生理指标测定

生理指标测定_16种

1、冻害指数——3~5株观察形态

【４种常绿水生鸢尾抗寒性的初步研究】张京，2012

李刚，姜卫兵，翁忙玲，等．木兰科６种常绿树幼苗抗寒性的初步研究［Ｊ］．园艺学报，２００７，３４（３）：７８３－７８６．

描述叶色变化：

在最冷月( 2月中旬) , 所有供试树种均有不同程度的冻害表现, 乐东拟单性木兰受冻害最轻,只有部分植株的少量叶片有些许水渍状, 大部分植株完好无损, 冻害指数为041, 基本不受冻害;阔瓣含笑也长势良好, 有少部分叶片出现褐色水渍状, 冻害指数为14, 受轻度冻害; 金叶含笑受到了中度水平的冻害, 部分植株的叶片整个叶面呈现红褐色水渍状, 冻害指数为25; 红花木莲、醉香含笑和观光木受到了重度冻害, 大多数植株的部分叶片呈焦黄、褐色脱落, 有的整个植株呈萎蔫状,长势非常差, 冻害指数分别为3.2、3.9、4.3.

2、相对含水量

叶片相对含水量采用饱和称重法［21］测定。选取各处理部位一致、成熟完好的叶片迅速称其鲜重，再用蒸馏水浸泡8~24 h，使组织吸水达到饱和状态，取出后吸去表面水后立即称其饱和重，然后在105 ℃下杀青30min，在80 ℃下烘干至恒重（1h~24h），放在干燥器中冷却，称其烘干重。根据公式计算:LRWC( %) = [ (鲜重－干重) /(饱和重－干重) ] × 100%

3、光合参数（光合仪测定）

光合速率、CO2浓度、光合有效辐射、叶绿素

或用95%乙醇浸泡法，浸泡4~5d，测定叶绿素。《植物生理生化实验原理和技术》

4、膜质过氧化：相对电导率（略）、MDA

MDA（丙二醛）的测定

试剂：三氯乙酸10% （TCA 溶液）：称取100g溶于1L 蒸馏水中；

0.6％硫代巴比妥酸溶液（6%TBA）：1.8g溶于300ml TCA 溶液中（加热溶解）

称取植物叶片0.3克, 先加入2ml TCA和少量石英砂研磨至匀浆，再加入4ml 10%三氯乙酸(TCA)进一步研磨（总体积为6ml），然后以4000g离心10min, 取上清液待测。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6% TBA，混匀物于沸水浴上反应15分钟，迅速冷却后再离心(在冰箱中冷却较快)。取上清液测定在532，600和450nm波长下比色。

公式C

MDA

(nmol L-1)＝[(A532－A600)-0.0571×(A450-A600)]/0.155计算MDA量（排除多糖干扰），用每克干（鲜）重中MDA的量表示MDA的含量，单位μmol g-1干（鲜）重或nmol g-1干（鲜）重。

1、含量计算

双组分光光度计法：已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm波长下的比吸系数分别为

85.40,7.40；MDA与 TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，其吸收系数为0，532nm下比吸

收系数为155，根据双组分光光度计法建立方程组，计算公式如下：

C

1（mmol/L）=11.71 D

450

C

2

=[6.45(D

532

—D

600

) — 0.56 D

450

]X提取液总体积/测定时用的提

取液体积*样品鲜重

C

1:可溶性糖的浓度, C

2

为MDA的浓度, D

450

D

532

D

600

分别代表450,532,600nm下的消光度值.

参：Brege J G.Microsomal lipid peroxiodation. Methods in Ezymmology.1978,52:302-306 J.G. Buege and S.D. Aust, Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol.52(1978), pp. 302–306.

注: 沸水浴时,可使用小试管,然后上部用保鲜膜包扎.(如橡皮筋)

附4.1 MDA、可溶糖含量—硫代巴比妥酸加热显色法

【原理】植物遭遇逆境胁迫或衰老过程中，由于自由基、活性氧的积累引起膜脂过氧化，产生脂质自由基，进一步诱发膜脂连续过氧化并导致蛋白质交联变性，而引起细胞损伤或死亡。MDA 是膜脂过氧化的最终产物，通过其含量的测定可了解膜脂氧化伤害的程度，比较不同植物抗逆性的差异。

在酸性和高温条件下，MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红棕色的产物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮）。该产物在532nm处有最大吸收峰，测定反应产物在532nm处的光密度值，可计算出MDA含量。但植物组织中的可溶性糖亦与TBA产生颜色反应，其产物对532nm 光的吸收干扰测定。采用双组分光光度法及其计算式，可排除干扰，计算出MDA的含量。

【器材】分光光度计离心机水浴锅研钵剪刀试管

【试剂】

（1）10%（W/V ）三氯乙酸（TCA ）：称取10gTCA 定溶于100ml 水中

（2）0.6%硫代巴比妥酸（TBA ，以10%的TCA 配制）：取0.6035g 溶于100ml 上述TCA 中（适当加热，否则难溶） 【方法】

（1）取0.1g （取0.25g 或0.3g ）叶片，加10%TCA10ml （8ml ）研磨，研磨后在4000r/min 下离心10min （15min ），上清液为样品提取液

（2）取上清液2ml （对照加2ml 蒸馏水），加0.6%的TBA2ml ，混合后在100℃水浴上煮沸10min （15min ）（以小试管冒小气泡开始计时），迅速冷却后如有沉淀再离心一次。分别测定上清液在450nm ，532nm ，600nm 处的吸光值。 【计算】

MDA 浓度（umol/L ）=6.45（A 532-A 600）-0.56A 450 MDA 含量（umol/gFW ）=MDA 浓度*VT*10-3/FW 可溶糖浓度（umol/L ）=11.71A 450

可溶糖含量（umol/gFW ）=可溶糖浓度*VT*10-3/FW VT ——提取液总体积（ml ） FW ——样品鲜重（g ）

【注意】低浓度的铁离子能够显著增加TBA 与蔗糖或MDA 显色反应物在532、450nm 处的吸光值，所以在蔗糖、MDA 、TBA 显色反应中需一定量的铁离子，通常每克干重植物组织中铁离子的含量为100-300ug ，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe 3+的终浓度为0.5umol/L

附4.2 过氧化氢（MDA 和过氧化氢用同一提取液）

参考Matsubara 等（1983），Partterson 等（1984），林植芳（1988）和刘俊等（2000）的方法，利用H 2O 2与和钛离子形成有色的[TiO （H 2O 2）]2+配合离子（特异吸收峰在410 nm ）的原理对H 2O 2含量进行测定。 【药品】

10%三氯乙酸：称10g 三氯乙酸定容至100ml

20%TiCl 4浓HCl 液：吸取2ml TiCl 4，用10ml 浓HCl 溶解（注意：两者皆为强挥发性强腐蚀性液体，务必轻拿轻放，通风橱中进行，注意避光保存） 1mol/L 硫酸：吸取5.4ml 浓硫酸，稀释至100ml

1mmol/L 过氧化氢1000ml ：取0.15ml30%过氧化氢，定容至1000ml 【方法】

准确称取0.5 g （最佳）不同人工老化大豆的新鲜胚轴于6 mL 10％三氯乙酸中研磨成匀浆，定容至10 mL （就用8ml 研磨）。提取液在10000×g 室温下离心10 min 。取上清液1 mL 加入0.1 mL 20％TiCl 4的浓盐酸液，再加入0.2 mL 浓氨水。4500×g ，室温下离心10 min 。沉淀用3mL 1 mol L －1硫酸充分溶解后，置紫外可见分光光度计上测定410 nm 处吸光光度值。

用标准过氧化氢溶液（0-1mmol L －1）用以上方法做标准曲线。根据样品吸光光度值对应标准曲线求出过氧化氢量，并计算过氧化氢含量，单位μmol min －1 g －1干重( or 鲜重)。

5、游离脯氨酸

【原理】当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性印三酮加热处理，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低，在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

【器材】

【药品】

（1）80%乙醇（8ml乙醇加2ml水），人造沸石，活性炭

（2）6mol/L磷酸：取纯的磷酸40.92ml，用100ml容量瓶定容。

（3）茚三酮试剂：将1.25g茚三酮（重结晶）于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中加热（70℃）溶解。4℃保存，试剂两天内稳定，但最好现配现用。茚三酮的用量与脯氨酸的含量有关，一般当脯氨酸含量在10μg/ml以下时，显色液中茚三酮的浓度要达到10mg/ml,才能保证脯氨酸充分显色。

