色谱柱的使用和维护

一.安装、启用和维护中重点注意事项

色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。

1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配

色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。

2. 溶剂的匹配转换

色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。

3. 新柱使用前的平衡和老化

厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语，目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流路中的吸附饱和。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，因扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。

4. pH使用范围

一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8，这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同，对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大

一些，如月旭公司的Ultimate XB-C18色谱柱，选用的是高品质硅胶，加上高密度键合和双封尾，使pH耐受范围最大提高到10。磷酸盐缓冲盐渗透力强，有加快硅胶溶解的副作用，它的存在会降低pH使用范围。有机杂化硅胶以及硅胶表面涂覆杂化层的硅胶填料，有机质的存在使pH使用范围能到12以上，月旭公司的Xtimate系列产品即属此类。

5. 色谱柱保存

短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流动相（不含缓冲盐）保存为佳，以尽量减少下次使用的平衡时间。一般只建议在长期保存反相柱的时候用纯甲醇或乙腈，一方面纯有机相保存有最大限度减少键合相水解的作用，但纯甲醇（乙腈）又会将已水解而暂时吸附在柱内的键合相洗脱出去，使固定相流失进程加快，寿命缩短。纯有机相保存还有易挥发使柱床变干的缺点，使用80%左右有机相保存也属好的选择，且足以避免长菌。强烈建议在柱身上贴标签标明保存溶剂。

CN基柱在有机极性溶剂中柱床不稳定（会导致柱床结构坍塌），适合在水相中低温保存。低温保存要确保不发生固定相冻结而损坏柱床。离子交换柱和水性SEC柱等适合保存在水溶液中的色谱柱，可加0.05%叠氮化钠溶液防止长菌。

正相柱，无论是短期还是长期，都推荐保存在所用流动相中

二、柱压问题

）以及容量因子k'相关，和柱压无关。但柱压（P）仍不失为 上面是基本色谱分离方程式，分离度R和柱效（N）、选择因子（HPLC 方法中的最重要参数之一，因为柱压反映了色谱柱的内部状况。现今能承受400 bar压力的HPLC泵很常见，色谱柱如在远低于上限的压力下正常运行，不需要我们重点关注；当柱压升高接近上限或者柱压有异常升高，往往意味着色谱柱出状况了，需及时进行维护和补救，严重时色谱柱就已报废了。本节将详细考察柱压问题并提出可行的解决方案。

柱压方程

对填充色谱柱，柱压与黏度(η)、柱长(L)和流速(F)成正比，与填料粒径（d p）以及柱管半径（r）的平方成反比。K0是比渗透性

系数，对填充床，其值约为0.001。通过此公式可近似计算出给定色谱条件下的理论柱压。只有当新柱实际测得的柱压和理论柱压相差很大，才能说柱压存在问题。

黏度(η)取决于流动相溶剂的选择，为降低柱压，反相色谱中倾向于选择低黏度的乙腈，而不是高黏度的异丙醇。当然选择时还需考虑溶剂强度、极性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。柱长（L）增加可以提高分离度（R），流速（F）提高能加快分离，但都会导致柱压上升，选择确定这些运行参数时，需综合平衡和折中。

填料粒径对柱压影响极大，d p降低一倍，柱压将增加4倍。UHPLC中采用的sub-2 μm填料，柱压超过普通HPLC泵的400Bar 上限很多。提高柱温因可降低黏度η，相应降低柱压。在梯度洗脱时，黏度随流动相组成的变化而改变，柱压也会处在不断变化中。对水/甲醇流动相体系，在55：45时，黏度和柱压有个极大值。

内径的影响同样很大，根据线流速相同柱压相同的原则，4.6mm 内径的色谱柱流速为1ml/min，约相当于在2.1mm内径色谱柱上的0.2ml/min流速，在10mm半制备色谱柱上的5ml/min，计算公式为v＝1.0ml/min x（内径r/4.6）2。所以在换不同内径色谱柱时，请及时调整流速，以免因高柱压损伤色谱系统。

柱压下降是仪器系统的连接有泄漏，柱压不稳定一般认为是流路中有

气泡或空穴，和色谱柱相关的柱压问题是柱压上升。

色谱柱结构:

和柱压相关最大的是进口端筛板（inlet frit）以及其后面1-2cm长度的柱头填料。筛板上有比填料粒径小的小孔，筛板上的小孔或柱头填料的间隙被部分堵塞，是柱压上升的主要原因。有以下几类情况：

