高效液相色谱法(HPLC)的概述

此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC

主要内容包括：

1.高效液相色谱法（HPLC）的概述

2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）

3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类

4. 液相色谱的适用性

5.应用

高效液相色谱法（HPLC）的概述

以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。

由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。

高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。

目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相

的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。

系统组成：

（一）高压输液系统

由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。

1.贮液罐

由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相

流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。

流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。

3.高压输液泵

是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。

（二）进样系统

常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。

（三）色谱柱

由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅

胶（C8柱）、氨基或氰基键合硅胶等，在中药制剂的定量分析中，主要使用ODS柱。由于ODS属于非极性固定相，在分离分析时一般使用极性流动相，所以属反相色谱法。常用流动相有甲醇－水或乙腈－水等，洗脱时极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱。

（四）检测器

在高效液相色谱法中主要使用紫外检测器（UVD），可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型，以可变波长紫外检测器应用最广泛。检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。

高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）

一、基本概念和术语

1.色谱图和峰参数

⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）.

⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。

⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symm etry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T <0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。

⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。

⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。

⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。

⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。

⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

⊕峰面积（peak area,A）――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h＝2.507σh=1.064Wh/2h

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2.定性参数（保留值）

⊕死时间（dead time,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

⊕死体积（dead volume,V0）――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）

⊕保留时间（retention time,tR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。⊕保留体积（retention volume,VR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F*tR .

⊕调整保留时间（adjusted retention time,tR’）--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0

⊕调整保留体积（adjusted retention volume,VR’）--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’

3.柱效参数

⊕理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：

N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2

W：峰宽；σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。

N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）

若用调整保留时间（tR’）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16(tR’/W)2

⊕理论塔板高度（theortical plate height,H）每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H=L/N

4.相平衡参数（distribution coefficient,K）--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K=[xs]/[xm]

Cs-溶质在固定相中的浓度

Cm－溶剂在流动相中的浓度

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为滲透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs 、Cm很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减少，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能较少进样量，使组份在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组份则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组份的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。

在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及PH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

⊕容量因子（capacity factor,K）--化合物在两相间达到平衡时，在固定相与流动相中的量之比。K＝（tR-t0）/t0=tR’/t0（或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量）。因此，容量因子也称质量分配系数。

｛K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs：色谱柱中固定相的体积；Vm：色谱柱中流动相的体积。｝

分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k===K=,tR’=kt0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组份在固定相中停留的时间（tR’）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k=0时，化合物全部存在与流动相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR’、t0较Vs、Vm 易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

⊕选择性因子（selectivity factor,α）--相邻两组份的分配系数或容量因子之比。α＝＝（设k2>k1）。因k=tR’/t0,则α＝k2/k1，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。

要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

5.分离参数

⊕分离度（resolution,R）--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=（tR2-tR1）/[(W1+W2)/2],当W1=W2时，R=。当R=1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露锋面积为95.4％，内测峰基重叠约2％。R=1.5时，称为6σ分离，裸露锋面积为99.7％。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。

⊕基本分离方程――分离度与三个色谱基本参数有如下关系：

R=1/4（а-1）×N0.5×［k’/(1+k’)］

其中N称为柱效项，α为柱选择项，k’为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。

从基本分离方常可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R=0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及PH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2 不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2 在1～10范围内，最好为2～5，窄径柱可更小些。

二、塔板理论

1.塔板理论的基本假设

塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：

1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。

2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。

3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。

4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。

虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。

2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）

根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述；

C=e 或C=e

由色谱流出曲线方程可知；当t=tR时，浓度C有极大值，Cmax=.Cmax就是色谱峰的峰高。

因此上式说明；①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。

②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。

由曲线方程对V（0～∞）求积分，即得出色谱峰面积A＝×σ×Cmax =C0。可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。把Cmax=h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝

1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。

三、速率理论（又称随机模型理论）

1.液相色谱速率方程

1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板理论高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论――速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。