（4）脯氨酸标准液：准确称取10mgPRO溶于少量80%乙醇中（也可直接用蒸馏水溶），定容到100ml，其浓度为100μg/ml。（再取此液10ml，用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标液——一般不做此步）

【方法】（制样和标准曲线一起做）

（1）绘制标准曲线

吸取脯氨酸母液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0ml分别放入8个50ml容量瓶中，分别加入蒸馏水定容，配成1ug/ml，2，3，4，5，6，7，8μg/ml。分别吸取上述标准溶液2ml,加冰醋酸2ml，茚三酮试剂2ml入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热30min。冷却后准确加入4Ml甲苯，剧烈震荡30S，静置10min，待红色物质全部转入甲苯溶液时，用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，用分光光度计在520nm下进行比色测定，以甲苯溶液为空白对照，以脯氨酸浓度（或含量）为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。

（2）样品液提取

取叶片0.1g（0.3g为宜）加5ml3%磺基水杨酸，加盖（有塞试管），在沸水浴中提取10min，提取过程中要经常摇动，冷却后，以3000r/min离心10min，上清液待测。

取2ml待测液于另一干净的带玻塞试管，加入2ml冰乙酸，2ml酸性茚三酮，在沸水浴中加热30min，溶液即成红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层红色脯氨酸甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，比色

【计算】

脯氨酸含量=浓度*提取液体积*2.5/（样品干重*106）

【注意】

配制的茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现配现用。茚三酮的用量与脯氨酸的含量相关。一般当脯氨酸的质量浓度在10ug/ml时，显色液中茚三酮的质量浓度要达到10mg/ml时才

能保证充分显色

称量可以大些，且称量基本一致

6、POD、CAT、SOD、可溶性蛋白

POD,CAT, SOD，可溶性蛋白含量用同一提取液。

母液配制① Na

2HPO

4

. 12 H

2

O 71.64g 蒸馏水，加热溶解至 1L 备用

② NaH

2PO

4

. 2H

2

O 31.21g 蒸馏水，加热溶解至1L 备用

提取液 (PH7.0) ① 305ml ② 195ml

取0.3g 材料，加 6ml 提取液研磨成匀浆，匀浆在4℃下， 15000g 下离心20分钟，取上清液进行酶活测定或液氮冷却后存于－80℃备用。各取约80 ul 酶液，分别加入3ml 反应液，分别在POD 470 nm, CAT 240 nm处比色。

POD反应液 (300ml) PH6.0

① 37ml + ② 263ml + H

2O

2

1.704ml （15mmol） + 愈创木酚（磁力搅拌器溶解）168ul （3mmol）

【计算】

POD活性（u/gFW）=△A470*VT/（0.01*FW*V1*t）△A470——反应时间内吸光值的变化

VT——酶提取液总量（ml）

FW——鲜样重（g）

V1——测定用酶液体积（ml）

t——反应时间（min）

CAT 反应液（200ml） PH7.0

① 122ml + ② 78ml + H

2O

2

227.2 ul （1mmol）

【计算】

CAT活性（u·gFW-1·min-1）=(Ack-As)*V

T /(0.1*V

1

*FW*t)

Ack—空白对照管吸光值

As—样品管吸光值

V

T

—制备的酶液总量（ml）

0.1—A240nm每下降0.1为一个酶活力单位（u）

V

1

—测定用酶液量（ml）

FW—样品鲜重（g）

t—反应时间（min）

SOD （取上清液0.1ml进行测定，反应时间为25min）PH7.8（2）0.05mol/L pH7.8PBS

（3）130mmol/LMET（蛋氨酸溶液）：称1.9399（0.970）gMET用上述磷酸缓冲液定容至100（50）ml

（4）750umol/LNBT（氮蓝四唑溶液）：称取0.06133（0.03067）gNBT用磷酸缓冲液定容至100（50）ml避光保存

（5）100umol/LEDTA-Na

2

（乙二胺四乙酸钠溶液）：称取0.03721（0.0038）g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000（100）ml

（6）20umol/L核黄素溶液：称取0.0753（0.0076）g核黄素用蒸馏水定容至1000（100）ml，避光保存

【方法】

试剂（酶）（ml）

管号

1 2 3 n

0.05mol/LpH7.8PBS 1.5 1.5 1.5 1.5

130mmol/LMET 0.3 0.3 0.3 0.3

750umol/LNBT 0.3 0.3 0.3 0.3

100umol/LEDTA-Na

2

0.3 0.3 0.3 0.3

20umol/L核黄素

（最后）

0.3 0.3 0.3 0.3

蒸馏水0.2 0.2 0.2 0.2

酶液0.1 0.1 0.1 0.1

总体积 3.0 3.0 3.0 3.0

（1）先将配制好的各试剂混合（核黄素除外）取一烧杯，按20只试管算，应依次向烧杯中

加入0.05mol/L pH7.8PBS30ml、130mmol/LMET6ml、750umol/LNBT6ml、100umol/LEDTA-Na

2

6ml、蒸馏水5ml。

（2）加液各管加入混合液2.6ml，对应编号的酶液（2只对照管加PBS）0.1ml。

（3）反应显色迅速加入20umol/L核黄素溶液0.3ml，同时放置于4000lx日光下反应20min （其中1只对照管置于暗处）

（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，温度低，时间延长）。反应结束后，以不照光的对照光作为空白，在波长560nm处分别测定各管吸光值。以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活力单位

计算

SOD活性（U/gFW）=（Ack-As）*V

T /（Ack*0.5*FW*V

1

）

Ack——照光对照管吸光值As——样品管吸光值

V

T

——酶提取液总体积（ml）FW——样品鲜重（g）

V

1

——测定时所用酶液体积（ml）

可溶性蛋白(上清液0.1ml进行测定) PH7.8——紫外分光法（260-280）

85%正磷酸溶液： 50ml磷酸溶液加蒸馏水定容至210ml

G-250 ： 100mg 溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%正磷酸加蒸馏水定容至1L 牛血清蛋白（100ug/ml）： 10mg 溶于100ml蒸馏水中（难溶，磁力搅拌器上约一天）

蛋白标准曲线制作

试剂1号2

号

3

号

4

号

5

号

6

号

样品管

蛋白标准液（100ug/ml）0 ml 0.

2

0.

4

0.

6

0.

8

1.

取样品上清液

0.1 ml

蒸馏水 1.0

ml 0.

8

0.

6

0.

4

0.

2

0 0.9

G-250 5 ml 5 5 5 5 5 5

蛋白含量0 20 40 60 80 10

计算：含量（mg/g FW）= C (mg/L)* 提取液总量（ml）/ 反应量*样品鲜重（mg）

附6.1

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4?12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4?2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g 下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定

（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；

（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中

（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；

同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作

为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的

一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt）

SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量

SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照

光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；

Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋

白质含量单位为mg/g。

二、POD、CAT酶活性的测定

粗酶液制备同SOD。

1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）

（1）试剂配制：

0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混

匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；

（2）反应混合液配制（以60个样为准）：

取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶

解，冷却后加入0.112ml 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

（3）样品测定：

取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加

样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的

时间相差不大）每30S读数一次。

（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)

ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总

体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。

2、过氧化氢酶（CAT）活性测定

（1）试剂配制：

0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。

（2）反应液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。

（4）酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。

CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)

ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。

附6.2 POD,CAT,APX,SOD,G R,可溶蛋白测定（磷酸缓冲液提取法）材料0.3g

POD,CAT,APX用同一提取液。

母液配制① Na

2HPO

4

. 12 H

2

O 71.64g？蒸馏水，加热溶解至 1L 备用

② NaH

2PO

4

. 2H

2

O 31.21g 蒸馏水，加热溶解至1L 备用

提取液 (PH7.0) ① 305ml

② 195ml

Triton 1.5ml 混合，定容至500ml 备用

EDTA（分子量416.20） 0.208g

PVP 10g 1％＝？g (溶解时多搅拌)

取0.3g 材料，加 6ml 提取液研磨成匀浆，匀浆在4℃下， 15000g 下离心20分钟，取上清液进行酶活测定或液氮冷却后存于－80℃备用。各取约80 ul 酶液，分别加入3ml 反应液，分别在POD 470 nm, APX 290 nm，CAT 240 nm处比色。