1. 填料破碎和使用后有填料粉末生成

填料破碎一般在装柱过程中发生，装柱压力过大或所选硅胶机械强度过低所至，设定柱压出厂标准可解决；流动相中高pH值缓冲盐使硅胶溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端筛板，这种情况下反冲不起

作用，只有更换后筛板，不过打开承压的后筛板，对柱床会有不好影响。

2. 颗粒物堵塞引起柱压上升和对策

可能堵塞进口端筛板（前筛板）和柱头填料间隙的颗粒物来源有：样品（制样时灰尘和滤纸等带入）、进样阀密封圈磨损、流动相（溶剂本身含有和配制过程进入）、液相仪器中泵阀密封圈的磨损、缓冲盐析出（一般在梯度运行和进样时盐的溶剂环境改变导致）。

水和缓冲盐流动相内生长的细菌，也是颗粒物来源的一种，可堵塞筛板和填料间隙。应避免将这类流动相在室温下久放，可放入冰箱存放。

1) 预防措施

样品（甚至标准品）和流动相过滤，既预防了筛板、柱头和毛细管堵塞，又能减少进样阀、活塞杆和截止阀等仪器关键部件的磨损。普通用0.45um孔径滤膜过滤样品和流动相，对使用2um以下填料的超高压柱的，可用0.20um滤膜。滤膜材质有再生纤维素、聚四氟乙烯、尼龙、硝酸纤维和醋酸纤维等，须根据和样品溶剂及分析物的适应性慎重选择。

使用保护柱或在线过滤器，具体安装位置见下图：

在线过滤器内装有可更换的滤片，滤片孔径一般有2um和0.5um两种。安装位置有两个可选择，在进样器和色谱柱之间时，对样品和流动相中的颗粒物都有效；在泵和进样器之间，则只对流动相有过滤作用。

保护柱是缩小版的色谱柱，内含带填料的可更换的柱芯，安装在进样阀和色谱柱之间，用于防止色谱柱的化学污染为主，也有过滤颗粒物的作用。

2) 故障排除

反冲色谱柱：不连接检测器，直接将堵在前筛板上的颗粒物冲出排到废液瓶中。开始时反冲压力可低于正常使用压力，待颗粒物有冲出后，逐步提高冲洗压力。有时颗粒物已非常牢固嵌入到筛板内部，反冲不一定凑效，早反冲、勤反冲相对效果更好。有的厂商为避免堵塞，使用了较大孔径（2-5um）的前筛板，这种情况反冲会将填料冲出。

换筛板：一般不建议这样做，因为换筛板会带走粘在筛板上的部分填料，使柱床的均一性受影响，导致柱效下降。不过如果反冲不能解决

问题，也只能不得已而为之，要不然就要把色谱柱报废了。

如果系统中不接色谱柱，柱压仍然高，说明泵出口到色谱柱之间的其它部位，包括进样器、在线过滤器和保护柱等有堵塞，可逐一排查。为了减少死体积，毛细管都做得尽可能的细，也可能被堵。

3. 化学污染物引起柱压上升和对策

来源同样是样品、流动相和系统，不过来源于样品的污染最普遍，特别是对复杂基体样品未经前处理或前处理不够的时候。化学污染物主要有：分子量很大的化合物、盐类、脂质、蜡类、油脂、腐殖酸、蛋白质等其它生物来源的物质。

像盐类这样的保留能力极小的污染物会在死体积处很快从柱中洗脱出去，检测器一般对此类物质响应不大，有时表现为干扰峰、基线波动、斑点甚至负峰。

保留能力中等的污染物，会被慢慢洗出色谱柱，表现为宽峰、基线馒头形波动和基线缓慢漂移。

对强保留的污染物，一般流动相强度不足以将其从柱中洗出，会逐步在柱头累积。有时，累积在柱头的污染物可作为新固定相对分析物起作用，引起保留时间改变、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱头累积到一定程度，如果不采取措施，会堵塞填料间隙，引起柱压上升。最好的办法是选用合适的溶剂冲洗溶解这些物质，同时又不对填料本身有损害。如聚合物柱中累积的蛋白类污染物可用pH13-14的强碱溶液洗掉，但这种方法不适合硅胶基质色谱柱。

