离子交换树脂层析分离混合氨基酸

实验二离子交换树脂层析分离混合氨基酸

【实验目的】

1. 了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术。

2. 学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。

【实验原理】

离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(＝R＝S03H)、弱(＝COOH)、强碱(＝N+＝R：)和弱碱(＝NH2＝NHR＝NR2)。

离子交换树脂分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大于物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大子、可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。

本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)碱性氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变脱液的pH 或离子强度可分别洗脱分离。

【实验材料】

1．实验器材

层析柱（1.6X20cm）；恒流泵；梯度混合器；试管及试管架；紫外分光光度计、磺酸阳离子交换树脂(Dowex 50)

2．实验试剂

(1)2mol／L HCl

(2)2mol／L NaOH

(3)0.1mOl／L HCl

(4)0.1mol／L NaOH

(5)pH4.2的柠檬酸缓冲液：0.lmol／L柠檬酸54m1加0.1mol／L柠檬酸钠46ml

(6)pH5的醋酸缓冲液：0.2mol／L NaAc 70ml加0.2mol／L HAc 30ml

(7)0.2％中性茚三酮溶液：0.2g茚三酮加100ml丙酮

(8)氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10m1加0.1mol／L HCl 3m

【实验方法】

1. 树脂的处理

100ml烧杯中置约10g树脂，加25ml 12mo1／L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充洗涤树脂至中性。加25ml 12mol／L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性。将树脂悬浮于50ml pH4.2柠檬酸缓冲液中备用。

2. 装柱

取直径0.8cm～1.2cm、长度10cm～12cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，在加入一些树脂，至树脂沉积至8cm～10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH为4.2为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

3. 加样、洗脱及洗脱液收集

打开山口使缓冲液流出，待液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干燥)。用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入0.1mol／L HCl 3ml，以10滴／min～12滴／min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1m1 pH4.2柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱，保持流速10滴／min～12滴／min 并注意勿使树脂表面干燥。

在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液呈紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测。

在用pH4.2柠檬酸缓冲液把第二个氨基酸洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析柱出口，将树脂顶部剩余的pH4.2柠檬酸缓冲液移去。

于树脂顶部加入2ml 0.1mo1／L NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面I续用0.1mo1／L NaOH洗脱并逐管收集(注意仍然保持流速10滴／min～12滴／min)，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检验，在第三个氨基酸用0.1mo1／L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性部分。

最后以洗脱液管号为横坐标，洗脱液各管光密度（以水作空白，在570nm波长读取吸光度）或颜色深浅（以-，±，+，++．．．表示）为纵坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。

【注意事项】

1. 在装柱时必须防止气泡、分层及柱子液面在树脂表面以下等现象发生。

2. 一直保持流速10滴/min～12滴／min，并注意勿使树脂表面干燥。

【思考题】

1. 为什么混合氨基酸从磺酸阳离子交换树脂上逐个洗脱下来?

2. 树脂如何保存?

Experiment 13 Separating Mixed Amino Acids by Ion – Exchange

Chromatography

【Purpose】

1. Know the principle and operating techniques of ion - exchange - resin chromatography.

2. Learn to use ion- exchange- resin chromatography to separate the mixed amino acids.

【Principle】

Ion - exchange resin is a kind of synthetic polymer. It can’t be soluble in water, but can expand by absorbing water to dilate. Polymer molecule consists of polar groups that can ionize and nonpolar resin. The ions on the polar groups can be exchanged with the ion in the solution, but the physical property of the nonpolar resin will not change. Usually the groups that carried by ion- exchange resin can be divided into strong acid (＝R＝SO3H ), weak acid (＝COOH ), strong base (＝N+＝R3 ) weak base (＝NH2＝NHR=NR2 ).

It’s relatively ideal to use ion - exchange - resin to separate small molecules such as amino acid, adenosine, and adenylate and so on. But it’s not proper for macro-molecule substance like protein, because it can’t diffuse into the chain structure of resin. So we can choose ion- exchange reagent that takes polysaccharide such as cellulose and dextran as the supporter to separate biological macromolecules.

