文档视界 最新最全的文档下载
当前位置:文档视界 › 离子交换色谱柱和离子排阻色谱柱分离物质原理的区别

离子交换色谱柱和离子排阻色谱柱分离物质原理的区别

离子交换色谱柱和离子排阻色谱柱分离物质原理的区别
离子交换色谱柱和离子排阻色谱柱分离物质原理的区别

1.离子交换色谱是一种成熟的技术,柱填料含有极性可离子化的基团,如羧酸、磺酸或季铵离子,在合适的pH值下,这些基团将解离,吸引相反电荷的

物质。由于离子型物质能与柱填料反应,所以可被分离。

缓冲溶液常被用作离子交换色谱的流动相。缓冲溶液的pH值和离子强度将影响化合物从柱中的洗脱。这是由于改变pH值,可改变化合物的解离程度所致。样品电离度的降低,减少了样品与色谱柱的反应,样品组分就可以较快地从柱中流出。增加流动相的离子强度,平衡移向不利于样品与柱填料反应的方向,利于样品从柱中较快流出。

2.分子排阻色谱法是基于样品分子量大小不同而多样品进行分离的色谱法。固定相是有一定孔径的多孔填料,小分子量的化合物进入孔中,流动相是可

以溶解样品的溶剂。分离过程是按分子量大小的顺序,分子量大的化合物先从柱中洗脱。

分子排阻色谱法常用于分离高分子化合物或复杂的物质,如组织提取物、核酸、蛋白质等。

2. 1.离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂,流动相一般为水或含

有有机溶剂的缓冲液。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离.

2.排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱,是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同,以使组分分离。它类似于分子筛的作用,

但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后,随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,因此就直接通过柱子,首先在色谱图上出现,一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中,这些组分在柱上的保留值最大,在色谱图上最后出现。

常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,可根据载体和试样的性质,选用水或有机溶剂为流动相。

常见色谱仪的色谱分离原理

常见色谱仪的色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1.液固色谱法:使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2.液液色谱法:使用将特定的液态物质涂于担体表面,或化学键合于担体表面而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相,如C18、 C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法:采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。 反相色谱法:一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。 随着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围逐渐扩大,现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离,常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8),太高的pH

离子交换柱层析原理

离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程,主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析(Ion Exchange Chromatography 简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法,广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理: 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法,也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离,具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前,在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质: 离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可

离子交换色谱

离子交换色谱 一、实验原理: 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 离子交换层析是用离子交换剂作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来。 二、实验设计 离子交换剂;缓冲液;洗脱剂 具体操作: 1、离子交换介质的选择: 考虑目的分子的大小,目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团;功能集团的强弱,目的分子稳定,选择强交换介质。 对于大多数纯化步骤来说,建议开始的时候使用强离子交换柱,可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质,可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂,使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷,可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂,缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷,可与阳离子交换剂结合。对于一个未知等电点的蛋白质,可以先选择一个阴离子交换剂,再选择一个中性的pH缓冲液,将蛋白质样品透 析至pH7.0,然后过阳离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中,说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷,可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0,然后再过阴离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。以此类推,直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止,也可用阳离子交换剂作类似的选择,不过要注意,pH 的改变应向减小的方向进行。 功能集团的强弱 一般情况下,在分离等电点pH为6-9的目的分子,尤其是当目的分子不稳定时,需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。 流动相(缓冲液)的选择: 离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对 pH有一定缓冲作用的溶

色谱法的分类及其原理

色谱法的分类及其原理 (一)按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 (二)按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) :柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱,试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法(paper chromatography):纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体,把试样点在滤纸上,然后用溶剂展开,各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现,根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) :薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层,然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 (三)按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同,又可将其分为:

1、吸附色谱法:利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物(例如,分离醇类与芳香烃)。 2、分配色谱法:利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法:利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法,利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离,而且广泛地应用于有机和生物物质,如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法:是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法,体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻,较早的淋洗出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。这样,样品分子基本按其分子大小先后排阻,从柱中流出。被广泛应用于大分子分级,即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法:相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相,利用与固定相不同程度的亲和性,使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质(或抑制剂)、抗原与抗体,激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用,使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物,

