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柱色谱实验操作方法

一、液-固色谱原理

液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术,柱色谱属于液-固吸附色谱。

当混合物溶液加在固定相上,固体表面借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分,以不同的作用强度被吸附在固体表面。

由于吸附剂对各组分的吸附能力不同,当流动相流过固体表面时,混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少,吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动,吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动,在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配,新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程,结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面,吸附强的组分移动在后面,吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动,各种化合物在色谱柱中形成带状分布,实现混合物的分离。

柱色谱实验操作方法

二、柱色谱分离条件

(1)固定相选择

柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。

吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时,非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用,吸附较弱;极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用,有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为:

成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强,在氧化铝上的吸附越强。

柱色谱实验操作方法

常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等(表1)。

柱色谱实验操作方法

色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4~4.5,用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质;中性氧化铝pH值为7.5,用于分离中性物质,应用最广;碱性氧化铝pH为9~10,用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。

吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低,活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。

硅胶是中性的吸附剂,可用于分离各种有机物,是应用最为广泛的固定相材料之一。

活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。

吸附剂的粒度越小,比表面越大,分离效果越明显,但流动相流过越慢,有时会产生分离带的在重叠,适得其反。

(2)流动相选择

色谱分离使用的流动相又称展开剂。

展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。

在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配,强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多,弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多,随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。

柱色谱实验操作方法

在氧化铝柱中,选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带,流出色谱柱。

当一种溶剂不能实现很好的分离时,选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物,对其它组分不能展开洗脱,需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。

三、柱色谱分离操作

(1)柱色谱装置

柱色谱装置包括色谱柱、滴液漏斗、接受瓶。

柱色谱实验操作方法

色谱柱有玻璃制的和有机玻璃制的,后者只用于水做展开剂的场合。色谱柱下端配有旋塞,色谱柱的长径比应不小于7~8:1。

(2)分离操作

①装柱:

色谱柱的装填有干装和湿装两种方法。

干装时,先在柱底塞上少许玻璃纤维,再加入一些细粒石英砂,然后将准备好的吸附剂用漏斗慢慢加入干燥的色谱柱中,边加入边敲击柱身,务必使吸附剂装填均匀,不能有空隙。吸附剂用量应是被分离混合物量的30~40倍,必要时可多达100倍。加够以后,在吸附剂上覆盖少许石英砂。

湿装时,将准备好的吸附剂用适量展开剂调成可流动的糊,如干装时一样准备好色谱柱,将吸附剂糊小心地慢慢加入柱中,加入时不停敲击柱身,务必使吸附剂装填均匀,不能有气泡和裂隙,还必须使吸附剂始终被展开剂覆盖。

②洗柱:

干柱在使用前要洗柱,目的是排除吸附剂间隙中的空气,使吸附剂填充密实。洗柱时从柱顶由滴液漏斗加入所选的展开剂,适当放开柱下端的旋塞。加入时先快

加,再放慢滴加速度,使吸附剂始终被展开剂覆盖。洗柱时也要轻敲柱身,排出气泡。

③装样和洗脱:

将待分离的混合物用最小量展开剂溶解,小心加入柱中。待混合物溶液液面接近吸附剂上的石英砂时,旋开滴液漏斗旋塞,滴加展开剂。滴加速度以1~2滴/秒为适度。整个过程中,应使展开剂始终覆盖吸附剂。

1.吸附柱色谱

色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管,下端用棉花或玻璃纤维塞住,管内装入吸附剂。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀,以保证良好的分离效果。除另有规定外,通常多采用直径为0.07~0.15mm的颗粒。色谱柱的大小,吸附剂的品种和用量,以及洗脱时的流速,均按各品种项下的规定。

(1) 吸附剂的填装

①干法

将吸附剂一次加入色谱管,振动管壁使其均匀下沉,然后沿管壁缓缓加入洗脱剂;或在色谱管下端出口处联接活塞,加入适量的洗脱剂,旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出,然后自管顶缓缓加入吸附剂,使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

②湿法

将吸附剂与洗脱剂混合,搅拌除去空气泡,徐徐倾入色谱管中,然后加入洗脱剂将附着管壁的吸附剂洗下,使色谱柱面平整。俟填装吸附剂所用洗脱剂从色谱柱自然流下,液面和柱表面相平时,即加供试品溶液。

(2) 供试品的加入

除另有规定外,将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中,再沿色谱管壁缓缓加入,注意勿使吸附剂翻起。或将供试品溶于适当的溶剂中,与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽使呈松散状,加在已制备好的色谱柱上面。如供试品在常用溶剂中不溶,可将供试品与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

(3) 洗脱

除另有规定外,通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例,分别分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不再含有时,再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应保持有充分的洗脱剂留在吸附层的上面。

2.分配柱色谱

方法和吸附柱色谱基本一致。装柱前,先将载体和固定液混合,然后分次移入色谱管中并用带有平面的玻棒压紧;供试品可溶于固定液,混以少量载体,加在预制好的色谱柱上端。

洗脱剂需先加固定液混合使之饱和,以避免洗脱过程中两相分配的改变。