This experiment uses sulfonic acid cation - exchange resin to separate the mixture of acidic amino acid (aspartic acid), neutral amino acid (alanine) and basic amino acid (lysine). In the condition of certain pH, the degree of their dissociation is different, so they can be respectively eluted and separated by changing the pH and the ion strength of eluting solution.

【Materials】

1. Apparatus:

(1)Column（16/20）

(2)Pump

(3)Gradient maker

(4)Ultraviolet meters

(5)Sulfonic acid cation- exchange- resin (Dowex 50)

2．Reagents:

(1)Hydrogen chloride (2mol/L)

(2)Sodium hydroxide (2mol/L)

(3)Hydrogen chloride (0.1 mol/L)

(4)Sodium hydroxide (0. 1mol/L)

(5)Citric acid buffer (pH4.2): 54ml of 0.1mol/L Citric acid and 46ml of 0.1mol/L sodium citrate

(6)Acetate acid buffer (pH5): 70mi of 0.2mol/L sodium acetate and 30ml 0.2mol/L acetate acid

(7)Neutral triketohydrindene hydrate solution (0.2%): 0.2g of triketohydrindene hydrate

and 100ml of acetone

(8)Mixture of amino acids: 10ml of each of alanine, aspartic acid, lysine and 3ml of 0.lmol/L hydrogen chloride

【Procedures】

1. The disposal of resin:

Put about 10g of resin in a 100ml beaker, add 25 of 12mol/L hydrogen chloride, and stir them for 2 hours. Eliminate the acid liquor, and wash the resin completely to neutral with distilled water. Add 25ml of 12mol/L sodium hydroxide to the above resin and stir for 2 hours. Eliminate the basic liquor, and wash it to neutral with distilled water. Suspense the resin in 50ml, pH4.2 sodium citric acid buffer, and keep it for use.

2. Packing:

Take a chromatography column with the diameter of 0.8 cm～1.2cm and the length of 10 cm～12cm, put a piece of glass cotton or sponge circular cushion at the bottom, and pour the above prepared resin from the top. Close the exit of chromatography column. When the resin sediment appears, let out the excessive solution, add more resin until the height of the resin sediment is about 8 cm～10cm. Add pH4.2 citric buffer from the top to wash it until the flowing liquor reaches pH4.2. Close the exit of the column, and keep the level of the liquor surface about 1cm higher than that of the resin.

3. Loading, elution and collection of eluent:

Open the exit to make the buffer flow out. When the level of the liquor is at almost the same height with that of resin, close the exit (don’t make the surface of resin dry). Use a long dropper to add 15 drops of mixture of amino acid to the top of resin directly and carefully, and open the exit to make it flow into the column slowly. When the level of the liquor is just at the same height as that of resin, add 3ml of 0.lmol/L hydrogen chloride, and elute it at the flowing rate of 10drops/minute～12drops /minute. Collect the eluent, 20 drops per tube and collect it one by one. When the level of hydrogen chloride solution is just at the same height as that of resin, use lml of pH4.2 citric acid buffer to wash the column wall once, then elute with 2ml of pH4.2 citric acid buffer. Keep the flowing rate at 10 drops/minute～12 drops/minute. Pay attention not to make the surface of resin dry.

While collecting the eluent, check the amino acid in the eluent with triketohydrindene hydrate tube by tube. The process is: Add 10 drops of pH5 acetate acid buffer and 10 drops of neutral triketohydrindene hydrate solution into every tube of eluent. Heat for 10 minutes in the boiling water bath. The solution showing royal blue means some amino acid has been eluted out. The degree of the color can show the concentration of amino acid, and it can be determined by color matching.

After eluting out the second amino acid with pH4.2 critic acid buffer, collect two tubes of the negative parts of the action of triketohydrindene hydrate. Close the exit of chromatography column, and transfer the pH4.2 critic acid buffer left on the top of the resin.