1）预防措施：

a．制样时采用SPE固相萃取等方法，预先将色谱柱杀手类的污染物质清除掉；

b．连接保护柱。保护柱是分析柱的延伸，在填料类型和粒径上应于分析柱一致，才能最大限度起保护作用，又不影响色谱性能。一个设计和装填良好的保护柱，还可增加分析柱的分离效率。如果因某种原因需在保护柱中用不同的填料，也应选择比其所保护的分析柱保留能力弱的固定相，这时的保护柱完全用于截住强保留物质，类似于SPE 小柱的功效。当保护柱柱芯保护功能用尽时，也不能说不可再清洗后复用，但价格低不值得去花这个时间。

c．经常对分析柱进行冲洗维护：

2)故障排除：

已经累积很多污染物，用甲醇或乙腈简单冲洗不奏效，推荐使用下面方法清洗反相柱

100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％异丙醇---100％异丙醇

---100％二氯甲烷---100％正己烷

用每种溶剂冲洗至少10个柱体积，对于250mm×4.6mm的分析柱，合适的冲洗流速是1～2ml/min。最后用10柱体积的异丙醇过渡，然后回到原来的流动相体系。

对受蛋白类污染的硅胶基质反相柱，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白质。由有机溶剂、缓冲液和酸,有时还加上离子对试剂等组成的配方清洗效果极佳，譬如用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液对柱子重复进行梯度洗来再生；Bhadwaj和Day试验了在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇，再生效果良好。

清洗硅胶、CN和Diol等正相柱建议方法：先用20柱体积50：50正己烷/氯仿冲洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯冲洗。对油脂类物质，可用异丙醇清洗

三、峰形问题

峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的准确性。引起峰形异常的因素很多，柱外死体积引起峰形异常有个特点：对先出的峰影响大，对后出峰影响小；柱头塌陷、柱头和筛板污染会引起所有的峰形都异常，而硅醇基次级保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也会造成峰拖尾。色谱实践中，大部分的峰形问题都不是色谱柱的问题，仪器参数设定、色谱条件和方法正确与否对峰形有很大影响。

1. 峰后拖

常见的3种拖尾情况：

次级保留引起峰拖尾的机理解析：

反相色谱中，通常非极性和弱极性的化合物能获得良好的峰形，而带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性基团的化合物则比较容易产生拖尾，原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。

反相填料表面有残余的硅羟基，具有一定的酸性，其pKa约为4.5～4.7。根据电离规律，流动相的pH－pKa>2即pH>6.7时，99％以上的硅羟基应该是呈离子状态的，即Si－O－，而pKa－pH>2即pH<2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99％以上的硅羟基应该是呈分子状态的，即Si－OH，但其极性仍然存在，即Si－Oδ－Hδ＋。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多。同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生强的静电作用而被推迟洗脱出来，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。

上图是填料表面的示意图，完全硅羟化的硅胶表面硅羟基浓度为8μmol/m2，由于空间位阻的作用，通常与C18硅烷基发生反应的仅达2～3.5μmol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羟基反应，如图中的三甲基氯硅烷，使硅羟基中的氢变成了三甲基硅烷的一个惰性基团。三甲基硅烷还是比氢原子大得多，还是不能将所有的残余硅羟基的活性封闭掉。

相同的样品在不同品牌的柱子上产生拖尾的严重性不同，从填料合成的角度而言就是键合密度是否高、封尾是否彻底，高密键合和彻底的封尾能显著减少这种机会，获得良好的峰形。Welch公司Ulimate 品牌的XB－C18、AQ－C18和Xtimate C18采取的就是高密键合和彻底的双峰尾工艺。

解决方案：

1）先检查样品是否过载，由于样品过载引起的峰形后拖不能通过改变色谱条件消除。如果发现过载，需降低进样量（包括进样体积或浓度），进样量越小，峰形越好，例子如头孢尼西钠的测定：

2）调节流动相pH

将流动相的pH调至比弱酸pKa小2以上，比弱碱pKa大2以上，可有效抑制易离子化待测物的电离，从而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的测定：

碱性化合物中，甲胺的pKa为10.64，那么在pH< 8.64的时候它是完全呈离子态的，那么pH在2.5~8.64时，特别是pH6.7～8.64时，此时甲胺和硅羟基均以离子状态－NH3＋和Si－O－形式存在的，它们之间相互吸引的静电作用导致后拖，这就是为什么很多碱性化合物在pH 7.0的条件下容易产生拖尾的原因。而很多色谱柱生产商也因此以阿米替林（含－N(CH3)2，碱性比－NH2强）在pH 7.0的条件下来评价和比较不同色谱柱之间的优劣，该条件下的阿米替林的峰形越好说明封尾越好。而在pH<2.5的条件下，也仍然后拖，是因为－NH3＋足够强，即使硅羟基以分子状态存在也仍能够与Si－Oδ－Hδ＋中氧原子产生吸引作用，导致峰形拖尾。当pH>12.64，大于pKa2以上时，甲胺完全以分子状态形式存在，不会引起拖尾。