POD反应液 (300ml) PH6.0

① 37ml + ② 263ml + H

2O

2

1.704ml （15mmol） + 愈创木酚（磁力搅拌器溶解）168ul （3mmol）

CAT 反应液（200ml） PH7.0

① 122ml + ② 78ml + H

2O

2

227.2 ul （1mmol）

APX 反应液（200ml）PH7.0

①122ml + ②78ml + H

2O

2

56.8 ul + 抗坏血酸0.0352g

SOD，可溶性蛋白含量，GR用同一提取液

提取液 (PH7.8) ① 458ml

② 42ml

Triton 1.5ml 混合，定容至500ml 备用

EDTA（分子量416.20） 0.208g

PVP 10g (溶解时多搅拌)

取0.3g 材料，加 6ml 提取液研磨成匀浆，匀浆在4℃下， 15000g 下离心20分钟，取上清液进行SOD, 可溶性蛋白、GR测定。或液氮冷却后存于－80℃备用。

*SOD （取上清液0.1ml进行测定，反应时间为25min）PH7.8

甲硫氨酸（分子量149.21）（50mmol/l）溶液：0.7416g 溶于 100ml缓冲液

NBT (分子量817.6) (750umol/l) 溶液：0.153g 溶于 250ml缓

EDTA (分子量416.20) (0.1mmol/l) 溶液：0.0042g溶于100ml缓

核黄素（分子量376.37）（20umol/l）溶液：0.0753g溶100 ml缓取1ml 溶于100ml 缓冲液

在盛有3mL反应混合液中加入适量SOD粗酶液（即提取上清液）0.1ml.

反应液的组成 (最好沿顺序加入)

试剂 1 号

(遮光) 2 号

（遮光)

3 号

(照光)

4 号

(照

光)

样品管

缓冲液 1.5 ml 1.5 1.5 1.5 1.5

50mmol/L甲硫氨

酸

0.3 ml0.3 0.3 0.3 0.3

750um/L NBT 0.6 ml0.6 0.6 0.6 0. 6 (可调

整)

0.1 mmol /L EDTA0.3 ml0.3 0.3 0.3 0.3

20 mmol/ L核黄素0.3 ml0.3 0.3 0.3 0.3

粗酶液（提取上清

液）

0 ml0 0 0 0.1(可调整)

蒸馏水0.6 ml0.6 0.60.60.5

混匀后，给1、2号管罩上遮光材料（锡铂纸包裹严实），与其它管均置于相同环境下处理，反应半小时，反应结束后，所有材料均避光保存，以遮光的对照管作为空白调零，在560nm 下进行比色。

计算：SOD活性 (u gFW-1 h-1) = ( 照光对照吸收值—样品管吸收值)*提取液总体积*60/(照光对照吸收值*0.5*FW*样品用量*照光分钟)

*可溶性蛋白(上清液0.1ml进行测定) PH7.8

85%正磷酸溶液： 50ml磷酸溶液加蒸馏水定容至210ml

G-250 ： 100mg 溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%正磷酸加蒸馏水定容至1L

牛血清蛋白（100ug/ml）： 25mg 溶于250ml蒸馏水中（难溶，磁力搅拌器上约一天）

蛋白标准曲线制作

试剂1号2

号

3

号

4

号

5

号

6

号

样品管

蛋白标准液（100ug/ml）0 ml 0.

2

0.

4

0.

6

0.

8

1.

取样品上清液

0.1 ml

蒸馏水 1.0

ml 0.

8

0.

6

0.

4

0.

2

0 0.9

G-250 5 ml 5 5 5 5 5 5

蛋白含量0 20 40 60 80 10

计算：含量（mg/g FW）= C (mg/L)* 提取液总量（ml）/ 反应量*样品鲜重（mg）*GR (取上清夜50μl进行测定) PH7.8

反应液：pH 7.8缓冲溶液+ 0.5 mmol L-1氧化型谷胱甘肽

取约含50μg蛋白的酶提取液加入1 mL反应液（50 mmol L-1Na

2HPO

4

-NaH

2

PO

4

缓冲溶液，pH 7.8，含0.5 mmol

L-1氧化型谷胱甘肽）中，充分混匀。加入100μL 1.5 m mol L-1 NADPH轻轻混匀，启动反应。紫外－可见分光光度计上读取340 nm处吸光光度值在3分钟内每15秒中的变化，反应温度25℃。根据消光系数计算每分钟每毫克蛋白减少的NADPH量(摩尔消光系数为6.22 L mmol-1cm-1)，用以表示酶活性，单位为nmol NADPH min-1 mg-1蛋白。

7、抗坏血酸过氧化物酶（APX）

【药品】

A：500ml的50mmol/LpH7.0PBS

B：0.0186EDTA-Na

2

C：0.0088g抗坏血酸（ASA）

D：5g不溶性的PVPP

APX提取液：A+B+C+D

E：0.088g抗坏血酸

F：0.3ml30%过氧化氢

反应液：A+E+F

【方法】

0.2克叶片置于液N中研磨成粉（略去）--→在6ML预先冷冻的提取液中研磨成匀浆(50m mol

l-1 Na

2HPO

4

.2H

2

O--NaH

2

PO

4

buffer (PH7.0), 内含0.1 m mol l-1EDTA, 0.1 m mol L-1 抗坏血酸,

及1%(W/V)不溶性PVP)--→匀浆在4℃下,12000g下离心6分钟,取上清液进行酶活性测定.

取约含50ug蛋白质的酶提取液加入1ML酶反应液(内含以50m mol l-1Na

2HPO

4

.2H

2

O--NaH

2

PO

4

buffer (PH7.0)为母液配 1 m mol L-1抗坏血酸和 2.5 m mol L-1H

2O

2

)（我们是将原酶液

0.2ml+2.0ml缓冲液稀释，再从中取0.2ml+1.8ml缓冲液+1.0ml反应液）

在290nm处OD值在0.5M 或 1m内的变化（变化很小，记录20s即可），值渐变小.

【计算】网上查

【注意】加0.1%曲拉通效果更好——陈良华

8、谷胱甘肽还原酶（GR）

参考Jiang和Zhang（2001，2002）的方法，取约0.2克材料置液氮中研磨成粉。6mL提取液（50

mmol L-1 Na

2HPO

4

-NaH

2

PO

4

缓冲溶液pH 7.0，1 mmol L-1 EDTA，1％（W/V）不溶性聚乙烯吡咯烷酮）

中研磨成匀浆。将匀浆在4℃，12000×g条件下离心6分钟。取上清液进行酶活性测定，或液氮冷却后存于－80℃。

参考Halliwell和Foyer（1978），Hausladen和Alscher（1994）的方法，利用GR 将NADPH 氧化成NADP的反应来测定酶活性。测定酶活性时，取约含50μg蛋白的酶提取液加入1 mL酶

反应液（50 mmol L-1 Na

2HPO

4

-NaH

2

PO

4

缓冲溶液，pH 7.8，含0.5 mmol L-1氧化型谷胱甘肽）中，

充分混匀。加入100μL 1.5 m mol L-1 NADPH轻轻混匀，启动反应。紫外－可见分光光度计上读取340 nm处吸光光度值在3分钟内每15秒中的变化，反应温度25℃。根据消光系数计算每分钟每毫克蛋白减少的NADPH量(摩尔消光系数为6.22 L mmol-1cm-1)，用以表示酶活性，单位为nmol NADPH min-1 mg-1蛋白。

9、还原型谷胱甘肽（孙群p170）

【原理】还原型谷胱甘肽（GSH）是植物细胞中重要的抗氧化剂之一，在水分胁迫下GSH含量下降，而氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量增加，二者呈负相关；由于GSSG水平与膜脂过氧化及溶质泄露水平呈正相关，而与蛋白质合成速率呈负相关，因此是一个良好的表示氧化胁迫的指标GSH与二硫代双-二硝基苯甲酸（TDNB）试剂pH7.0左右生成黄色可溶性物质，其颜色深浅在一定范围内与GSH浓度呈线性关系，因此可以用分光光度计在412nm下测定吸光度，并通过标准曲线计算样品中GSH含量