Add 2ml of 0.1mol/L sodium hydroxide from the top of the resin, open the exit to make it flow into the column slowly. Elute with 0.lmol/L sodium hydroxide according to the above operation, and collect it tube by tube (caution to keep the flowing rate of 10 drops/minute~12 drops/minute) by 20 drops per tube. Check up the amino acid in the eluent. After the third amino acid has been eluted out by 0.lmol/L sodium hydroxide, keep on collecting two tubes of the

negative parts of the action of triketohydrindene hydrate.

Finally, take the optical density of every tube of eluent (take water as blank and at the wavelength of 570nm) or the degree of color (expressed with "-, +, +, ++ …...") as ordinate, and the tube number of eluent as abscissa, then draw an elution curve.

【Attentions】

1. Be sure not to emit the bubbles, tier and don’t let the level of the liquor in the column be lower than that of the resin when packing.

2. Keep the flowing rate at 10 drops/minute ~ 12 drops/minute, and pay attention not to make the surface of the resin dry.

【Advisements after experiment】

1. Why can the mixed amino acids be eluted from the sulfonic acid cation - exchange resin one by one?

2. How to preserve the resin?

氨基酸纸上层析实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除氨基酸纸上层析实验报告 篇一：实验六氨基酸的纸层析法 氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、ph 值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=

原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮，贮于棕色瓶中

纸层析法分离氨基酸实验报告

纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。

在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用 （2）在医药工业的应用

实验七 氨基酸的分离鉴定

实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、?原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1.配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展??用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸 目的和要求 掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 原理 层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时，各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱，故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高度分辩力，从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。 根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类：1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析；2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析；3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。 纸层析所依据的原理是分配层析，故属于分配层析的范畴。 ㈠分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内，再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱，同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相，把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体物质把它吸牢，这种固体物质本身对分离无作用，对溶质也几乎没有吸附能力，称为支持物。进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢，结果得以分离。 显然，分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同，分配系数(α)的定义是：α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L) 滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素，其–OH基为亲水性基团，可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。通常把有机溶剂作为流动相(L)。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂作为流动相自上而

实验六 氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。

氨基酸的纸层析

氨基酸的纸层析 一、实验目的 1、了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、实验原理 1、纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团， 滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。 2、所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2）， 唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用脯氨酸、甘氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度 3、Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件 下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。

4、显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最 后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。 三、试剂 1.酸性层析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：2

2.显色储备液：0.4mol/L茚三酮—异丙醇：甲酸：水=20：1：5 3.标准氨基酸溶液（6mg/ml，苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His） 4.未知样品液：上述四种氨基酸中的一种或几种混合液（每组任选一样品） 四、实验仪器 样品管毛细吸管 层析缸100ml量筒 50ml烧杯胶头滴管 移液管滤纸：15cm*15cm *1 铅笔直尺 保鲜膜细玻璃棒 电吹风薄膜手套 五、操作步骤 （一）展层剂和平衡溶剂的配制 1．在100ml烧杯中按照体积比正丁醇：88%甲酸：蒸馏水=15：3：2的比例配制展层 剂，建议为45ml：9ml：6ml。 2．取1ml显色贮备液混于展层剂中 3．将混合好的液体放于层析缸中，混匀密闭，静置（展层缸洗净后应除去多余的水， 否则会影响展层溶剂的比例而影响展层。 （二）点样（点样操作应戴上手套，防止样品和滤纸受污染） 1．实验台上铺好保鲜膜，保鲜膜下面可以蘸少量水，使得保鲜膜能与实验台面紧密贴 合，此后所有操作都在保鲜膜上进行，不再赘述。

氨基酸的分离鉴定(纸层析法)

氨基酸的分离（纸层析法） 一、实验原理 1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。 操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示： 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，值是常数，故可根据值作定 性依据。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。 三、实验试剂 1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2 2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。 戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色

氨基酸的分离鉴定--纸层析法

. 实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法 一、目的： 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理： 层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。 纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。 在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数，用ａ表示）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。 一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是分配系数（?）。 分配系数不同： 物质在溶剂I中的浓度 ???= ——————————— 1 / 4 . 中的浓度物质在溶剂IIRf值基本上是常数。某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、纸层析纸的质量（新华一号）和层析温度等因素有关。物质被分离后在纸层析图谱上的位置Rf：值（比移）来表示原点到层析点中心的距离 Rf = —————————————