后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H=A+B/u+Cu,后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）：

H＝2λdp++\s\up5(2p+\s\up 5(2p+\s\up 5(2f

2.影响柱效的因素

1)涡流扩散（eddy diffusion）.由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3～10 um，最好3～5um，粒度分布RSD≤5％。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用而均匀的载体，这种有助于提高柱效。毛细管无填料，A=0。

2）分子扩散（molecular diffusion）.又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2rDm/u.u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm 很小，通常仅为气相的10-4～10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。r一般在0.6～0.7左右，毛细管柱的r＝1。

3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。

①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中硫路中心和边缘的流速不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相迁移，因而产生峰展宽。

②静态流动相传质阻抗Hsmd2pu/Dm,Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。

Hsm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应采用低

力度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。

③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df 的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。

从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。

②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt,在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03～0.1mm/s）在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。

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3.柱外效应、

速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，

即：σ2＝σ2柱内+σ2柱外+σ2器它

柱外效应主要有低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜成流线型，检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应

柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k<2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k 大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。

HPLC系统

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

最早的液相色谱仪有粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长之可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。

目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters 公司、Agilent 公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。

LC的运转中心——心脏

一、输液泵

1.泵的构造和性能

输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。砂的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应〈0.5％，这结定性定量的准确性纛关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1～10ML／MIN范围内连续调，制备型应能达到100ML／MIN；③输出压力高，一般应能达到150～300KG/CM2：④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。

泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。恒压泵受柱阴影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵己被淘汰目前应用最多的是柱塞往复泵。

柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ML，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阴影响；泵压可达400KG/CM2。ADW主要缺点是输出的脉冲性较大，现多彩采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1％左右，串联泵为0.2～0.3％），但出现故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。

项目Waters515型HP1100型LC-10Atvp型Elite P200 Ⅱ型检定要求

流速范围0.001～10 0.001～10 0.001～9.999 0.01～4.99

调节精度0.001 0.001 0.001 0.01

流量精密度RSD0.1％0.15％（〈0.3％〉0.3％0.5％1.5％

流量准确度±2.0％±5.0％±2.0％

最高压力4000Psi 40MPa 39.2MPa 40.0MPa

密封圈寿命

流动相的脉冲

2.泵的使用和维护注意事项

为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：

①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸镏，而常用的方法是滤过，可采用MILLIPOIPORE滤膜（0.2或0.45）等滤器。泵的入口都应连接

砂滤棒（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

②流动相不应含有任何腐性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至兴是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱术保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇水）。

③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。

④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障

①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量下运转，将气泡排尽，也可用一个50ML针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。

②压力和流量不稳。原因可能是气泡，须要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，进入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这是，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将纱滤棒浸入稀酸内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。

③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时应逐段进行。

3.梯度洗脱

HPLC有等强度（isocratic）和梯度（gradient）洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和PH值等，用于分析组分数目多、性质差异罚大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高

检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。

梯度洗脱有两种方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。

两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：

①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相，有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱沧剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘主度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始流动相泫经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

二、进样器——样品的进食系统

早期使用隔膜和停流进们器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLCfj样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

1.隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用（如10MPA以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1～2％；加之能碉各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。

2.停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。

3.阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国RHEODYNE公司的7725和7725I

型最常见），其关键部件由圆形密封垫子（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积在存在，柱效率低于隔膜进样（约下降5～10％左右），但耐高压（35～40MPA），进样量准确，重复性好（0.5％），操作方便。

六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50％（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5～10倍9最少3倍），这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。

六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45UM滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样吕残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

4.自动进样。用于大量样品的常规分析。

三、色谱柱——食物的消化吸收系统

色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10UM等，柱效理论值可达5～16万／米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，不要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

1.柱的构造

色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70KG/CM2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效京，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2-20um(5-10 um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出.