【器材】分光光度计、25ml容量瓶、刻度试管、玻璃研钵、移液管

【药品】

（1）GSH标准溶液：称取10mg分析纯GSH，溶于蒸馏水中，并定容至10ml，即为1mg/ml的标准母液，用时稀释10倍（0.1mg/mlGSH）

（2）5mmol/LEDTA-TCA试剂：用3%（W/V）三氯乙酸（TCA）配制成5mmol/L的EDTA溶液。称取EDTA 1.4613g或者EDTA-Na

2

1.6913g（注意看结晶水），TCA定容至1000ml即可

（3）0.2mol/LpH7.0的磷酸钾缓冲液：61.5ml1mol/L的K

2HPO

4

+38.5ml1mol/L的KH

2

PO

4

，定容到

500ml（注意看磷酸氢盐的结合水数）

（4）TDNB试剂：称取39.6mg二硫代双-二硝基苯甲酸（TDNB），用0.2mol/L的pH7.0的磷酸钾溶解并定容到100ml

（5）1mol/LNaOH溶液：称取分析纯氢氧化钠4.0g溶至100ml

【方法】

（1）制作标准曲线取7支10ml刻度试管1~7编号，按照下表加入各种试剂将上述溶液混合均匀，在室温下显色5min，最后用蒸馏水定容到5.0ml。在412nm波长下测定吸光度。以标准溶液中GSH浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作标准回归方程，并求出y 随x而变的样品GSH含量

（2）样品测定称取植物鲜样0.4g加入少量EDTA-TCA试剂研磨提取，并用该溶液定容至10ml，混合均匀后滤取5ml提取液备用

吸取2ml提取滤液，加入0.4ml左右1mol/LNaOH，将pH调至6.5~7.0，再加入0.1ml磷酸钾缓冲液和0.2mlTDNB试剂，空白以磷酸钾缓冲液代替TDNB试剂，其余步骤与标准曲线制作方法相同

试剂（ml）试管号

1 2 3 4 5 6 7

0.1mg/mlGS

H

0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0

EDTA-TCA 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

1mol/LNaOH 加入0.4ml左右，调节pH至6.5~7.0

磷酸钾缓冲0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

液

TDNB试剂0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 【计算】

GSH含量（ug/gFW）=C·V

t /(FW·V

s

)

C—根据标准回归方程计算出的样品GSH浓度

V

t

—样品提取液总体积（ml）

V

s

—测定用提取液体积（ml）

FW—样品鲜重（g）

10、维C—钼蓝比色法（方法一：孙群p172）（ASA）

【原理】钼酸铵在硫酸和磷酸根离子的存在下与维生素C反应，生成蓝色络合物（钼蓝），在660nm 处有最大吸收。当维生素C浓度在2~40ug/ml范围内时，符合朗伯-比尔定律。新鲜植物样品中的还原糖及常见的还原物质不干扰测定，而且反应迅速，专一性好。

【器材】分光光度计、匀浆机或玻璃研钵、25ml具塞刻度试管、100ml容量瓶、离心机、离心管、移液管

【药品】

（1）5%（W/V）钼酸铵溶液：称取5g钼酸铵溶于蒸馏水中，并定容到100ml

（2）草酸-EDTA溶液：称取6.30g草酸和0.75gEDTA-Na

2

溶于蒸馏水中并定容到1000ml （3）5%（V/V）硫酸：取5ml浓硫酸定容到100ml

（4）偏磷酸-乙酸溶液：取棒状偏磷酸3g加20%冰醋酸（取20ml冰乙酸+80ml水）48ml，溶解后加蒸馏水稀释至100ml（必要时过滤），在冰箱中可保存3d

（5）维生素C标准溶液：精确称取分析纯维生素C100mg，置100ml容量瓶中，加适量草酸-EDTA 溶液溶解后，再用该溶液定容到100ml，即成1mg/ml的标准溶液，此液随配随用（如果维生素C纯度不够，应进行标定）

【方法】

（1）标准曲线制作取7支25ml具塞刻度试管，按下表加入各种试剂

加完试剂摇匀后，置30℃水浴中保温15min，用蒸馏水稀释到25ml刻度，将溶液混合均匀，用1号空白管调零，在660nm波长下比色，记录吸光值，以标准维生素C含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线

（2）样品提取与测定称取植物叶片或其他组织0.5g（根据维C含量而定），加8ml草酸-EDTA 溶液研磨成匀浆，并仔细转入10ml容量瓶中，再用提取介质冲洗研钵及研棒2-3次，冲洗液合并于10ml容量瓶中。取一部分匀浆液经5000r/min离心10min后，取1ml上清液与标准管同法测定。若样品显色液中出现沉淀，可过滤后进行比色，不影响测定结果

试剂（ml）

试管号

1 2 3 4 5 6 7

V

c

标准

液

0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

草酸

-EDTA

5.0 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0

偏磷酸-

乙酸

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

1：19硫

酸

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

5%钼酸

铵

2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

V

c

含量

（mg）

0 10 20 40 60 80 100 【计算】

维生素C含量（mg/100gFW）=1000C·V

t /(V

s

·FW)

式中，C—标准曲线上查得的样品中维C 含量（mg）

V

t

—样品提取液总体积（ml）

V

s

—测定时用样品提取液体积（ml）

FW—植物组织鲜重

（方法二：陈良华）

原理: 钼酸铵在硫酸和磷酸根离子存在下与VC反应,生成蓝色络合物(钼蓝),在760nm下处有最大吸收值.

1、仪器：离心机、分光光度计、研磨、试管

2、5%钼酸铵: 称取5克钼酸铵溶于蒸馏水中,并定容到100ml.

草酸-EDTA溶液:称取3.15克草酸和0.375克EDTA-Na2溶于蒸馏水500ml（最好不要同时加去溶解）.

偏磷酸-乙酸溶液:取棒状偏磷酸3克加20%冰醋酸（冰醋酸20ml+水80ml）48ML,溶解后加蒸馏水稀释到100ML,在冰箱中可保存3天.

5%硫酸：量取5ml浓硫酸，稀释至100ml即可

Vc:称取100mgVc置于100ml溶量瓶中,并定容

3、操作方法：

称取0.5克叶片,另少量沙及1ML草酸EDTA磨成匀浆, 转移入离心管,提取液总体积为5ML,3000g下离心10分钟.

制作标准曲线:

试剂1号2号 3 4 5 6 7 样品Vc标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0

草酸-EDTA 5.0 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4 4

偏磷酸-乙

酸

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

5%硫酸 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

5%钼酸铵 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Vc 含量

(ug)

0 10 20 40 60 80 100

摇匀后于常温下保温15分钟,用蒸馏水稀释到25ML,混匀,用1号管作空白,在760nm下比色.

4、计算公式:

Vc含量(mg g FW-1)=(曲线上查得含量X提取液体积)/样品鲜重

【注意】冰醋酸在通风橱中配制

11、超氧自由基（孙群p174）

【原理】进入生物体内的一些分子氧（O

2），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基（O

2

.-），

特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。O

2

.-既可直接作用于蛋白质（酶）和核酸等生

物分子，也可衍生成羟基自由基（OH·）、单线态氧（1O

2）、过氧化氢（H

2

O

2

）及脂质过氧化自由

基（RO·、ROO·）等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。因此测定逆境条件下植物组织中O

2

.-产生及清除速率，可间接了解组织细胞的受损状况和抗性强弱

O

2.-能与羟胺溶液反应生成NO

2

-，NH

2

OH+2 O

2

.-+H+=NO

2

-+H

2

O

2

+H

2

O，NO

2

-经对氨基苯磺酸和a-萘胺

显色反应生成对苯磺酸-偶氮-a-萘胺（红色），该红色产物在530nm有专一吸收峰。根据NO

2

-显

色反应的标准曲线将A

530换算成NO

2

-的浓度，再根据上述反应式直接进行O

2

.-化学计量，即NO

2

-

的浓度乘以2得O

2

.-浓度

【器材】分光光度计、高速冷冻离心机、研钵、0.5、1.0、2.0、5.0ml移液管、20ml试管、恒

温水浴锅

【药品】

（1）65mmol/LpH7.8的PBS：91.5ml（74.3ml）A液+8.5ml（6.9ml）B液，溶至307.7ml（250ml）（2）17mmol/L对氨基苯磺酸：称取2.94g对氨基苯磺酸，加25ml浓HCl溶解，蒸馏水定容到1000ml

（3）7mmol/La-萘胺：称取a-萘胺1.0g，加25ml冰醋酸溶解，蒸馏水定容到1000ml

（4）10mmol/L盐酸羟胺：称取0.695g盐酸羟胺，溶至1000ml

（5）亚硝酸钠标准液：称取NaNO

2

（AR级）0.1000g，蒸馏水定容到100ml，摇匀后取5ml用蒸

馏水定容到1000ml，即为每毫升含NO

2

-5mg的标准液

【方法】

（1）标准曲线的制作取20ml试管7支，编号，按下表顺序添加试剂，每加一种试剂摇动试管使之混匀。

试剂加完后将各试管置30℃恒温水浴中保温30min，显色反应后测定A

530。以NO

2

-浓度为横

坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线

（2）O

2

.-的提取取待测植物样品2~4g（就2g）于研钵中，加适量65mmol/LpH7.8PBS研磨成匀浆，定容至10ml（8ml），四层纱布过滤，滤液经10000r/min离心10min，取上清液备用