氨基酸纸层析分离鉴定

1.本实验中滤纸的作用是什么？ 答：惰性支持物 2.实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？ 答：吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。 3.R f值的含义、影响因素？ 答： R表示溶质在滤纸上的移动速度。在一定的条件下某物质的Rf f 值是常数，可作为定性分析的依据。 Rf 值大小与样品物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量及温度、样品溶液中的杂质等因素有关。 4.R f值为多少范围内可以确定为同一物质？ 答：样品与标样差值<0.05为同一物质。 5.层析滤纸和普通滤纸有什么区别？ 答：层析滤纸，组成该滤纸的纤维素是亲水物质，能形成水相和展层溶剂的两相系统，被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。普通滤纸，由棉质纤维组成，按不同的用途而使用不同的方法制作。由于其材质是纤维制成品，因此它的表面有无数小孔可供液体粒子通过，而体积较大的固体粒子则不能通过。这种性质容许混合在一起的液态及固态物质分离。 6.为什么要平衡？平衡剂和扩展剂是同一物质吗？ 答：平衡剂起到使纸层析上吸附的溶剂达到饱和, 是物质在展开剂和纸层析上吸附的溶剂中

7.用手直接接触滤纸会引起什么不良后果，为什么？ 答：人手上含有汗渍（内涵氨基酸和干扰物）会干扰试验。 8.缝制的纸筒如果两边缘相靠会造成什么后果？ 答：如果缝制的纸筒两边缘相靠的话会造成展开剂上升速度不均匀，影响氨基酸的分离，使得实验所得Rf值不准确。 9.为避免实验结果出现“拖尾”现象，实验操作中应注意哪些环节？ 答：①层析滤纸要质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开； ②点样时尽量将它们点在同一个点上，等一个干了再点下一个； ③要保证层析滤纸不被污染，特别是从点样线到溶剂前沿的部 分； ④各氨基酸样品点样时量要均匀，量要适中。 10.标记滤纸不能使用油性笔，为什么？ 答：油性笔的油墨属于有机物，也会发生层析反应，以至于影响氨基酸的层析效果。

实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离

实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。 3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1．蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6 mo叭。盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L一氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2．纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数 层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R f值，借此可以达到定性、鉴别的目的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、时间等都会影响R f值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器 （1）干燥箱 （2）水浴锅 （3）安培瓶 （4）层析缸 （5）吹风机 （6）喷雾器 2．试剂

实验七氨基酸的分离鉴定

实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、?原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1.配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展??用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸 姓名：敖礼贤学号：班级：生物工程 一、前言 、研究意义与前景 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质地差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定地，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中地分布程度不同，从而使各组分以不同地速度移动而达到分离地目地.【】文档来自于网络搜索 纸层析法（）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物地常用技术，可用于蛋白质地氨基酸成分地定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质地一种分离分析工具.纸层析法是用滤纸作为惰性支持物地分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附地水是固定相，展层用地有机溶溶剂是流动相.【】文档来自于网络搜索分配层析法分配色谱系色谱法之一种，利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度地差异来实现分离.分配色谱地固定相一般为液相地溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面.分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡地过程.【】文档来自于网络搜索 、实验目地 （）掌握分配层析地原理，学习氨基酸纸层析法地操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量） （）学习未知样品地氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析地方法. 、实验原理 层析法也称色谱法，是年俄国植物学家发现并命名地.他将植物叶子地色素通过装填有吸附剂地柱子，各种色素以不同地速率流动后形成不同地色带而被分开，由此得名为“色谱法”（) . 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离. 年出现纸层析.以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等. 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质地差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定地，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中地分布程度不同，从而使各组分以不同地速度移动而达到分离地目地.文档来自于网络搜索 按层析过程地机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能地差异，达到分离鉴定地目地. 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间地分配系数不同，使之分离. 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力地不同. 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小地组分阻滞作用地不同 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物地分配层析法，它是利用不同地氨基酸在展层溶剂中地分配系数不同而得以分离地一种方法.惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多地羟基，与水有较强地亲和力因此把它看成是含有静止水相地惰性支持物.水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相.展层溶剂由两个互不相溶地有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了地有机相，另一相是以有机溶剂饱和了地水相.文档来自于网络搜索 分配系数(α)＝溶质在固定相地浓度()溶质在流动相地浓度() 当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离.分配层析地原理可用一个模式解释（英国等）：把滤纸看成是一个层析柱，可以分成若干层板，设层板地物质为、；且和地分配系数（α）分别为和；又设固定相为，流动相为，两相互相接触但不相混溶.当第一层流动相中加入一定量地、两项物质后，