第七节离子交换色谱

第七节离子交换色谱 离子交换色谱(ion-exchange chromatography,IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义,基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离,因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小,蛋白质分子无法进颗粒内部,只能吸附在表面,造成有效交换容量很小;②树脂表面电荷密度过大,使蛋白质在其上吸附得过于牢固,必须用较极端的条件才能洗脱,而这样的条件往往易造成蛋白质变性;③树脂的骨架具疏水性,一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用,也容易造成蛋白质变性失活。 20世纪50年代中期,Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-)纤维素和二乙氨乙基(DEAE-)纤维素,这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力,而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交 换容量,而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱,因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后,多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成,包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等,以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷,极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。 一、离子交换色谱相关理论 (一)基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换

剂带相反电荷因而能够与之竞争结合,而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同,表现出与离子交换剂在结合强度上的差异,在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。 图6.7-1 离子交换色谱原理 梯度缓冲液中的离子;极限缓冲液中的离子; 待分离的目标分子;▲需除去的杂质 1- 上样阶段,此时离子交换剂与平衡离子结合;2- 吸附阶段,混合样品中的分子与离子交换剂结合;3- 开始解吸阶段,杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱,目标分子仍处于吸附状态;4- 完全解吸阶段,目标分子被洗脱;5- 再生阶段,用起始缓冲液重新平 衡色谱柱,以备下次使用 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化,即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换,带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 (二)基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成,在水溶液中,与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、

离子交换层析

实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 (二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 )为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85 ~7.5 ),其余均属酸性蛋白。pH7.2 ~7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附,只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出,而其他蛋白则被吸附在柱上,从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)

5.0.02 %NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 .DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 (下称A-50 )5g ,悬于500ml 蒸馏水内,1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例,将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中,搅匀,静置30min ,装入布氏漏斗(垫有 2 层滤纸)中抽滤,并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性;再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理,最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次,处理完后,将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。

2 .装柱 ( 1 )将层析柱垂直固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 (2 )将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度,再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ~3cm 高时,开启出水口螺旋夹,控制流速1ml/min ,同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 ( 3 )关闭出水口,待A-50 凝胶完全沉降后,柱面放一圆形滤纸片,以橡皮塞塞紧柱上口,通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 .平衡启开出水口螺旋夹,控制流速 4 滴/min ,使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度,两者达到一致时关闭出水口,停止平衡。 4 .加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹,使柱中液体缓慢滴出,当柱面液体与柱面相切时,立即关闭出水口,以毛细滴管沿柱壁加入样品(0.5ml 血清,体积应小于床体积的2% ,蛋白浓度以<100mg 为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内,至与柱面

离子交换色谱柱和离子排阻色谱柱分离物质原理的区别

1.离子交换色谱是一种成熟的技术,柱填料含有极性可离子化的基团,如羧酸、磺酸或季铵离子,在合适的pH值下,这些基团将解离,吸引相反电荷的 物质。由于离子型物质能与柱填料反应,所以可被分离。 缓冲溶液常被用作离子交换色谱的流动相。缓冲溶液的pH值和离子强度将影响化合物从柱中的洗脱。这是由于改变pH值,可改变化合物的解离程度所致。样品电离度的降低,减少了样品与色谱柱的反应,样品组分就可以较快地从柱中流出。增加流动相的离子强度,平衡移向不利于样品与柱填料反应的方向,利于样品从柱中较快流出。 2.分子排阻色谱法是基于样品分子量大小不同而多样品进行分离的色谱法。固定相是有一定孔径的多孔填料,小分子量的化合物进入孔中,流动相是可 以溶解样品的溶剂。分离过程是按分子量大小的顺序,分子量大的化合物先从柱中洗脱。 分子排阻色谱法常用于分离高分子化合物或复杂的物质,如组织提取物、核酸、蛋白质等。 2. 1.离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂,流动相一般为水或含 有有机溶剂的缓冲液。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离. 2.排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱,是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同,以使组分分离。它类似于分子筛的作用, 但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后,随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻,因此就直接通过柱子,首先在色谱图上出现,一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中,这些组分在柱上的保留值最大,在色谱图上最后出现。 常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等,可根据载体和试样的性质,选用水或有机溶剂为流动相。

离子交换与离子交换色谱

仲恺农业工程学院Array论文题目:离子交换与离子交换色谱 论文作者:陈维权万辉 作者学号:201111014228 201111014229 所在院系:化学化工学院 专业班级:应用化学112班 指导老师:刘展眉