（3）O

2

.-的测定取试管3支，各加样品提取液（上清液）2ml，PBS1.5ml，盐酸羟胺0.5ml，混合后25℃恒温水浴保温20min。另取3支试管，从上述3支试管中各取反应液2.0ml，对应加

入到3支试管中，与标准曲线同样的方法加入各种试剂，25℃反应20min。3ml正丁醇充分萃取后，如有沉淀离心，取正丁醇相于可见分光光度计上测定530nm处吸光度。（标准曲线1号试管液调零），记录测定数据。

试剂（ml）

试管号

1 2 3 4 5 6 7

NO

2

-标液0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 对氨基

苯磺酸

2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

a-萘胺试剂2.0

2.0

2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

每管

NO

2

-ug

数

0 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0

【计算】从标准曲线上查出样品测定液对应NO

2-的浓度，并换算成O

2

.-的浓度（X），按下式计算

O 2.-含量（ug/gFW）=X·V

t

·n/（FW·V

s

）

式中，V

t

—样品提取液的体积（ml）

n—测定时样品提取液的稀释倍数FW—样品鲜重（g）

V

s

—显色反应时取样品液的体积（ml）

X—从标准曲线上查得的样品液NO

2

-的浓度

最新植物生理指标测定方法

实验一植物叶绿素含量的测定（分光光度法） (张宪政，1992) 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，则反之。 二、材料、仪器设备及试剂 试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮） 三、实验步骤 称取剪碎的新鲜样品0.2～0.3g，加乙醇10ml，提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。四、实验结果按计算 丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的计算】 叶绿素a的含量（mg/g）=（12.71?OD663 – 2.59?OD645）V/1000*W 叶绿素b的含量（mg/g）=(22.88OD645 – 4.67OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量（mg/g）=(8.04?OD663 +20.29?OD645) V/1000*W 按Inskeep公式 叶绿素a的含量（mg/g）=（12.63?OD663 – 2.52?OD645）V/1000*W 叶绿素b的含量（mg/g）=(20.47OD645 – 4.73OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量（mg/g）=(7.90?OD663 + 17.95?OD645) V/1000*W

植物生理生化测定

2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5% NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取其叶片测定其SOD 活性，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。 2.1.8.1主要试剂及配方 （1）0.1 mol/l pH 7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A液（0.1 mol/l Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO4·12H2O 7.163 g，用少量蒸馏水溶解后定容至200 ml，4℃冰箱中保存备用； B液（0.1 mol/l NaH2PO4溶液）：称取NaH2PO4·2H2O 0.780 g，用少量蒸馏水溶解后定容至50 ml，4℃冰箱中保存备用； 取上述A液183 ml与B液17ml充分混匀后即为0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液，4℃冰箱中保存备用。 （2）0.026 mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 称取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388 g，用少量0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至100 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用1～2 d。 （3）7.5 × 10-4 mol/l NBT溶液 称取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153 g，用少量蒸馏水溶解后，定容至250 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用2～3 d。 （4）含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液 A液：称取EDTA 0.003 g，用少量蒸馏水溶解； B液：称取核黄素0.075 g，用少量蒸馏水溶解； C液：合并A液和B液，定容至100 ml，此溶液即为含0.1 mmol/l EDTA的2 mmol/l 核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好），4℃冰箱中可保存8～10 d，当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液。 （5）含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液50 ml，加入2 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶解后移入100 ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。 2.1.8.2提取及测定方法 （1）称取1.0 g样品叶片于预冷的研钵中，加入4 ml预冷的提取介质（含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液），冰浴研磨匀浆，转入10 ml离心管，并用提取介质定容至

测定各生理指标的试验方法

测定各生理指标的试验方法 1.4.1 电导率的测量(浸泡法)[5] 取大小相当的植物叶片（尽量保证叶片的完整性，少含茎节），用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，将叶片剪成适宜长度的长条（避开主脉），快速称取鲜样，每份0.1g,分别置于10ml去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h,用电导仪测定浸提液电导（R1），然后沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导（R2）。根据公式：相对电导率=R1/R2×100% 算出电导率。 1.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定（氮蓝四唑法）[5] 取各株植物相同部位的叶片（去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使最终体积为5ml。取1.5~2ml于4000r/min 下离心10min，上清液即为SOD粗提取液。取32支试管（30支测定管，2支对照管），分别加入1.5ml0.05mol/l磷酸缓冲液、0.3ml130nmolMet溶液、0.3ml750μmol/l NBT溶液、0.3mol100μmol/l EDTA液、0.3ml20μmol/l核黄素、0.05ml酶液（其中2支对照管以缓冲液代替酶液）、0.25ml蒸馏水，混匀，将一支对照管置于暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时缩短，低时延长）。反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其他各管的吸光度。 计算公式：SOD总活性（U/g)=[(A CK -A E )×V]/(0.5×A CK ×W×Vt) 注：SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示（U/g）；A CK 为照光对照管的 吸光度；A E 为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜质量（g）。 1.4.3 过氧化物酶(POD)活性的测定（愈创木酚法) [5] 酶液提取：取5.0g植物叶片，洗净，剪碎，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000rmp离心10min，上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。分别在各试管中加入0.05mol/l磷酸缓冲液 2.9ml,2%H2O21.0ml，0.05mol/l愈创木酚1.0ml和0.1ml酶液来制备酶活性测定

植物生理生化指标测定

小黑豆相关生理指标测定 1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个重复。 株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测6个重复。 主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。 叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。 2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）和H2O2含量测定 样品处理：取0.5g样品（叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净），速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCl（pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4℃，12000rpm离心15min，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于总蛋白、丙二醛（MDA）、可溶性糖和H2O2含量测定。 总蛋白测定（Bradford法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X代表OD595)，计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空白对照（1ml蒽酮+180ul ddH2O），测定OD625后带入标准曲线：Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625，X代表可溶性糖含量（ug）) 蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O）.注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。 丙二醛（MDA）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA）反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA含量。MDA的计算公式为：MDA（umol/L）=6.45OD532-0.56OD450. 反应体系为：400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品，80℃水浴10min后，测OD532和OD450。对照用Tris-HCl. 0.6%TBA配方：称取硫代巴比妥0.6g，溶于少量1M NaOH中，待其完全溶解后用10%TCA（称取10gTCA三氯乙酸，溶于100ml蒸馏水中，待其溶解即可）定容至100ml。 H2O2测定（二甲酚橙法）：样品反应体系（82ul溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10）+150ul样品提取液），30℃水浴30min，测OD560。标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560，X代表H2O2含量)