色谱柱按用途分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:①常规分析柱(常量柱),内径2-5mm(常量4.6mm,国内又4mm和5mm),柱长10～30CM；②窄径柱（NARROWBORE，又称细管径柱、半微柱SEMI－MICROCOLUMN），内径1～2MM，柱长10～20CM；③毛细管柱（又称微柱MICROCOLUMN），内径0.2～0.5MM；④半制备柱，内径>5MM；⑤实验室制备柱，内径20～40MM，柱长10～30CM；⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

2.柱的发展方向

因强调分析速度而发展出短柱，柱长3～10CM，填料粒径2～3UM。为提高分析灵敏度，与质谱（MS）联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2MM的微径柱（MICROBORE）。细管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；③样品量少；④能使用长柱达到高分离

度；⑤容易控制柱温；⑥易于实现LC－MS联用。

但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1～100UL/MIHN的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度检测器，电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。

3.柱的填充和性能评价

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度>20um 时，干法填充制备柱较为合适；颗粒<20um时，湿法填充较为理想。填充方法一般有四种：①高压匀浆法，多有用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters 专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性强，大多数实验室使用己填充好的商品柱。

必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。

无论是自己装填的还是购买的色谱柱,使用前都应对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要生意重新检查.柱性能指标包括在一定实验条件下(样品,流动相,流速,温度)下的柱压,理论塔板高度和塔板数,对称因子,容量因子和选择性因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在或以骨。进行柱效比较时，不要注意柱外效应是不有变化。

一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长，内径，填料的种类，粒度，色谱柱的柱效，不对称度和柱压降等。

在操作中注意的地方

1、流动相的抽作要求：

高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤；流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法）

2、吸滤头：

特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。

3、单向阀：

如遇到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀出现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！

4、泵头：

泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等）

5、过滤器：

当色谱峰出现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。6、排液阀：

此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。

7、手动进样器：

平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维修或更换配件。

8、流通池：

在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可根据说明书进行操作或申请维修）。

9、工作站：

出现死机可重起计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。

故障排除与诊断

泵压不稳

1、泵头有气泡——流动相脱气/大流量冲洗泵/用注射器抽取流动动相

2、单向阀故障——清洗

若上述操作仍不能解决，可用异丙醇冲洗流动（无色谱柱冲洗，由手动进样器直接进检测器），流量为3-4ml/min,冲洗50分钟左右，然后重新安装色谱柱，更换流动相平衡，如此再不能解决泵压波动故障，可申请更换配件。

色谱的保养：

漏液处理：

流路堵塞问题：

缓冲盐的使用：

流动相含有盐分时，做完实验后一定要进行流路冲洗；

首先用水冲洗，打开排液阀用PURG键转换出原有含盐的流动相，然后关闭排液阀打开泵冲洗全部流路45分钟以上，如此更换流动相为水和甲醇混合液冲洗全部流路30分钟（此步骤一般可省去，根据实验而论），最后更换纯甲醇冲洗全部流路45分钟以上。

泵头冲洗；

用备件中的针头和针管分别用蒸馏水和纯甲醇冲洗3-5ml。

如流动相不含盐，可对机器定期进行简单的冲洗维护，根据实验多少而定。

手动进样器冲洗；

同样用备件中的针管和专用冲洗针头对手动进样器的装载状态和进样状态分别进行冲洗3-4ml的蒸馏水，然后再冲洗3-4ml的纯甲醇。

确保每次做完实验，所有流路中充满纯甲醇！

色谱的保养：

C18柱绝对不能进蛋白样品、血样，生物样品。

要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

长时间不用仪器，应该将柱子取上用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇）保存，因为纯水易长霉。

流路堵塞问题

堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查，并清洗。清洗方法：①以民丙醇作溶剂冲洗②放在异丙醇中超声波清洗③用10%稀硝酸清洗。

高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类

一、液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performan ce Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Press ure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Spee

d Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。

二、HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点：

高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。

高速-流速为0.1~10.0 ml/min。

高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。

分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。

按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法

使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易

产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法

使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。

现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法

固定相极性高～中中～低

流动相极性低～中中～高

组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定

相）。

3.离子交换色谱法

固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子

与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，

不利于样品的解离，导致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4.离子对色谱法

又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分

析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/ L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、