3）增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度：

流动相中加入缓冲盐，增强了流动相的离子强度，在－NH3＋等极性基团和硅羟基Si－O－之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与硅羟基之间相互接触的机会，有助于削弱极性基团与硅羟基之间的相互作用，改善峰形。这种适合于碱性较弱（如氨基的N原子与强吸电子基相连），或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以接近被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基，例子如高乌甲素的测定：

4）加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等

拖尾的产生是因为－NH2、－NHR、－NR2与硅羟基发生静电作用引起的，那么阻碍它们之间静电作用的途径，应该有两种，一种是占据硅羟基这个作用位点，另一种是占据－NH2、－NHR、－NR2这个作用位点。

在流动相中加入三乙胺，能显著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羟基。三乙胺的pKa为11.09，在pH<11.09－2＝9.09的条件下是以离子状态N＋H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64 硅羟基呈Si－O－离子态的情况下，N＋H(CH2CH3)3容易与Si－O－形成相对较强的静电吸引力。

加入三乙胺改善峰形的时候，有两点需要注意：1）三乙胺的碱性很强，加入三乙胺后流动相的pH可能超出色谱柱的使用范围，对色谱柱造成损伤。pH的改变也会导致出峰时间的显著变化，可能引起的其它问题，建议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前的pH值。通常即使pH回调过后，由于三乙胺成为了固定相的一部分，保留时间也有较大变化；2）三乙胺在210nm处有比较强的吸收，如果液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。

四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N＋H(CH2CH3)3的结构N ＋(CH2CH2CH2CH3)4 ，这种结构也能有效的与Si－O－产生较强的静电作用，阻止氨基与硅羟基的接触，改善峰形。而且它还有一个不同于三乙胺的显著特点是，它在低波长范围的吸收比三乙胺弱。

流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好的改

善峰形，其作用机理与三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不同，是通过与样品分子的作用来阻止样品分子与硅羟基的作用来改善峰形。

2．峰前延

峰前延发生的概率比较小，下面是三种前拖峰的表现形式：

造成前延峰的原因有多种，我们可依次逐一排查：

1）样品是否过载

降低进样浓度，看峰形是否有所改善。一般认为峰高在100mAU 左右比较合适，不至于因过载影响峰形。

2) 检查是否是用流动相溶解样品

溶解样品的溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相强会发生峰前延。具体机理是：

正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，

浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布。样品溶液进样后到达色谱柱时间很短，应还未被流动相充分稀释，洗脱能力更强的样品溶剂的局部存在，将使部分样品被洗脱的速度加快，导致峰前延。

3）增加流动相中缓冲盐的浓度

增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前延。例如：注射用苦参碱的测定

4）流动相中加入适量的四氢呋喃

往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道和使用，但其机理似乎少人提及。通常所加入

的量在5％以内即可，需要的时候可以加入更大的量。例子如下：

阿莫西林胶囊的测定

色谱柱：Ultimate AQ－C18，5um，4.6×250mm；

检测波长：254nm；温度：室温28度；

流速：1.0ml/min；进样量：20ul；

液相色谱柱的选择

液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合 -CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸

色谱柱的维护及注意事项

色谱柱的维护 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。 硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡 如何平衡色谱柱？ 平衡过程中，将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡） 色谱柱的再生进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。 表1 建议用来冲洗的溶剂体积 色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积 125-4 1.6ml 30ml 250-4 3.2ml 60ml 250-10 -20ml 400ml 请根据下表选择您的再生方法： 极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生： 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：

