同,最后形成互相分离的斑点。将纸取出,待溶剂挥发后,用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较,进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下,以溶剂溶出组分,用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤 纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。 在环境分析测试中,有时用纸层析法分离试样组分,它用于一些精度不高的分析,如3,4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。在

做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎,浸出绿色液体,将液体与层析液(石油醚)混合,将滤纸一段进入混合液体,四种色素在层析液中的溶解度不同,在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离,叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b,它们在层析液中的溶解度不同,溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快,反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带,所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位,广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一,氨基酸的需求量越来越大,品种变更越来越快,工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨,而需求总量是800万吨。我国自20世纪20xx年代起,氨基酸的应用在食品工业占61%,在饮料工业占30%,医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: (1)在食品行业的应用 (2)在医药工业的应用 (3)在饲料添加剂行业的应用 (4)在化妆品行业的应用 (5)在农业上的应用 (6)在其他行业的应用

薄层层析的原理与操作

薄层层析的原理与操作 薄层色谱,或称薄层层析(thin-layer chromatography),是以涂布于支持板上的支持物作为固定相,以合适的溶剂为流动相,对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法,从50年代发展起来至今,仍被广泛采用。 一、基本原理 薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板,也可用涤纶布等)上形成薄层,然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同,分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面,吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上,都可能发生吸附现象。 物质分子之所以能在固体表面停留,这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部,分子之间相互作用的力是对称的,其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的,向内的一面受到固体内部分子的作用力大,而表面层所受的作用力小,因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响,就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的,被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡,称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂,其主要原理是吸附力与分配系数的不同,使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时,带着样品中的各组分一起移动,同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同,以及吸附剂对它们的吸附能力的差异,最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开,则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定,同时也可以进一步采用某些方法加以定量。 薄层层析有许多优点:它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点,同时展开速率快,一般仅需15~20分钟;混合物易分离,分辨力一般比以往的纸层析高10~100倍,它既适用于只有0.01μg的样品分离,又能分离大于500mg的样品作制备用,而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。 二、固定相支持剂的选择和处理 在薄层层析时,对支持剂的选择主要考虑两方面:一是支持剂的性质与适用范围;二是支持剂的颗粒大小。一般来说,所选吸附剂应具有最大的比表面积和足够的吸附能力,它对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力,即有足够的分辨力;所选吸附剂与溶剂及样品组分不会发生化学反应。吸附力的强弱规律可概括如下:吸附力与两相间界面张力的降低成正比,某物质溶液中被吸附的程度与其在溶剂中的溶解度成反比。极性吸附剂易吸附极性物质,非极性吸附剂易吸附非极性物质。同族化合物的吸附程度有一定的变化方向,例如,同系物极性递减,而被非极性表面吸附的能力将递增。

柱层析法和薄层层析法简介

柱层析法和薄层层析法简介 柱层析法 1. 原理 流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动,吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动,在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配,新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程,结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面,吸附强的组分移动在后面,吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动,各种化合物在色谱柱中形成带状分布,实现混合物的分离。 2. 柱色谱分离条件 ⑴固定相选择 柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时,非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用,吸附较弱;极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用,有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为: 成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强,在氧化铝上的吸附越强。 常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4-4.5,用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质;中性氧化铝pH值为7.5,用于分离中性物质,应用最广;碱性氧化铝pH为9-10,用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低,活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 硅胶是中性的吸附剂,可用于分离各种有机物,是应用最为广泛的固定相材料之一。 活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。吸附剂的粒度越小,比表面越大,分离效果越明显,但流动相流过越慢,有时会产生分离带的再重叠,适得其反。 ⑵流动相选择 色谱分离使用的流动相又称展开剂。展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。 在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配,强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多,弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多,随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。 在氧化铝柱中,选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带,流出色谱柱。