常见生理参数的测量范围

常见生理参数的测量范围 三大组成部分传感器：将生理信号转换为电信号。２. 放大器和测量电路：将微弱的电信号放大、转换、调整。 3.数据处理和记录、存储、显示装置。 低频电流对人体的三个作用：产生焦耳热；刺激神经、肌肉等细胞；化学效应。这些作用使组织液中的离子、大分子等粒子振动、运动和取向。 在整体情况下，由感知电流造成的电击称为宏电击（0.7~1.1mA），通常指加于体表引起的电流效应。 由感觉阈以下的电流所造成的电击，成为微电击，通常指电流直接加到心脏产生的电流效应 临床上用双极或单极记录方法在头皮上观察皮层的电位变化，记录到的脑电波称为脑电图EEG。周期：正常值为8~12HZ 脑电图的分类：（1）α波：可在头颅枕部检测到，频率为8~13HZ，振幅为20~100uV，它是节律性脑电波中最明显的波。 （2）β波：在额部和颞部最为明显，频率为18~30HZ，振幅为5~20uV，是一种快波，它的出现意味着大脑比较（3）θ波：频率为4~7HZ，振幅为10~50uV，它是在困倦时，中枢神经系统处于抑制状态时所记录的波形。（4）δ波：在睡眠，深度麻醉，缺氧或大脑有器质性病变是出现，频率是1~3.5HZ，振幅为20~200uV。根据脑电与刺激之间的时间关系，可将电位分为特异性诱发电位和非特异性诱发电位。在临床上一般只进行特异性诱发电位的检查，简称EP。EP是指中枢神经系统在感受外在或内在刺激过程中产生的生物电活动，是代表中枢神经系统在特定功能状态下的生物电活动的变化 临床上常用的诱发电位有：视觉诱发电位VEP，脑干听觉诱发电位BAEP体感诱发电位SEP和事件相关电位ERP。 肌电图记录的是不同机能状态下骨骼肌的电位变化肌肉的生物电活动形成的电位随时间的变化曲线称为肌电图EMG，肌电活动是一种快速的电变化，它的振幅是20uV到几个毫伏，频率为2Hz~10kH 所谓运动电位就是用来表示肌肉基本功能的单位，它是由一个运动神经元和由它所支配的肌纤维构成的，运动单位为肌肉活动的最小单位。 运动神经传导速度是研究神经在传递冲动过程中的生物电活动。利用一定强度和形态的脉冲电刺激神经干，在该神经支配的肌肉上，用同心针电极或皮肤电极记录所诱发的动作电位，然后根据刺激点与记录电极之间的距离，发生肌收缩反应与脉冲刺激后间隔的潜伏时间来推算在该距离内运动神经的传导速度。 临床上血压测量技术可以分为直接法和间接法两种：直接测量: 直接通过传感器在血液中测量,有创。 间接测量: 测量血管壁压力,无创。 常用血压计:1)水银血压计2)无液血压计3)数字式血压计 直接式血压测量心导管术：用心导管从手臂的肘正中贵要静脉、下肢的大隐静脉及颈动脉、股动脉等血管的切口插入血管借助X线透视技术监视导管尖端的位置使其进入待测部位测量血压的微型传感器

植物生理生化指标测定(精)

小黑豆相关生理指标测定 1. 表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重 :取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量,每个测 6个重复。 株高 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度,记录,每个测6个重复。 主根长 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最远点长度,记录,每个测6个重复。 叶面积 :取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面积,叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长, 测叶片最窄处长度作为叶的宽, 叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测 6个重复。 2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量测定 样品处理:取 0.5g 样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净 ,速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4℃, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20℃下,上清液可用于总蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含量测定。 总蛋白测定(Bradford 法 :样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 , 空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准曲线 Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定:样品反应体系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul样品提取液 ; 空白对照 (1ml 蒽酮 +180ul ddH2O , 测定 OD625后带入标准曲线 : Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量(ug

植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定 在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。 Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖 一、原理 糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物鲜样或干样。 （二）试剂 1. 80 ％乙醇。 2. 葡萄糖标准溶液（100 μg/mL ）：准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。 3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。 （三）仪器设备 分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。 三、实验步骤 1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～100 mg ），放入大试管中，加入15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min ，取出冷却，过滤入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。 2. 标准曲线制作取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。 表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量 将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10 min ，取出冷却，在620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。 3 ．样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。

各生理指标的测定方法

各生理指标的测定方法 一、脯氨酸含量的测定 1.茚三酮法 1.1原理 在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。 用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。 1.2步骤 试剂：（1）25%茚三酮：茚三酮------------0.625g 冰乙酸------------15ml 6mol/L磷酸--------10ml 70°C水浴助溶； （2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀释至原体积的2.3倍； （3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸------3g 加蒸馏水至------100ml 实验步骤： （1）称取0.1g样品放入研钵，加5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100°C沸水浴15min； （2）冰上冷却，4000rpm离心10min； （3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀，100°C沸水浴30min，冰上冷却； （4）加4ml甲苯混合均匀，震荡30s，静置30min； （5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。 1.3计算方法 脯氨酸含量（μg/gFW）＝ X * 提取液总量（ml）/ 样品鲜重（g）*测定时提取液用量（ml）*10^6 公式中：X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg） 提取液总量---------------------------5ml 测定时提取液用量---------------------2ml 问题及质疑： 1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。 2.经查看文献资料，反应步骤已经是优化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物，消除了多余未反应的茚三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂质（如色素）以及PH变化

测生理指标的方法

实验路线及安排：项目主要在晋西北地区展开区域化试验，供试品种4个，均为当年生扦插苗,每个品种15株，采用完全随机区组设计进行，其中包 括4个处理，3个重复。所测定内容包括12项生理指标在相应部位(根、茎、叶)的年变化规律，并从形态、生理和生物化学方面对其抗寒抗旱性机理进行 研究探讨。 在每个小区分别选健康植株2株，每株取其中上部位叶片1-2片，组成混 合样，编号,带回实验室用一部分样品进行抗旱指标测定,其余样品放入冰箱低 温处理，处理温度为0℃、-10℃，-20℃，然后进行抗寒指标测定,每月采样 一次。根的取样方法为每个小区分别选健康植株10株，挖出其部分根系组成 混合样,处理方法同叶片；茎的取样方法为选健康植株10株，取其上部嫩茎组 成混合样，处理方法同上。2009年10月-2010年3月对所选材料进行人工 低温干旱处理,完成相关实验指标的测定工作。低温处理通过相对电导率及相 关指标评价其抗寒性；干旱处理是通过对所栽品种进行适宜土壤水分、中度干旱、严重干旱条件的人为处理，测定杨树的蒸腾速率和相应指标，评价其抗旱性。 实验方法 一．光合效率、气孔导度、蒸腾速率三项指标用光合仪直接测定； 二．水势（小液流法） 1.取10个干净的试管，分成A组和B组，都贴上0.05mol/L、0.1 mol/L、 0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L 6个不同浓度标签，并向这两组试管中分别移 取相应浓度的CaCl 2 溶液4mL。 2.取待测叶子数片，用打孔器在其上均匀打孔，混匀，将其分别装入A组试 管（每支试管装10片），摇匀，滴入一滴相同浓度的甲烯蓝溶液，再摇匀。 3.用干净的毛细移液管，吸取1～2滴蓝色溶液，小心的插入装着相同浓度的 B组试管中部，轻轻的挤出一滴蓝色溶液，观察蓝色液滴流动方向。 按下公式计算植物组织水势：Ψ=-iRTC 式中：Ψ为植物组织水势（MPa）；C为CaCl2溶液的摩尔浓度（mol/L）；R为摩尔气体常数，0.008314MPa·L/mol·K；T为热力学温度（K），即273+t(t为当时摄 氏温度)；I解离常数（CaCl 2 =2.6） 三．叶绿素含量（直接浸提法） 80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。 称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。 按下列公式计算样品中叶绿素含量。 C A =12.72A 663 -2.59A 645 (1) C B =22.88A 645 -4.67A 663 (2) C T =C A +C B =A 652 ×1000/34.5 (3)在652nm时可一次测出叶绿素总含量 mg/g FW）=(CV T /FW×1000)n (4) 以上公式中，C A 、C B 、C A+B 分别为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的浓度（mg/L）； FW为鲜重(g)；C：叶绿体色素的浓度；V T 为提取液总体积(mL)；n为稀释倍数。

生长发育生理功能指标的测量讲义.

生长发育生理功能指标的测量 一、测量脉博 测量工具：秒表、带秒针的手表或钟表。 测量方法： 由于脉搏受体力活动和情绪变化的影响较大，因此，应在安静状态下进行测量。 1. 受测者取坐位，右前臂平放在桌面，手心向上。 2. 测量者坐在对面或右侧，用食指、中指和无名指的指端触压受测者手腕部的桡动脉。 3. 测量前要先确定受测者为安静状态。即以10秒钟为单位，连续测量三个10秒钟的脉搏，若其中两次测量值相同并与另一次相差不超过一次时，即可认为受测者处于相对安静状态；否则应适当休息，直至符合要求。 4. 测1分钟的脉搏数。记录以次/分为单位。 注意事项： 1. 测量前1～2小时内，受测者不要进行剧烈的身体活动。 2. 测量前，受测者要静坐10分钟以上，互相不要打闹，保持情绪安定。 3. 触诊时，应特别注意脉搏的频率和节律与心跳的一致性。 二、测量血压 测量工具：台式水银血压计、听诊器，电子血压计（分臂式和腕式两种）。 测量方法： 由于血压受活动、体位变动、情绪等因素的影响较大，因此，在进行测量时应在安静状态下进行，通常用台式水银血压计测量右臂血压。 1. 校验 （1）打开血压计之后，扳开水银阀门，看看水银柱是否处于“0”刻度，如果不是，则应当进行校准，否则会影响测出的数值。还要观察水银柱有无气泡，如有气泡应予以排除。 （2）将球囊的开关关闭，一手压住袖带，另一手捏球囊向袖带内充气，看看水银柱是否会随