高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法_徐红

高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法The Choicing W ays of Chromatographic Colum n and Mobil Phase about HPLC 徐　红　侯　健 (新疆昌吉州产品质量检验所,新疆昌吉831100) 摘　要:高效液相色谱仪的核心是色谱柱。另外,流动相对改善分离效果也有重要的辅助效应。色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。现代高效液相色谱填料多使用键合固定相。色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。 关键词:高效液相色谱;色谱柱;填料;流动相;溶剂 色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。这些填料装成的色谱柱既要有好的选择性,又要有高的柱效。要提高柱效是现代高效液相色谱的又一重要问题。所以填料和装柱技术是关键问题。 现代高效液相色谱填料多使用键合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效。高效液相色谱填料的基质有以下几种:(1)全多孔硅胶。现代高效液相色谱填料绝大多数用键合的方法把活性基团接枝到基质上,全多孔硅胶是使用最为普遍的基质。全多孔硅胶的孔径有三种类型:①微孔全多孔硅胶,孔径<2nm;(2)中孔全多孔硅胶,孔径<50nm,>2nm;(3)大孔全多孔硅胶,孔径>50nm。高效液相色谱填料使用中孔和大孔全多孔硅胶,在分离低分子量的混合物时,选择(6～15)nm孔径的全多孔硅胶,其比表面相当于(500～200)m2/g。在分离合成聚合物或生物大分子时,要使用(15～100)nm的全多孔硅胶。如果使用<2nm的全多孔硅胶,色谱峰就会拖尾。(2)其他金属氧化物基质。由于硅胶有一些缺点:在碱性介质中(pH>8)不稳定;在孔隙中大分子扩散困难,降低柱效;硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。为此近年来用氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛作为高效液相色谱填料的基质有很大的H PLC应用前景。高效液相色谱固定相有以下几种:(1)硅胶表面键合或涂渍各种聚合物。(2)其他氧化物表面上涂渍聚合物。(3)无孔单分散填料。(4)有机高聚填料。(5)灌注色谱填料。(6)手性固定相填料。 色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。如果色谱柱填充不好,如填料颗粒之间不均匀、不密实,就会使涡流扩散项增加,导致柱效下降。高效液相色谱柱的性能主要决定于固定相填料,但是色谱柱的填充好坏也有很大的影响。填充色谱柱的方法有干法和湿法两种,一般大颗粒的(如外径>20nm)可以用干法填充;一般小粒径的填料宜用湿法填充。湿法填充也称作匀浆法,即用密度和填料相近的液体或混合液作分散介质,用超声波处理此浆液,然后用高压泵快速压入色谱柱管中,这样就可以制备出高效的色谱柱。 在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。在选择流动相溶剂时,首先要考虑的是溶剂的物理性质,其次要考虑溶剂对所要分离样品的容量因子,最后是所使用的溶剂要有分离能力。用作高效液相色谱流动相溶剂,首先要满足以下几点要求:(1)容易得到;(2)适合于所用的检测器;(3)纯净、有一定的惰性;(4)无毒、使用安全;(5)对所分离的样品有一定的溶解性能。 下面介绍选择流动相的要点: (1)首先要考虑溶剂对检测器的适应性。 高效液相色谱在多数情况下要使用紫外检测器,所以必须考虑所用溶剂在紫外波段的吸收。如使用示差折光检测器,要考虑溶剂的折光率。 (2)溶剂的活性 有许多溶剂可能与样品发生反应,或在某些固定相的存在下产生聚合,他们就不能作为流动相使用。 (3)溶剂的沸点和粘度 溶剂的沸点和粘度密切相关,低沸点的溶剂通常其粘度也低。通常选用沸点高于柱温(20～50)℃、粘度不大于5×10-4Pa.S的流动相。 (4)高效液相色谱流动相溶剂的极性 在分配色谱和吸附色谱中,溶剂的极性是用混合溶剂的比例来调节的,一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂经过适当的混合可以得到一定极性的混合溶剂。 (5)溶剂的选择性和溶剂的分类 选择流动相的极性能使被分离样品的分配容量在1～5之间,这时如果有两个或几个色谱峰重叠,可以通过调节溶剂的选择性来解决。 选择合适的色谱柱和流动相是高效液相色谱的关键。 参考文献 [1]富玉,陈能武.高温液相色谱的原理及研究进展.中国测试技术, 2006(3)36. 作者简介:徐红,女,副高级工程师,所长。工作单位:新疆昌吉州产品质量检验所。通讯地址:831100新疆昌吉市健康西路17号。 侯健,新疆昌吉州产品质量检验所(昌吉831100)。 收稿时间:2009-10-16 　 10 《计量与测试技术》2010年第37卷第2期