离子交换与离子交换色谱 摘要 本文对离子交换与离子交换色谱技术进行了综述。简要介绍了离子交换剂的作用原理;重点系统的论述了有机离子交换技术和无机离子交换技术的研究进展。并展望了有机离子交换技术和无机离子交换技术的发展方向。 关键词 离子交换色谱离子交换剂有机离子交换无机离子交换 Abstract This article by ion-exchange chromatography and ion exchange technologies for review. Brief description of the action principle of ion exchanger; key system deals with organic and inorganic ion-exchange technology of ion-exchange technology advances. And the prospect of organic ion exchange technology and development trend of inorganic ion-exchange technology. Keywords Ion Exchange Color spectrum Ion exchanger Organic ion exchange Inorganic ion exchanger 引言 随着科学技术的发展,现代分析化学的分析对象越来越复杂,待检测组分含量越来越复杂,待检测组分含量越来越低,在地球和宇宙科学、环境科学、生命科学、材料科学以及医学和考古学中,经常要求检测μg∕g,nm∕g,pg∕g甚至更低含量的组分。目前虽然有许多灵敏度和选择性很高的仪器分析方法,但在分析实践中,常常由于存在基体效应以及其他各种干扰而难以得到准确的结果,因此在分离富集仍然是分析方法中不可缺少的重要环节。 回顾化学的发展历史便可以发现:化学的发展离不开分离富集。元素周期表中的各个元素的发现,经典的化学分离和提纯方法都曾经起着重要作用。从二十世纪开始,各种天然放射性元素的逐个发现,人工放射性元素的获得,原子核裂变现象的最终确认,几乎都离不开各种化学分离技术。今年来生命科学的许多重要成就,也都与分离科学有着紧密联系。在大多数分析实验中,对复杂物料的分析或痕量、超痕量分析一般均采用样品制备-分解-分离富集-测定-数据处理的分析流程,也就是说,分离富集是分析流程中必不可少,而且往往是相当困难而又关键的环节。从分析仪器的研制和发展趋势看,分离富集技术与测量技术紧密结合是仪器分析的必然趋势。目前最有成效的是气相色谱仪、高效液相色谱仪、离子色谱仪以及测汞仪等,它们都是集分离-

氨基酸的离子交换柱色谱分离实验教案

氨基酸的离子交换柱色谱分离 【实验目的】 1.掌握离子交换树脂分离氨基酸的基本原理; 2.掌握离子交换柱层析法的基本操作; 3.掌握氨基酸和茚三酮显色反应机理及洗脱曲线的绘制。 【实验原理】 1.离子交换层析原理 离子交换层析是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法.离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.树脂一般都制成球形的颗粒.阳离子交换树脂含有的酸性基团如磺酸基(一S03H),磷酸基(一P03H),亚磷酸基(一PO2H),羧基(一COOH),酚羟基(一OH)等,可解离出H离子,当溶液中含有其他阳离子时,例如在酸性环境中的氨基酸阳离子,它们可以和H 离子发生交换而"结合"在树脂上 本实验采用磺酸型阳子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和碱性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下,由于pH低于Lys的pI值,Lys可解离成阳离子,吸附在树脂上;又由于pH高于Asp的pI值,则Asp可解离为阴离子,不能被树脂吸附而直接流出色谱柱。在pH12条件下,因pH高于Lys的pI值,Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来,这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 2.茚三酮反应机理 在弱酸条件下(pH5-7),蛋白质或氨基酸与茚三酮共热,可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。该反应颜色产物在570nm处有最大吸收峰。 【仪器与试剂】 1.仪器: 层析柱(20cmX1cm);铁架台;恒流泵;部分收集器;分光光度计;移液枪;恒温水浴锅;试管玻璃棒烧杯等常用器材。 2.试剂:

连续离子交换

连续离子交换技术与设备 首 页 >> 技术设备 >> 连续离子交换技术与设备 连续离子交换技术和工业色谱技术是一种完全革新的分离工艺技术,不同于传统的固定床(Fixed Bed)、脉冲床(Pulse Bed)、模拟移动床(Simulated Moving Bed)等工艺。它是在传统的固定床树脂吸附和离子交换工艺的基础上结合连续逆流系统技术优势开发而成。 连续离子交换技术和工业色谱技术可用于分离、精制和回收各种工业用水及其他溶液中的特定有效物质及有害物质,此系统可使用传统的吸附剂(如离子交换树脂、活性炭及合成吸附剂等)。 两组分分离:基于两组分的速度不同而将其分离