氨基酸的分离鉴定纸层析法

【实验目的】 1.学习氨基酸纸层析法的基本原理 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值： 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 【器材与试剂】 （一）器材 1.层析缸 2.点样毛细管 3.小烧杯 4.培养皿 5.量筒 6.喷雾器 7.吹风机（或烘箱） 8.层析滤纸（新华一号） 9.直尺及铅笔 (二) 试剂 1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液) 将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。 2. 氨基酸溶液 0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）。? 3. 显色剂 0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 【实验步骤】 1.准备滤纸 取层析滤纸（长22㎝、宽14㎝）一张，在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔3㎝作一记号，如右图所示。

1、氨基酸的分离鉴定--纸层析法

实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法 一、目的： 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理： 层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。 纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。 在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数，用ａ表示）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。 一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是分配系数（ ）。

实验一 纸层析法分离氨基酸

实验一纸层析法分离氨基酸 一、实验目的 1．掌握纸层析的基本技术 2．学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸 二、实验原理 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法：利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数、经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数： 层析溶剂(亦称展层剂或推动剂)是选用特定的有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力(葡萄糖基的-OH基能与H2O通过氢键相互作用)，能吸附很多水分(可达22%滤纸重，其中约有6%的水与纤维素结合成复合物)，这部分被吸附的水因扩散作用降低而形成固定相。反之，展层剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动 而形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸 入展层剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品 的原点处，使其的溶质依据自身的分配系数在这 两相间不断进行分配，即随着有机溶剂不断向前 移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相 间发生可逆的重新分配，结果使溶质离开原点不 断向前移动。由于溶质中各组分的分配系数不同， 导致前行中出现移动速率差异，因而通过一定时 间的层析，样品中的不同组分即可实现分离。 层析中某物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析时都有其一定的R f值，借此可达到定性、鉴别的目的。应当注意的是，溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸质地以及层析温度和时间等因素都会影响R f值。

三、实验器材 1．实验仪器 培养皿、毛细管、滤纸、喷壶、电吹风 2．试剂 （1）6mol／L HCl （2）若干种氨基酸标准液(l mg/mL)，混合样液 （3）展层剂：正丁醇：80％甲酸：水＝15：3：2 (V/V) （4）0.5％茚三酮溶液 四、实验步骤 1、每人取圆形滤纸一张，将滤纸沿直径对折两次后展开。 2、在折出的四条半径上，离圆心约0.5cm处用铅笔标记出点样点。 3、用毛细管吸取氨基酸样品，置于点样点处，待自然晾干后，重复点样三次。 4、剪一小条长方形滤纸，卷成小纸筒，用剪刀把纸筒一端剪开成细条并压平，用纸筒另一端穿过圆形滤纸的圆心。 5、把纸筒的细条端放入培养皿的层析液中，将培养皿盖好，静置约30min。 6、打开培养皿，取出圆形滤纸，立刻标出扩展剂外沿。 7、用电吹风把圆形滤纸吹干。 8、用喷壶在圆形滤纸表面均匀喷洒显色剂，完全吹干后显色。 五、实验结果 1、计算各标准氨基酸样品的R f值 2、与标准氨基酸的R f值对照，确定混合样品中含有哪些氨基酸。 六、注意事项 1、点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。 2、点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。 3、展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 七、思考题 1、为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？ 2、该实验中有哪些因素可能会影响到氨基酸的层析效果？