之升高，或者是否有水银中断的现象。如果不能上升或是有裂隙，就说明该血压计有漏气的情况，或者是水银量有所减少，这样的血压计就不能再用来测量了。 2. 测量 （1）受测者取坐位，右臂自然前伸，平放在桌面，掌心向上，使上臂与血压计、心脏基本处于同一水平。 （2）测量者将袖带内的空气排尽后，平整地缠在受测者的上臂，袖带下缘距肘窝2～3厘米，松紧适度，以能伸进两个手指为宜。 （3）在肘窝内侧摸到肱动脉跳动后，将听诊器的探头放在肱动脉上，使其与皮肤密切接触。切不可贪图方便省事而将其塞到袖带里面，这样会使测出的血压值比实际要高。 （4）戴好听诊器，关闭球囊开关，打气入带，使水银柱上升至肱动脉的搏动音消失，接着再往里充气，使水银柱继续上升20～30毫米汞柱。双眼保持与水银柱刻度平视。 （5）打开球囊开关，使水银柱缓缓下降，同时仔细听诊，当听到第一次脉跳声时，水银柱所指刻度便是收缩压；继续边放气边听，当声音突然变弱或消失时，水银柱所指刻度就是舒张压。 （6）放松球囊阀门，使水银柱回到零位。2分钟后，进行重测，取2次测量的平均值。记录以毫米汞柱（mmHg）为单位。如果2次测量的收缩压或舒张压读数相差>5mmHg，则相隔2分钟后再次测量，然后取3次读数的平均值。 3. 整理 测量结束后，取下袖带，挤压排尽空气，关闭球囊的开关，折叠好之后放入盒子里。一定不要忘记将血压计的盒盖向右倾斜45度，使水银完全回流槽内，再关闭水银槽的开关，阖上盒盖。如果不将水银回流，就会导致下一次使用时水银柱出现断裂，水银的挥发也会变得很快。 注意事项： 1. 测前1～2小时内，受测者不要进行剧烈的活动。 2. 测前让受测者静坐10～15分钟，稳定情绪，接受测试。 3. 测试前应检查和校正血压计的水银柱。 4. 必须选择宽度合适的袖带，以覆盖受测者上臂长的1/2～2/3为宜。袖带过宽测出血压偏低，过窄则偏高。7岁以下儿童常用8cm宽的袖带。 5. 测量时受测者需裸露手臂或只穿贴身薄衣。袖口太紧或衣服太多会导致血压值偏高。 三、测量肺活量 测量工具：浮筒式（湿式）肺活量计，电子肺活量仪。

植物生理学实验指导

植物生理学实验指导主编胡君艳陈国娟张汝民 浙江农林大学植物学科 2013年8月

实验一植物组织水势的测定 水势与渗透势的测定方法可分为3大类：⑴液相平衡法，包括小液流法、重量法测水势，质壁分离法测渗透势；⑵压力平衡法（压力室法测水势）；⑶气相平衡法，包括热电偶湿度计法、露点法等。 Ⅰ小液流法 【实验目的】 了解采用小液流法测定植物组织水势的方法。 【实验原理】 水势表示水分的化学势，像电流由高电位处流向低电位处一样，水从水势高处流向低处。植物体细胞之间，组织之间以及植物体和环境间的水分移动方向都由水势差决定。 当植物细胞或组织放在外界溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，所以外部溶液浓度不变，而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度变化，然后根据公式计算渗透势。 【实验器材与试剂】 1.实验材料：八角金盘、大叶黄杨等。 2.实验试剂：0.05、0.10、0.15、0.20、0.30mol·L-1蔗糖溶液、甲烯蓝溶液。 3.实验仪器：试管10支、微量注射器、镊子、打孔器、垫板。 【实验步骤】 1.取干燥洁净的试管5支为甲组，标记1~5，各支中分别加入0.05~0.30mol·L-1蔗糖溶液5mL。另取5支干燥洁净的试管为乙组，标记1'~5'，各试管中分别加入0.05~0.30mol·L-1蔗糖溶液2ml。 2.取待测样品的功能叶数片，用打孔器打取小圆片约50片（避开叶脉），混合均匀。用镊子分别夹入10个小圆片到乙组试管中。并使叶圆片全部浸没于溶液中。放置约30~60min，为加速水分平衡，应经常摇动试管。 3.到时间后，在乙组试管中加入甲烯蓝溶液1~2滴，并用微量注射器取各试管糖液少许，将注射器插入对应浓度甲组试管溶液中部，小心地放出一滴蓝色溶液，并观察蓝色小液流的

生理指标测定

生理指标测定_16种 1、冻害指数——3~5株观察形态 【４种常绿水生鸢尾抗寒性的初步研究】张京，2012 李刚，姜卫兵，翁忙玲，等．木兰科６种常绿树幼苗抗寒性的初步研究［Ｊ］．园艺学报，２００７，３４（３）：７８３－７８６． 描述叶色变化： 在最冷月( 2月中旬) , 所有供试树种均有不同程度的冻害表现, 乐东拟单性木兰受冻害最轻,只有部分植株的少量叶片有些许水渍状, 大部分植株完好无损, 冻害指数为041, 基本不受冻害;阔瓣含笑也长势良好, 有少部分叶片出现褐色水渍状, 冻害指数为14, 受轻度冻害; 金叶含笑受到了中度水平的冻害, 部分植株的叶片整个叶面呈现红褐色水渍状, 冻害指数为25; 红花木莲、醉香含笑和观光木受到了重度冻害, 大多数植株的部分叶片呈焦黄、褐色脱落, 有的整个植株呈萎蔫状,长势非常差, 冻害指数分别为3.2、3.9、4.3. 2、相对含水量 叶片相对含水量采用饱和称重法［21］测定。选取各处理部位一致、成熟完好的叶片迅速称其鲜重，再用蒸馏水浸泡8~24 h，使组织吸水达到饱和状态，取出后吸去表面水后立即称其饱和重，然后在105 ℃下杀青30min，在80 ℃下烘干至恒重（1h~24h），放在干燥器中冷却，称其烘干重。根据公式计算:LRWC( %) = [ (鲜重－干重) /(饱和重－干重) ] × 100%

3、光合参数（光合仪测定） 光合速率、CO2浓度、光合有效辐射、叶绿素 或用95%乙醇浸泡法，浸泡4~5d，测定叶绿素。《植物生理生化实验原理和技术》 4、膜质过氧化：相对电导率（略）、MDA MDA（丙二醛）的测定 试剂：三氯乙酸10% （TCA 溶液）：称取100g溶于1L 蒸馏水中； 0.6％硫代巴比妥酸溶液（6%TBA）：1.8g溶于300ml TCA 溶液中（加热溶解） 称取植物叶片0.3克, 先加入2ml TCA和少量石英砂研磨至匀浆，再加入4ml 10%三氯乙酸(TCA)进一步研磨（总体积为6ml），然后以4000g离心10min, 取上清液待测。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0.6% TBA，混匀物于沸水浴上反应15分钟，迅速冷却后再离心(在冰箱中冷却较快)。取上清液测定在532，600和450nm波长下比色。 公式C MDA (nmol L-1)＝[(A532－A600)-0.0571×(A450-A600)]/0.155计算MDA量（排除多糖干扰），用每克干（鲜）重中MDA的量表示MDA的含量，单位μmol g-1干（鲜）重或nmol g-1干（鲜）重。 1、含量计算 双组分光光度计法：已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm波长下的比吸系数分别为 85.40,7.40；MDA与 TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收，其吸收系数为0，532nm下比吸 收系数为155，根据双组分光光度计法建立方程组，计算公式如下： C 1（mmol/L）=11.71 D 450 C 2 =[6.45(D 532 —D 600 ) — 0.56 D 450 ]X提取液总体积/测定时用的提 取液体积*样品鲜重 C 1:可溶性糖的浓度, C 2 为MDA的浓度, D 450 D 532 D 600 分别代表450,532,600nm下的消光度值. 参：Brege J G.Microsomal lipid peroxiodation. Methods in Ezymmology.1978,52:302-306 J.G. Buege and S.D. Aust, Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol.52(1978), pp. 302–306. 注: 沸水浴时,可使用小试管,然后上部用保鲜膜包扎.(如橡皮筋) 附4.1 MDA、可溶糖含量—硫代巴比妥酸加热显色法 【原理】植物遭遇逆境胁迫或衰老过程中，由于自由基、活性氧的积累引起膜脂过氧化，产生脂质自由基，进一步诱发膜脂连续过氧化并导致蛋白质交联变性，而引起细胞损伤或死亡。MDA 是膜脂过氧化的最终产物，通过其含量的测定可了解膜脂氧化伤害的程度，比较不同植物抗逆性的差异。 在酸性和高温条件下，MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红棕色的产物三甲川（3，5，5-三甲基恶唑2，4-二酮）。该产物在532nm处有最大吸收峰，测定反应产物在532nm处的光密度值，可计算出MDA含量。但植物组织中的可溶性糖亦与TBA产生颜色反应，其产物对532nm 光的吸收干扰测定。采用双组分光光度法及其计算式，可排除干扰，计算出MDA的含量。 【器材】分光光度计离心机水浴锅研钵剪刀试管