氨基酸薄层层析

氨基酸薄层层析 一、实验目的 1、理解并掌握薄层层析法的原理。 2、掌握氨基酸薄层层析法的正确的操作步骤。 3、掌握根据不同物质的移动速率(Rf 值)来鉴定被分离的混合物的各种组分。 二、实验原理 1.薄层层析原理 薄层层析时一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样,不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样,点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同,因而可以彼此分开。(即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行,而将样品各组分分离开来) 2.氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮,它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛,与此同时,还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 3.基于相对迁移率Rf 值判定混合氨基酸组分 薄层层析中,物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf 值 即:Rf = 原点到溶剂前沿的距离 距离 原点到层析斑点中心的

因为物质在一定溶剂中的分配系数是一定值,故其移动速率(Rf值)也是恒定的,因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法 A材料: 1样品: (1)0.01mol/L丙氨酸:称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。(2)0.01mol/L精氨酸:称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。(3)0.01mol/L甘氨酸:称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。(4)混合氨基酸溶液:将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液 2试剂: (1)硅胶G(C.P)。 (2)0.5%羧甲基纤维素钠(CMCNa):取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中,煮沸,静置冷却,弃沉淀,取上清备用。 (3)展开溶剂:按80:10:10比例(V/V/V)混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水,临用前配制 (4)0.1%茚三酮溶液:取茚三酮(A.R.)0.1g溶于无水丙酮(A.R.)至100ml。(5)展层-显色剂:按照10:1比例(V/V)混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。 3仪器及器材: ①层析板(6cmx15cm);②小烧杯;③量筒(10ml);④小尺子;⑥毛细玻璃管; ⑦层析缸;⑧烘箱 B实验步骤 制版点样层析显色结果处理于分析薄层层析的具体操作步骤:

薄层色谱板的制备和使用

实验一薄层色谱板的制备和使用 目的要求: 通过实验进一步理解薄层色谱技术理论,熟悉掌握薄层色谱板的制备和使用方法。 一、薄层层析的基本原理 把吸附剂(固定相)均匀地铺在一块玻璃板上,将待分离的样品溶液点加在一薄层板的一端,在密闭的容器中用适当的溶剂(流动相)展开,由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同及溶剂对不同物质溶解分配系数不同,当溶剂流过时,各物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附,解吸附,再吸附,再解吸附。不易被吸附或易被溶剂溶解的物质相对移动得快一些。经过一段时间的展开,不同的物质被彼此分开,最后形成相互分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后,应用特定的试药或方法将斑点显色,从而达到定性和定量的目的。 二、薄层板的制备 1.玻璃板 用一块玻璃板涂上很薄的吸附剂,如硅胶或氧化铝等,玻璃板要求薄厚一致,大小相同,表面光滑平整,一般玻璃只要合乎这些要求就可。如果找不到平整均一的,将旧光学照像底片截成同样大小也可以。用前先将玻璃用肥皂和水洗干净,必要时浸泡在清洗液中,然后水洗烤干,用纱布擦光。 玻璃板大小有各种规格,一般有20×20、20×10、20×5厘米,也有更小的,可根据需要自行设计。宽度要求至少能点开两三个样品,每两点之间相隔至少1.5厘米,玻板长度一般要满足展开10厘米的距离。点样的起点应距底边至少1.5厘米的距离。 2.吸附剂 应用最广泛的为硅胶和氧化铝,市场上有专供薄层色谱用的吸附剂,规格分不含粘合剂的硅胶H,氧化铝H和含有粘合剂熟石膏的硅胶G,氧化铝G,如市售硅胶G含13%熟石膏,氧化铝分中性、酸性、碱性三种。吸附剂的粒度范围最好在180-200目之间,太小了流速慢,太大则影响分离效果。如不合要求,应过筛。 3.薄层板的涂布 最简单的涂布方法是用两条比玻璃板厚0.25毫米的玻璃条或有机玻璃条(或在同样厚度的玻璃条下粘一层胶布),将玻璃板夹住,把调好的吸附剂浆液平铺在薄层板上,然后用一有机玻璃条或直尺,迅速均匀地向前推进,就象推血片一样,只要推进的速度均匀一致,

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