纸层析法—氨基酸的分离与鉴定

纸层析法——氨基酸的分离与鉴定 一、实验目的 1、了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、实验原理 1、纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团， 滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。 2、所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2）， 唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基团分别是—CH3，—CH2—C6H5，—CH2—COOH，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 3、Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件 下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。 4、显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应， 最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。

三、试剂 （一）提前配制试剂 8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。 8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。 8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。（将上述三种溶液装于小瓶中实验时，每两组共用一组试剂） 正丁醇 88%甲酸 蒸馏水 茚三酮晶体 注：实验时，以上试剂均为每两组同学共用一组试剂。 （二）当堂配制试剂 丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸的混合液:将上述溶液等体积混合即可 四、实验仪器 每组： 钟罩：1 试管：15mm*10cm *5 试管架：1 培养皿：95mm*1 移液管：10ml *1 洗耳球：1 小烧杯：25ml *2 （可以用其他小规格的烧杯如20,10,8ml的代替）100ml*1 滤纸：15cm*15cm *1 铅笔：1 直尺：1 毛细吸管：4 保鲜膜：1 细玻璃棒：1 公用： 电吹风：3 酒精灯：3 订书机：3 电子天平或分析天平：3 称量纸：若干烘箱：1

纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸 一、目的 1．掌握纸层析的基本技术 2．学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸 二、原理 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法：利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数、经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数： 层析溶剂(亦称展层剂或推动剂)是选用特定的有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力(葡萄糖基的-OH基能与H2O通过氢键相互作用)，能吸附很多水分(可达22%滤纸重，其中约有6%的水与纤维素结合成复合物)，这部分被吸附的水因扩散作用降低而形成固定相。反之，展层剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动而形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入展层剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在这两相间不断进行分配，即随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，结果使溶质离开原点不断向前移动。由于溶质中各组分的分配系数不同，导致前行中出现移动速率差异，因而通过一定时间的层析，不同组分即可实现分离。 层析中物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析时都有其一定的R f值，借此可达到定性、鉴别的目的。 应当注意的是，溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸质地以及层析温度和时间等因素都会影响R f值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器、材料 干燥箱水浴锅层析缸培养皿毛细管镊子层析滤纸2．试剂 （1）6mol／L HCl （2）若干种氨基酸标准液(l mg/mL)，混合样液 （3）展层剂：正丁醇：80％甲酸：水＝15：3：2 (V/V) （4）0.5％茚三酮溶液 四、操作步骤 将层析滤纸平铺在桌面上，用直尺和铅笔在距滤纸底边2 cm处轻划一条平行于底边的直线作为基线，沿基线以一定的间隔做标记以指示各标准氨基酸样和混合样品的加样位点。 用毛细管吸取少量氨基酸样品分别点于标记的加样位点上(记录各标准样和混合样位置)。点样时毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在0.3~0.5 cm。用吹风机稍加

纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸 一，实验目的 1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。 2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 实验原理 1、纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。 2、溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf值表示： 3、Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 4、在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 实验材料与试剂 二，实验试剂 1、氨基酸标准液(1mg/mL) 亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。 2、80%甲酸 3、0.1%茚三酮丙酮溶液 4、氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL) 5、正丁醇 三，实验器材 1、新华滤纸 2 3、电热鼓风干燥箱 4、吹风机 5、毛细管 6、针、线、尺。 7、钟罩(高约430mm,直径约290mm，具磨口塞) 四，实验操作 标准氨基酸纸上层析 单向上行层析 氨基酸Rf值的测定 A、滤纸：选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上 四个点作为点样位子（留出缝线空间）。

B、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取 氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。 将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。 C、展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸 的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置 酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。 D、显色：待展层基本结束后, 置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风 E、Rf值的计算：用尺测量 显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。 E 计算出3种氨基酸在酸系统中的Rf值，判断待测样组成。 保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。 注意：使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。 五，实验结果 结果分析：此次做的亮氨酸脱色，可能的原因是没有点滴好，前沿上升到滤纸中部后无明显变动，可能与实验的温度有关。 六，思考题 1、为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统?