液相色谱仪色谱柱使用及维护

液相色谱仪色谱柱使用及 维护 Prepared on 22 November 2020

液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将"子弹头"预柱放入卡套片内

5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会

气相色谱仪维护保养知识

气相色谱仪的维护保养知识 俗话说得好：没有不好骑的马，只有骑不好马的骑师。只有把GC当朋友，好好了解它的习性、掌握维护保养要领并坚持保养它才能服服帖帖听你的话。 GC主要有载气系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统共五个主要组成部分，要做好保养首先得先了解GC各部分构造以及可更换或清洁的零部件，这部分知识可参考各种GC产品使用说明书。 下面主要就GC各功能部分维护保养经验、要领一一列举： 一、载气系统： 载气系统主要包括气源（气体钢瓶或发生器）、减压阀、限流器、净化器、载气管路等部分，载气系统最主要的维护工作就是检漏，可采用厂家提供的检漏液或者自行配制肥皂水振摇起泡，涂抹在管路连接或阀等有缝隙的地方察看。卸下高压、低压表头检定过的国产减压阀大部分用不了多长时间就会发生泄漏。检漏工作应定期作，周期示实际情况而定。每次更换气瓶、减压阀等也需要检漏。需要注意的是，不要将载气管路长时间放空，应采用堵头堵住两端，尽量避免空气进入载气管路。在质谱应用中，如果拆卸过载气管路，可看到水峰（18）和氮气峰（28）等长时间下不来，此时可稍微拧松GC入口管路螺帽，开载气吹半个小时或更长时间。 净化器在载气系统中作用很大，可以帮助去除气体源中污染设备和影响分析结果的水分、烃类、氧气等等杂质。净化管有很多种选择，主要有氧气净化管、水分净化管、烃类净化管、综合净化管等等。除了部分水分及烃类净化管可以再生处理以外，一般均为一次性使用，寿命示实际情况而定。可再生类净化管一般有显色指示，根据指示确定是否需要再生处理，再生处理步骤为取出吸附剂，烘箱中加热烘烤，最后干燥冷却后重新填装连接管路。 二、进样系统（进样口）： 目前各厂家GC进样口主要有填充柱进样口、分流/不分流柱进样口、PTV (温度可编程蒸发进样口) 、VI (挥发物接口) 、COC(冷柱头进样口) 、气体进样阀接 口 (气体样品)等多种进样口类型以及ALS(自动进样器) 、顶空进样、吹扫捕集进样等进样附件。其中主要以填充柱进样口、分流/不分流柱进样口应用最广，填充柱进样口主要在老的标准方法以及气体分析、大体积进样分析等应用中常用，目前主流的进样口主要为分流/不分流柱进样口，由于其分析要求一般比较高（如农残分析等），维护工作尤其重要，如维护不到位，其分析结果差异较大。

色谱柱的使用和维护

正相、反相和极性胶联柱使用手册 更多资料请访问：https://www.docsj.com/doc/3413251615.html, Chrompack HPLC Normal-,Reversed phase and Polar bonded columns 注意 此色谱柱填充的是改性硅胶材料。向柱内导入碱性溶剂（pH>7.0）或酸性溶剂（pH<2.0）会导致柱子损坏。 1 简介 此柱填充的是反相或者极性胶联型态的硅胶基质材料的硅胶。硅胶形态的柱子用于正相（非水）条件。 反相（C8，C18，ODS，RP-8和RP-18）通常用于反相条件（水相）。 极性胶联型（APS，diol，CN和NH2）依照应用目的，可以用于正相和反相条件。建议不要将一个相同的柱子用于差别非常大的条件下，这是因为柱子在特定的条件下，固定相的性质会发生变化，所以在其他的条件下，会影响柱效。也不建议将硅胶柱用在反相条件下或者将方向柱用在正相条件下，这是因为这种过程会发生重复性差的问题（每一次注射之间和柱与柱之间的比较）。 2 色谱柱老化 在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。 A．在反相条件下老化 要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。 在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。 如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。 B．在正相条件下老化 柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。 C．对于极性键合柱的特殊说明 由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。 3 洗脱液 注意第节和第2节。一定不要使用pH低于2或者高于7的缓冲液，这是由于它们会改变固定相的性质。极性键合柱最好使用在3到5 之间。在使用以前，洗脱液要进行脱气，以及使用0.5微米的滤膜过滤，以免发生检测和泵送问题。 一定要在开始使用系统以前检查水溶液中有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。 4 流量和压力 增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。 如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。