固定床与逆流连续床比较 整个工艺循环 连续离子交换系统由一个带有多个树脂柱(16,20,30柱)的圆盘,和一个多孔分配阀组成。通过圆盘的转动和阀口的转换,使分离柱在一个工艺循环中完成了吸附,水洗,解吸,再生的全部工艺过程。且在连续离交系统中,离子分离的所有工艺步骤在同时进行。相比而言,固定床离子分离系统是在一种间歇式的工艺中一步一段时间的进行所有步骤的操作。

旋转示意流程 系统特点: 产品成分和浓度保持稳定; 由于采用多柱系统,可灵活变更生产工艺流程 全自动、程序化的操作控制,运行稳定,避免人 工操作失误 设备紧凑,易于安装在任何位置,易与旧的生产 过程和设备匹配; 可同时去除或者分离具有不同特性的物质,可将复杂的工艺简单化; 树脂用量大幅减少50-90%,洗涤水的用量最高可节约50-70%,化学药品、洗脱剂的消耗也得到相应减少,减少运行成本和设备投资; 主要应用领域 制药行业(抗生素、维生素) 精细化工和生物技术(手性物质的分离) 食品行业(糖的软化、葡萄糖的去矿化,糖浆的脱色,果葡糖浆的纯化)

高效液相色谱法的分类及其分离原理

高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为:液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法(液-固吸附色谱法) 固定相是固体吸附剂,它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂:一些多孔的固体颗粒物质,其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后,在随载液流动的过程中,发生如下交换反应: X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相) 其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为: K值较小:溶剂分子吸附力很强,被吸附的溶质分子很少,先流出色谱柱。 K值较大:表示该组分分子的吸附能力较强,后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡,就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂:薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律:对于固定相而言,非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱,分配比k较小,保留时间较短;但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强,分配比k大,保留时间长。 对流动相的基本要求: 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相:甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不;数量官能团的有机化合物,以及有机化合物的不同的异构体;但液-固色谱法不宜用于分离同系物,因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法(液-液分配色谱法) 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时,在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较快;在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液,在色谱柱中向前迁移速度较慢,从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同,均服从分配定律:K=C固/C液 K值大的组分,保留时间长,后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相,非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相,极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相。

色谱法分离原理教案

第十四章色谱法分离原理 一.教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二.重点与难点 1.塔板理论,包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数 (n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三.教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线(色谱峰)所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法 四.学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有

碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相;自上而下运动的一相(一般是气体或液体)称为流动相;装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度,可将色谱法分类如下: 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱(G C) 根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的 一薄层有机化合物液体),又可分为气固色谱(G S C)和气液色谱(GL C)。液体为流动相的色谱称液相色谱(LC) 同理液相色谱亦可分为液固色谱(L SC)和液液色谱(L LC)。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱(SF C)。随着色谱工作的发展,通过化学反应将固定液键合到载体表面,这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱(CB PC). 2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法,称为吸附色谱法。 利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法,称为离子交换色谱法。

实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离

实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离 【原理】 本实验采用磺酸型阳子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下,因为低于Lys的pI值,Lys可解离成阳离子挂在树脂上;高于Asp的pI值,则Asp可解离为阴离子,不能被树脂吸附而直接流出色谱柱,在pH 12条件下,因高于Lys的pI值,Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来,这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 【操作】 1、树脂的处理 关于市售新树脂的处理见注1,关于树脂浮洗的方法参照讲义所述,本实验采用处理好的树脂。 2、装柱:将色谱柱垂直装好,关闭柱底出口,在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。 将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中,加进1~2倍体积的柠檬酸缓冲液,经抽气处理后,搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满,倒时不要太快,以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2~3cm高时,用吸管吸去柱内上层所出现的清液,慢慢打开柱底出口,继续加注树脂悬液,直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败,另外树脂悬液的温度要相对恒定(特别是对于采用高温法)。装好的柱体应该没有纹路,没有裂痕,没有气泡和柱顶表面平整而均匀,这样方可投入使用,否则要重装。 3、平衡:柱装好后接上预先调好的恒流泵,用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡,直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止(pH试纸检查),这大约需要2~3倍床体积。 4、加样与洗脱:移去柱上的液器塞,打开柱底出口,小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中,加样时不要过快,以免冲坏树脂表面,加样后慢慢打开柱底阀,使液面再与树脂面相齐时关闭,然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1~2次。洗涤后,用缓冲液在柱内加到约2cm 高的液层,然后接上恒流泵,调流速0.5ml/分即开始洗脱。 注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡,并且在调节时不要过猛,以免影响色谱行为。 5、收集:柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。 6、改换高pH洗脱收集:关闭恒流泵及柱底阀,将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液,然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。 7、测定:(注2)将收集的各管编号后,分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中,加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液,0.5ml茚三酮试剂,混合后在100℃水浴上加热25分钟。然后水冷却5~10分钟,加3m160%乙醇衡稀释,摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。测定后,以光密度为纵坐标,收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。 8、再生,对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱,再用蒸馏水洗至中性后重复使用。 注:1、对于市售的干树脂其处理方法为:先经水充分溶胀后,倾去上面的泥状细粒,