流动相组成及其pH值、离子强度有关。

5．排阻色谱法

固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。液相色谱的适用性

三、色谱法分类

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能

很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。

按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1．液固色谱法

使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。

2．液液色谱法

使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法

采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、

高效液相色谱法操作规程

目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1 ?定义及概述： 1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2. 高效液相色谱仪的使用要求：

2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3. 操作前的准备： 3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45a m。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时, 对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45a m适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3检查上次使用记录和仪器状态:检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4操作： 4.1泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml,设置高流速（9ml/min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP冲洗，关闭排放阀。 4.1.3将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示 应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 4.2.1开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，

高效液相色谱法简介

高效液相色谱法简介 “色谱”一词是由俄国科学家斯威特提出的。色谱法是基于补充物质在相对运动物的两相之间分布时，物理或物理化学性质的微小的差异而使混合物相互分离的一类分离或分析方法。发展与上世纪初，飞速发展于五十年代，有超过30位科学家家因为它而获得诺贝尔奖，其有自己的理论和研究方法，同时也有众多的应用领域。 色谱法常见的方法有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 柱色谱：柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。 薄层色谱：薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。

气相色谱：GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体流动相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。 高效液相色谱：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9-107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高效液相色谱（HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效

高效液相色谱的发展及其应用

高效液相色谱的发展及其应用 摘要：了解高效液相色谱[1]的发展历史，知道高效液相色谱的组成结构、操作 原理以及方法等等。掌握它的分类方法，通过比较得出高效液相色谱分析方法的优点与缺点。明确高效液相色谱的应用，最终分析结果。 关键词：高效液相色谱；发展历史；应用 高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 1、高效液相色谱的发展历史 1.1高效液相色谱的历史 高效液相色谱作为色谱分析法的一个分支，是在二十世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。 1.2高效液相色谱与其它色谱的比较[2] 1.2.1与经典液相色谱的比较 经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 1.2.2与气相色谱法的比较 高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析。 2、高效液相色谱 2.1高效液相色谱的特点 2.1.1高效液相色谱的优点 1.分辨率高于其它色谱法，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果； 2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成； 3.重复性高、样品不被破坏、易回收； 4.高效相色谱柱可反复使用； 5.自动化操作，分析精确度高；