高效液相色谱柱的选择、使用与维护

高效液相色谱柱的选择、使用与维护 辛金菲 天津大沽化工股份有限公司，天津塘沽区300457 摘要：随着社会的进步，色谱分析理论和技术也得到了较大的发展，高效液相色谱现已广泛应用于分析的各个领域，聚集了检测与分离双重性能。其中的色谱柱是样品组分分离的场所，更是高效液相色谱的核心部件，并且属于仪器的耗材，费用比较高。正确的使用方式，才能使其保持良好的性能，而错误的操作方式，可能会导致报废。所以，正确的使用和维护才能保证检测的准确性，而且还能延长使用寿命，降低检测的成本。色谱柱的选择、使用与维护方面的研究在现实中具有非常重要的意义，同时也是色谱工作者和仪器厂商所关注的热点。 关键词：高效液相色谱柱；选择；使用；维护 1前言 高效液相色谱属于色谱法中的一个分支，其流动相为液体，运用的是高压输液系统，将单一或是混合的溶剂和缓冲液流动相泵入装后有固定相的色谱柱，待各成分被分离，再进入检测器，以此实现对试件的分析。由于要分析的样品种类比较多，并且样品的基质都比较复杂，色谱柱很容易被污染，这也是导致分离能力下降和柱压升高的原因之一。通常来说，样品中都会含有一定的不利于分析的物质，其中保留值相对比较弱的物质，一般情况下能快速地从色谱柱中洗脱出

来，才不会对分析产生干扰，对于基质复杂的样品来说，一根色谱柱可能只能使用百余次，并且每一种色谱柱只能适用有限的样品，一次错误进样有时候甚至能导致色谱柱失效。 2高效液相色谱柱的选择 一般情况下，选择保护柱的首先考虑因素是样品的清洁程度，对于大部分相关研究者来说，最合适的保护柱的选择是2cm或3cm，自然所装填的色谱填料随着保护柱的增长而增多，同时它也更能减少污染物进入分析色谱柱。样品的保留时间也会随着保护柱的增长而增长。 保护柱的内径应与分析色谱柱的内径相同或相当，现如今薄膜装填过的保护柱，使用起来也比较简单方便，而且可以干装，但是比较的不经济，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料是有限的，提供的保护作用有限，但是因为装填了较少的色谱料，保护柱也比较短，所以对分析样品的保留时间的影响小。另外一种保护柱结构的实质是缩短色谱分析柱，设计方式上有整体式、手紧式或直连式；从保护柱的结构可分为是否可以更换保护柱柱芯，以此降低保护柱的成本。 3高效液相色谱柱的正确使用 3.1加装保护柱 加装保护柱的作用比较大，特别是在分析中成药、中药等生物样品和复杂混合物之时，更是保护分析柱的重要措施，保护柱填料与分析柱应该保持一致，保护柱属消耗品，在经过大量的样品分析(50～100次)之后,当峰形变坏或柱压显著升高或基线漂移之时,应考虑

(完整版)色谱柱的使用及维护

前言 液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以 固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护 色谱柱的知识非常必要。色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有: (1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。 (2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。 (3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。 (4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。 (5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。 2 色谱柱的使用 新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈中,可用10～20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3～0. 5mL/ min , 10～15min 后可慢慢加快。 硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇冲洗,流速0. 1～0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净后,再用流动相平衡。 实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。 3 色谱柱的清洗与保存 色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品分子残留在柱子、接头、流通池中,会污染系统,影响对其它样品的分析,降低柱效。因此分析工作结束后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用90 %甲醇冲洗30～60min ,若含酸、碱、盐类物质,则要先用10 %甲醇或乙腈,或用与分析用流动相相同的

液相色谱仪色谱柱使用及维护

液相色谱仪色谱柱使用 及维护 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将"子弹头"预柱放入卡套片内