离子交换柱交换层析法分离氨基酸知识讲解

离子交换柱交换层析法分离氨基酸

离子交换柱层析法分离氨基酸 一、实验原理 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力(静电引力)而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂,流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。 树脂(惰性支持物)上结合了阳离子或阴离子后,可与阴离子或阳离子结合,改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同,故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出,达到分离的目的。带电荷量少,与交换剂亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量大,与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。 本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂,分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下,Asp和Lys的带电情况不同,与磺酸集团的亲和力不同,因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后,测定吸光度,从而得到洗脱曲线。 二、实验器材 实验仪器:层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂:Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液(pH5.3)、 0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品(0.005mol/L的Asp和Lys,用 0.02mol/L的HCl配制) 三、实验操作记录 1、树脂的处理

干树脂经蒸馏水膨胀,倾去细小颗粒,然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗,每次浸2h,并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小时(转型),用蒸馏水洗至中性。 2、装柱前的准备 选择直径1cm,长度15~20cm的层析柱,观察柱底端滤膜是否完好,分别用流水和蒸馏水冲洗干净。 将层析柱垂直装在铁架台上,柱进水口和出水口装上橡皮管,关闭柱底端出口,在柱内注入少许(约1cm高)的洗脱液,打开出水口,排净管内空气后关闭出水口。 3、装柱 向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液,用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状,然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快,以免产生泡沫和气泡。 待树脂在柱底部有明显沉积(约1cm高)后,缓慢打开出口(或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液),继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续,均匀,无文格、无气泡,表面平整,液面不得低于树脂表面,否则要重新装柱。 4、平衡 层析柱装好后,接上已调好流速的恒流泵,用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡,直到流出液的pH与洗脱液pH相同(约需2~3倍柱床体积)。5、加样

气相色谱的分离基本原理

一、气相色谱的分离基本原理是什么? 1.利用混合物中各组分在流动相和固定相中具有不同的溶解和解吸能力,或不同的吸附和脱附能力或其他亲和性能作用的差异。 2.当两相作相对运动时样品各组分在两相中反复多次受到各种作用力的作用,从而使混合物中各组分获得分离。 二、简述气相色谱仪的基本组成。 基本部件包括5个组成部分。 1.气路系统;2.进样系统;3.分离系统;4.检测系统;5.记录系统。 简述气相色谱法的特点? 1、高分离效能; 2、高选择性; 3、高灵敏度; 4、快速; 5、应用广泛。 三、什么叫保留时间? 从进样开始至每个组分流出曲线达极大值所需的时间,可作为色谱峰位置的标志,此时间称为保留时间,用t表示。 四、什么是色谱图? 进样后色谱柱流出物通过检测器系统时,所产生的响应信号时间或载气流出气体积的叫曲线图称为色谱图。 五、什么是色谱峰?峰面积? 1、色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线称为色谱峰。 2、出峰到峰回到基线所包围的面积,称为峰面积。 六、怎样测定载气流速? 高档色谱仪上均安装有自动测试装置,无自动测试装置可用皂膜流量计测,将皂膜流量计连接在测检测出口(也可将色谱柱与检测器断开皂膜流量计测接在色谱柱一端),测试每分钟的流速。测完后色谱升温压力表指示会升高,原因是温度升高色谱柱对气体的阻力增加,不要把压力调下来,当色谱温度升高稳流指示不会改变。测试载气流速在室温下测试。 七、怎样控制载气流速? 载气流速的控制主要靠气路上高压钢瓶上的减压阀减压,然后经仪器的稳压阀稳压,再经稳流阀以达到控制载气流量稳定,减压阀给出的压力要高出稳压后的压力。非程序升温色谱一般没有稳流阀,只靠稳压阀控制流速。 八、气相色谱分析怎样测其线速度? 1、一般测定线速度实际上是测定色谱柱的死时间; 2、甲烷作为不滞留物,测定甲烷的保留时间(TCD检测器以空气峰), 3、用色谱柱的长度除以甲烷的保留时间得到色谱柱的平均线速度。 九、气相色谱分析中如何选择载气流速的最佳操作条件? 在色谱分析中,选择好最佳的载气流速可获得塔板高度的最小值。因此,从速率理论关于峰形扩张公式可求出最佳流速值。通常色谱柱内径4mm,可用流速为30ml/min 十、气相色谱分析中如何选择载气的最佳操作条件? 1、载气的性质对柱效和分析时间有影响; 2、用相对分子质量小的载气时,最佳流速和最