高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展_张良晓

高效液相色谱在药物分析中的应用研究进展 张良晓 (中国地质大学(武汉)材料科学与化学工程学院,武汉　430074) 摘　要　本文综述高效液相色谱法作为药物分析的常规方法,药物动力学研究,药物含量测定等药物分析上的应用研究进展,并对应用研究的方向进行了预测。 关键词　高效液相色谱;药物分析;应用研究;进展 高效液相色谱法(H igh -Perfo r m ance L iqu id Ch rom a tog rap hy ,H PL C )是以液体作为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20%,而80%则需用高效液相色谱来分析。液相色谱根据分离机理的不同可分为液液分配色谱、液固吸附色谱、离子交换色谱和排斥色谱(或凝 胶渗透色谱)[1] 。高效液相色谱已经广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面[2]。 近年来高效液相色谱法在药物分析中占主要地位。据美国药典22版载,H PL C 在含量测定方法中位居第一。其特点是分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样 品处理较简单[3] 。本文在按在药物分析中的作用从以下几个方面综述了高效液相色谱法在药物分析的研究进展。 1　高效液相色谱作为常规分析方法在药物分析中的应用 高效液相色谱法作为药物分析中的最主要的分析方法,常被作为常规分析和检验方法。近年来在这 个方面的研究比较多,刘树业.等[4] 为时刻监控治疗肝癌时的抗癌药物剂量即血中的药物浓度,提高疗效,减少副作用,采用紫外-H PL C 法对血中和组织中的阿霉素浓度进行分析.用U V -240紫外分光光度计,B ECK M AN 332型高效液相色谱仪,采用反向色谱法.秦.等[5]针对近几年国际奥委会医学委员会公布的禁用表中新增药物及一系列利尿剂的相关化合物进行了研究,比较了不同的提取方法及回收率,研究了几种药物的排泄情况;建立了同时分析13种利尿剂的高效液相色谱测定方法,检出限小于5ng 。左雄军.等[6]用0.02m o l L 的三羟甲基胺基甲烷(用磷酸调pH 值至7)和甲醇(含2%乙酸和0.25%庚烷磺酸钠)作流动相进行梯度洗脱,建立了脂性油膏药物中黄芩甙含量的反相高效液相色谱分析方法,本法分析速度快,重现性好,黄芩甙的平均回收率为103.7%。张晓青.等[7]采用反相离子对高效液相色谱法研究了唑来膦酸及其有关化合物的色 子河沉积物中重金属污染[J ].北京大学学报,2000, 36(4):525-530. [3]　王贵.胶州湾李村河口沉积物重金属及稀土元素演化 模式与环境记录[D ].长春:吉林大学图书馆,2003.[4]　廉雪琼.广西近岸海域沉积物中重金属污染评价[J ]. 海洋环境科学,2002,21(3):39～42. [5]　李任伟.沉积物污染和沉积环境学[J ].地球科学进展, 1998,13(4):398～40 [6]　柳林,许世远,陈振楼,余佳.上海滨岸潮滩表层沉积物 中重金属的空间分布与环境质量评价[J ].上海地质,2000,(1):1-5. [7]　腾彦国,庹先国,倪师军,张成江.应用地质累积指数评 价沉积物中重金属污染[J ].环境科学与技术,2002, 25(2):7-9. [8]　刘文新,栾兆坤,汤鸿霄.乐安江沉积物中重金属污染 的潜在生态风险评价[J ].生态学报,1999,19(2):206-211. [9]　刘芳文,颜文,王文质,古森昌,陈忠.珠江口沉积物重 金属污染及其潜在生态危害评价[J ].海洋环境科学,2002,21(3):34-38. [10]　许金生,冯泳兰,袁亚莉,邓健,陈文.大源渡库区表层 沉积物中重金属污染状况[J ].环境化学,2002,21(1):100-102. 第一作者简介:王贵(1961-),男,汉族,内蒙古包头市人,教授,主要从事环境地球化学研究工作。 The a ssess m en t of heavy m eta l pollution for the sed i m en ts of J i aozhou Bay W A N G Gu i ,YA O D e (Chem istry D epartm en t ,B ao tou T eacher’s Co llege ,B ao tou ,Inner M ongo lia 014030) (Co llege of Resource and Environm ental Engineering ,Shandong U niversity of Techno logy ,Zibo ,Shandong 255091)Abstract :Po ten tial eco logical risk (R I )and Geoaccum u lati on index (Igeo )w ere ap lied fo r heavy m etal po llu ti on assess m en t in J iaozhou B ay .T he resu lts show ed that the m iddle level po llu ti on s w ere ex isted in J iaozhou B ay .T he Igeo indexes w ere from 1to 4and R I values w ere m o stly betw een 100 ～300.A h igher R I value of abou t 600w as app eared in the sedi m en ts of H ai po R iver estuary ,w h ich show ed a com p aratively heavier po llu ti on ex ist there .T he con sequence of po ten tial eco logical risk fo r heavy m etals w as Cd >Pb >Cu >A s >Zn . Key words :J iaozhou B ay ;sedi m en t ;heavy m etal ;po llu ti on ass ;ess m en t 收稿日期:2005年6月28日 3 　2005年第7期 内蒙古石油化工