(完整版)逆境生理指标的测定

逆境生理指标的测定 要求：选三个指标 一、植物组织中超氧物歧化酶活性的测定 催化下列反应： 2 +2H + → H 2O 2 + O 2 反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。 原理 本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 ， 可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除 从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计 算出酶活性大小。 试剂 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml ； 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存； 100μmol/L EDTA-Na 2溶液：取0.03721g EDTA -Na 2用磷酸缓冲液定容至100ml ； 20μmol/L 核黄素溶液：取0.00753g 核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml 避光保存(当天配制)。 方法 1、酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加1ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml 。取2~3ml 于10000rpm 下离心10分钟，上清液即为SOD 粗提液。 2、显色反应 取5ml 试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。 混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx 日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。 表1 各溶液加入量 3、蛋白浓度的计算 蛋白浓度＝ W a ? 单位：mg 蛋白/g 样重 c －通过标准曲线查得的每管中蛋白含量（mg ） v －样液总体积（ml ） a －测定时提取液体积用量（ml ） W －样重（g ） O 2●O 2●O 2●O 2●O 2●

植物生理测定方法

1 叶圆片放氧活性的测定 原理：同光合速率一样，叶片光合放氧速率是反应光合能力的一项重要指标，其大小本质上取决于PSII活性的大小。 称取2～3 cm2 叶片约0.2g，用打孔器2-3 mm2的小圆片后放入含有200mmol Trincine-NaOH，100 mmol NaHCO3，pH7.0 的缓冲液中，并用注射器抽真空1min 左右，使缓冲液充分渗入到叶肉细胞里，最后将叶圆片连同缓冲液转移至极谱氧电极(Hansatech，英国)的反应杯里测定放氧活性，测定在20℃及800μmol.m-2.s-1光强下进行，每个样品测定3个重复。 2 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（RuBPCase）活性测定 原理：Rubiscase是光合作用中最重要的关键酶，它既催化RuBP羧化反应，又催化RuBP加氧反应，对植物的光合作用具有重要的调控作用。 参照李合生等[57]的方法，称取0.5g叶片加入匀浆液6ml（100mmol/L Tris-HCl 缓冲液pH7.8，10 mmol/L MgCl2，1.0 mmol/L EDTA，20 mmol/L 2-巯基乙醇，2%聚乙烯吡咯烷酮）冰浴研磨匀浆，14000g、4℃离心20min，上清液作酶液活性分析。反应液总体积为200μL，内含反应介质100mmol/L Tris- HCI 缓冲液(pH7.8)、0.4mmol/L EDTA、12 mmol/L MgCl2）93.3μL、50 mmol/L ATP、50mmol/L 磷酸肌酸，200mmol/L NaHCO3各13.3μL，160 u/ml 磷酸肌酸激酶，160 u/ml 磷酸甘油酸激酶，160 u/ml 磷酸甘油醛脱氢酶各6.7μL，5mM/L NADH，蒸馏水各13.3μL，RuBPCase提取液6.7μL 30℃恒温水浴10 min, 最后加入9 mmol/L RuBP 6.7μL反应开始，用Theymo1500型酶标仪96孔板测定340 nm下光吸收的变化。以ΔA340·min-1下降0.01为l U，每个样品测定3个重复。

人体生理指标大全

人体生理指标大全 温度用腋下测量正常是36－37摄氏度 心率正常是60－100次/分钟 血压正常不高于140/90mmHg，不低于90/60mmHg 血液 总血量: 65--90ml/kg, 全血比重：男1.054--1.062 女1.048--1.062 血浆：1.024--1.029 渗透(量)压 血胶体渗透压：21±3mmHg(2.80±0.40kPa) 血晶体渗透压：280--310mOsn/kg(280--310mmol/L) 红细胞数: 男(4.0--5.5)×10^12/L(4.0--5.5×10^6/ul) 女(3.5--5.0)×10^12/L(3.5--5.5×10^6/ul) 血红蛋白: 男120--160g/L(12--16g/dl)女110--150g/L(11--15g/dl) 红细胞压积: 男0.4--0.5(40--50vo%) 女0.37--0.48(37--48vol%) 红细胞平均直径: 7.33±0.29um 红细胞平均血红蛋白(H): 29.36±3.43pg(29.36±3.43uug) 红细胞平均体积(V): 93.28±9.80fl(93.28±9.80um^3) 红细胞平胞血红蛋白浓度(HC): 0.31--0.35(31--35%) 网织红细胞数: 0.005--0.015(0.5--1.5%)

红细胞平均渗透性脆性试验: 在0.44--0.47%(平均0.45%)盐液内开始溶解，在0.31--0.34(平均0.32%)盐液内全部溶解。 白细胞数: (4--10)×10^9/L(4000--10000/ul) 白细胞分类计数 中性粒细胞：0.5--0.7(50--70%) 嗜酸粒细胞：0.005--0.03(0.5--3%) 嗜碱粒细胞：0.00--0.0075(0--0.75%) 淋巴细胞：0.2--0.4(20--40%) 单核细胞：0.01--0.08(1--8%) 嗜酸粒细胞直接计数: (0.05--0.30)×10^9/L(50--300/ul) 血小板数：(100--300)×10^9/l(10--30万/ul) 出血时间:(Duke法)1--3min(lvy法)0.5--6min 凝血时间: (毛细管法)3--7min (玻片法)2--8min (试管法)4--12min 凝血酶原时间: 凝血酶原消耗时间>20sec为消耗正常 血块收缩时间: 30--60min开始回缩，18h后明显收缩，24h已完全收缩 部分凝血活酶时间: 35--45sec 凝血酶时间: 13--17sec 复钙时间: 1.5--3min 凝血活酶生成试验: 正常值在4--6min内，基质血浆凝固时间为9--11sec。病人标本

植物生理指标

植物生理指标 1、植物酶液提取： 1)PVPP(固体,PVP单体与金属元素结合) 酚类吸附剂，酚的羟基与蛋白质 的羰基形成氢键，醌导致蛋白质聚合。或polyclarAT（Polyclar-AT is insoluble PVP, also called as PVPP (PolyVinyl PolyPyrrolidine). It binds phenols etc more efficiently than PVP and is easily removable by filtration or a low speed spin）去除酚的毒害防止醌 颜色干扰。PVP的肽键中的氧与酚羟基上的质子牢固结合，防止酚与酶 中肽键结合，保护了酶。 2)母液制备：0.1mol/L二硫苏糖醇DTT: 100mg至微量离心管，+650ul 水 0.5mo/L EDTA : 93gEDTANa,10g NaOH,定容到500ml 10mg/ml BSA：100mgBSA于9.5ml 水中 2、可溶性总糖测定（蒽酮比色法） （1）原理：糖+硫酸—糠醛，其与蒽酮形成绿色络合物，620nm下显色。本实验采用浓硫酸，倒入水中产生大量热，促进反应发生。 （2）标准曲线绘制：取略大于0.01g的葡萄糖，105度烘干至恒重，取0.01g 定容至100ml，配成100ug/ml的溶液。取200mg蒽酮，溶于100ml 浓硫酸，冷却，保存于棕色瓶。（注意：不需定容，量取100ml硫酸倒入烧杯即可，定容混匀时产气热溅出。注意硫酸中是否存在杂质。蒽酮非常敏感，不能用勺等挖取，只能直接倒，否则就会污染。溶液配后呈亮黄色，放置 620nm. 实验结果：实际上并不理想，因abs均偏低，可试将标糖浓度适当升高。 葡萄糖含量ug 20 40 60 80 100 abs 0.09 0.169 0.259 0.332 0.427