色谱法分离原理word版

色谱法分离原理 一.教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二.重点与难点 1.塔板理论,包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数(n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三.教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线(色谱峰)所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法

四.学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时,将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内,然后加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离,“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中,将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相(固体或液体)称为固定相;自上而下运动的一相(一般是气体或液体)称为流动相;装有固定相的管子(玻璃管或不锈钢管)称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度,可将色谱法分类如下: 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱(G C) 根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的

离子交换色谱-

离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺 何强1, 孔祥虹1, 李建华1, 乐爱山1, 赵洁2 ( 1. 陕西出入境检验检疫局, 西安710068; 2. 西安理工大学理学院, 西安710054) 摘要: 建立离子交换色谱- 紫外检测法测定乳制品中三聚氰胺。样品直接用水和乙腈提取, 分析时用LC - SCX离子交换色谱柱分离, 浓度为0.05 mol/ L磷酸二氢钾溶液( pH值为3.0) - 乙腈( 70 ∶30) 为流动相, 流速1.0 mL/min, 在紫外波长240 nm下检测。三聚氰胺在0.5 ~ 100.0 mg/ L的范围内, 质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系( r=0.9999) , 最低检出限为1.0 mg/ kg, 加标回收率在93.8 % ~102.5 %范围内, 相对标准偏差(RSD) 小于3.5 %。该方法简便、快速、准确, 能够满足检测要求。 关键词:三聚氰胺; 乳制品; 离子交换色谱 Determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatography and UV detection HE Qiang1, KONG Xiang- hong1, LI Jian- hua1, YUE Ai- shan1, ZHAO Jie2 (1. Shaanxi Entry - Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xi' an 710068, China; 2. College of Science, Xi' an Universityof Technology, Xi' an 710054, China) Abstract: A method was developed for the determination of melamine in dairy products with ion exchange chromatography. Samples were extracted with water and acetonitrile. Chromatographic analysis was performed on a LC - SCX column eluted with 0.05 mol/ L KH2PO4(pH=3.0) - acetonitrile (70∶30) at a flow rate of 1.0 mL/min and UV detection at 240 nm. The present method showed good linear relationship(r = 0.9999) for melamin at the range of 0.5 ~ 100.0 mg/ L, the detection limit were 1.0 mg/ kg, the recoveries ranged from 93.8 % to102.5 % with relative tandard deviations (RSD) less than 3.5 %. The ethod is simple, fast, accurate for the melamine analysis. Key words: melamine; dairy products; ion exchange chromatography 正文: 最近美国FDA调查确认宠物食品受三聚氰胺污染是造成许多宠物非正常死亡的原因, 从而要求出口到美国的含蛋白产品必须检测三聚氰胺, 已经对我国的食品出口企业产生了较大的负面影响。三聚氰胺(melamine)简称三胺, 学名三氨三嗪, 别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺, 分子式为C3N6H6, 是一种重要的氮杂环有机化工原料, 具有一定的肾毒性。因为其分子中 含有大量氮元素, 而用全氮法检测蛋白质含量时不能够区分这种“伪蛋白氮”, 所以一些不法

相关文档