2015年版药典高效液相色谱法、质谱法.doc

2015 年版药典高效液相色谱法、质谱法

2015 版药典 --- 高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处 理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9 ～ 4.6mm，填充剂粒径为 3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约 2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物 等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰 基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残 留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当 提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚 合物色谱柱可耐受更广泛 pH值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外 - 可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、 蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外- 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与 其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射 检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈 线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外 - 可见分光检测器所用流动相应符合紫外 - 可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测 器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇 - 水系统和乙腈 - 水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动 相中有机溶剂一般不低于 5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

高效液相色谱法在药物分析中的研究进展

高效液相色谱法在药物分析中的研究进展 摘要：高效液相色谱法作为药物分析的常规方法应用广泛，本文对其在药物含量测定及药代动力学研究上的应用进行综述。 关键词：高效液相色谱法；药物分析；研究；进展 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatogra phy，HPLC）是一项柱色谱分离技术，因分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等特点已广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定。随着与质谱、核磁共振波谱等的联用技术的发展，HPLC的应用将愈加广泛[1]。 一、高效液相色谱法作为药物分析的常规方法在药物分析中的应用 高效液相色谱法作为药物分析中的最主要的分析方法，常被作为常规分析和检验方法[2]。近年来这个方面的研究较多，陈英红等通过对人参糖肽注射液中多糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化，采用高效液相色谱法进行组成糖分析，建立了人参糖肽注射液特征图谱。该方法操作简便，分离度高，重复性及稳定性良好，可有效控制人参糖肽注射液的质量，同时可作为酸性杂多糖的测定方法。陈金泉等建立

抗艾滋病药物更昔洛韦、阿昔洛韦、喷昔洛韦和伐昔洛韦的HPLC快速检测方法。采用同一色谱体系实现对四种药物的分析，该检测方法快速、简便，准确。这些研究充分利用了高效液相色谱操作简单，灵敏度高，回收率高的特点。 二、高效液相色谱在药物分析测定中的研究进展 高效液相色谱法是一种集分离和测定为一体的分析方法，其作为药物分析中药物鉴别、杂质检查及含量测定的重要方法。 （一）在鉴别中的应用。HPLC用于药物鉴别时，一般规定按供试品含量测定项下的高效液相色谱条件进行实验。要求供试品和对照品色谱峰的保留时间一致。在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数。如头抱拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。 （二）在有关物质检查中的应用。目前药品的有关物质的检查方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、紫外分光光度法（UV）及容量分析法等多种。近年来随着仪器分析技术的发展，HPLC 分离效果佳分离速度快的特点使其成为最主要的检测有关 物质的方法。 （三）在药物（含中药）成分含量测定上的应用。在药物分析中，高效液相色谱由于其专一性，灵敏度高，快速简

高效液相色谱分析原理及流程

高效液相色谱分析原理及流程 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 高效液相色谱分析原理 (一)高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (二)高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一)

高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析(一) 【关键词】高效液相色谱法 摘要：综述了高效液相色谱(HPLC)法指纹图谱在中药质量控制方面的应用，并通过供试品的制备、标准品的选择、结果分析方法来阐述中药指纹图谱的应用现状，指出高效液相色谱法应用于中药指纹图谱中现有不足之处和未来的发展方向。 关键词：高效液相色谱；中药指纹图谱ApplicationandAnalysisofFingerprintinTraditionalChineseMedicinebyHPLC Abstract:ThispapersummarizedtheapplicationoffingerprintoftraditionalChinesemedicinebyHPLCto thequalitycontrol.ItalsoreviewedtheactualityoffingerprintintraditionalChinesemedicinethroughth epreparationforsample,thechoiceforstandardsample,andthemethodofresultanalysis.Thenpointed outthemainproblemsatpresentandtheprospectivefutureinapplicationoffingerprintoftraditionalChi nesemedicinebyHPLC. Keywords:HPLC;FingerprintofTraditionalChinesemedicine 当前，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制〔1〕。我国自200008国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》(国药管注〔2000〕348号)以来，中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。国家药品监督管理局要求到2002年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料，包括中药原料、提取物、产品3种图谱，3种图谱的峰形必须有较大的相关性，否则不予受理〔2〕。 1中药指纹图谱 中药指纹图谱是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段，用以对中药材和中成药进行鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照品与待测样品指纹图谱的相似性〔3〕。指纹图谱一般包含两层含义：1.必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质；2.对于中药材，指纹特征还能反应出产地和采收期不同而造成的差异；对于中成药，则能反映出同一产品不同批次间的质量差异，差异越小说明药材(或成药)的稳定性越好〔4〕。 2HPLC用于中药指纹图谱的情况 文献分布表明，对中药指纹图谱的研究始于1993年，从1993～1999年共发表11篇〔5〕，指纹图谱的研究基本处于未开发状态。而从2000年开始，研究中药指纹图谱的文献呈直线上升趋势，尤以近2年发展最快，与指纹图谱相关的文献报道就有上百篇，其中又以高效液相色谱法研究的指纹图谱居多，高效液相色谱以其应用的广泛性，检测的精确性成为控制中药质量最主要的检测方法。至今已有50种中药材，21种中成药运用HPLC法测定其指纹图谱并发表。 据文献统计，目前已对下列中药材运用HPLC进行了指纹图谱研究：枸杞、柴胡、新疆雪莲、夏天无、延胡索、白芍、白鲜皮、板蓝根、补骨脂、黄芩、赤芍、川东獐牙菜、川芎、刺五加、大黄、丹参、当归、地黄、茯苓、麻黄、甘草、葛根、马甲、红车轴草、红花、厚朴、怀牛膝、鸡血藤、金银花、绿衣枳实、密花石斛、牛膝、秦艽、人参、西洋参、忍冬、山银花、山楂、芍药、水蔓菁、乌拉尔甘草、五味子、石斛、仙茅、旋覆花、淫羊藿、三七、泽泻、栀子、西红花。中成药中采用HPLC进行指纹图谱研究的有：咳必安胶囊、灯盏花素注射液、白屈菜注射液、板蓝根颗粒、补肾方、川芎制剂、丹参注射液、丹参葡萄糖注射液、复方丹参片、参麦注射液、红花注射液、红景天注射剂、黄连解毒汤、脉络宁注射液、人参

高效液相色谱法(HPLC)的概述

此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相

的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅

高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱在生物制药中的应用 高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。 1.高效液相色谱的介绍 高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型： 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）

高效液相色谱仪简介

高效液相色谱仪简介 系统组成、工作原理 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 高效液相色谱 （high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。 高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。 使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。 发展历史

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

高效液相色谱的应用与发展前景

高效液相色谱的应用呵发展前景 液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过 改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快. 分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。 高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。 对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个 不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。 2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优 点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技 术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必

高效液相色谱仪的综述

题目：高效液相色谱仪的综述 院 部 生命科学院 学科门类 生物仪器分析 专 业 生物技术一班 学 号 1111431017 姓 名 王伟康 指导教师 陈金武 2014年6月15日 装 订 线

摘要 目前，高效液相色谱(HPLC)法由于对复杂样品中的分析物具有极高的分离效率而成为最有效的分离方法。将具有高灵敏度的化学发光分析法和具有高分离效率的高效液相色谱分离法相结合已引起了国内外分析化学家的极大兴趣。本文简单概述了高效液相色谱化学发光的特点、发展史、检测原理、化学发光反应体系以及发展前景。 关键词：高效液相色谱仪发展历史原理应用 ABSTRACT At present, high performance liquid chromatography (HPLC) and become the most effective method for separating the separation efficiency of the analysis method of complex samples with high. Luminescence analysis method and high performance liquid with high separation efficiency of chemical with high sensitivity of chromatographic separation method has aroused great interest of chemists at home and abroad. This paper briefly introduces the characteristics, chemiluminescence HPLC detection principle, development history, chemiluminescence reaction system and the development prospects. Key words:High performance liquid chromatography；Development history；Principle；Application