5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会

色谱柱管理规程

色谱柱管理规程 1.目的 本文件规定了色谱柱的采购、接收、使用、保养和保存，以确保色谱柱达到合理应用和规范应 用的管理规范。 2.适用范围 本文件适用于本公司色谱分析用色谱柱的管理。 3.责任 3.1.本文件由质量部QC负责起草，质量部部长审核，生产技术副总经理批准。 3.2.质量部QC负责实施。 3.3.QC主管负责监督检查。 4.内容 4.1.色谱柱的采购 QC根据检验需要提出购买申请，注明柱子固定性类型、购买数量、规格、用途等，QC主管审核批准。由供应部从定点供应商处购买。 4.2.接收 4.2.1.编号、登记 对于新购进的色谱柱必须造册编号登记，贴上标签,注明编号。编号用阿拉伯数字表示，以此类推不重复使用。 填写色谱柱登记表，内容包括:生产公司、品名、型号规格、编号、购进时间、启用时间、固定 相类型、单价等。 4.3.存放 色谱柱分类存放。不同的色谱柱按柱子当时柱效不同放入不同的盒中，并标注不同状态以便区分避免混淆。色谱柱按照不同的柱效分为三类，使用良好；需要保养；停止使用。 保养前放入“需要保养”的盒中； 保养后并能提高柱效达到检验要求的放入“使用良好”的盒中； 保养后不能提高柱效并影响检验结果的放入“停止使用”的盒子中。 4.4.使用与保养 每启用一根色谱柱,在色谱柱标签上填写启用日期，放入“使用良好”的色谱柱盒中。 对于不同的样品可使用不同的色谱柱，也可使用同一根色谱柱，但必须确保色谱柱类型、柱效符 合要求。 对于一些使用频率少的柱子,因为放置时间长,容易干柱影响柱效, 每根柱子每三个月保养一次, .

每一次做好保养记录。 频繁使用的柱子，因为使用时间长，造成柱效降低或柱压增高等不利于检验结果的现象时，也要 对柱子作出相应的保养处理，并做好保养记录。 4.5.使用后清洗 色谱柱每次使用后要对柱子进行冲洗。冲洗分为两个方法：方法一（流动相为简单的有机相与水 混合的）用50%的甲醇冲洗15-30分钟，最后用纯甲醇冲洗15-30min；方法二（流动相中含磷酸或盐类或缓冲液的）先用重蒸馏水冲洗15min，然后用50%的甲醇冲洗15-30min，最后用纯甲醇冲洗15-30min。色谱柱的使用和冲洗方法都体现在高效液相色谱仪使用记录里面。 4.6.色谱柱的保存 4.6.1.气相色谱柱 对于暂不使用的色谱柱，应小心存放，可用硅橡胶块、帽或其他方式将两端封闭，置于盒中。 4.6.2.液相色谱相 首先色谱柱必须清洗干净后才能贮存,柱子不能贮存于水或水性溶剂中,否则会引起微生物的滋生。反相色谱柱可以贮存于甲醇或乙腈中，正相色谱柱可以贮存于经脱水处理后的正已烷中， 离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化钠的水中，并将色谱柱两端密封，以免干燥，室温保存。 4.7.色谱柱的保养方法 应按所附说明书的要求对色谱柱进行保养。不同的色谱柱采用不同的保养方法。对于较昂贵的液相色谱柱,可以在柱前加一保护柱(预柱),防止样品中杂质污染分析柱,对于制备柱,因其进样量大,使用保护柱尤为重要。 4.8.报废 对于柱效完全不符合要求的色谱柱或由于其他原因已不能使用的色谱柱，经QC主管批准后，做好停用记录,不能随意丢弃,存放与“停止使用”的盒子中。每年集中清理一次，废弃处理。 5．记录 色谱柱的相关记录由QC整理,QA收集归档保存三年. 6.相关记录 R-SMP07047-01色谱柱登记记录 R-SMP07047-02色谱柱保养记录 R-SMP07047-03色谱柱停止使用记录 .

色谱柱的使用和维护注意事项

色谱柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 1、避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓(如前所述)。 2、应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 3、一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 4、选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 5、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。 6、保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要

拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置或更长时间。 7、色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出 1-2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5-30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2-9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。 8、新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会

C18色谱柱维护与保养

C18色谱柱的维护与保养 1、新柱的处理： 我们每次新买的柱子虽然是经厂家测试过并密封好的，可是有的柱子到达手中时已经过很长的时间了，因此，我们每拿到一根新的色谱柱都必须要对柱子进行处理。首先，是配制好65%的乙腈/水，再把色谱柱正确的连接在色谱仪上，出口放空（注意：出口端切不可连上检测器，以免污染了检测器），以低流速0.1ml/min~0.5ml/min（如果是LC/MC柱子，则应以0.3ml/min进行）均可，不可以高流速进行，等看见柱子出口有液体流出后，过20分钟后再接上检测器，以循序渐进的方法将流速调至1.0ml/min（如果是LC/MC柱子则应以0.3ml/min进行），继续冲洗2~8小时。 2、新柱的使用： 首先我们确认所分析样品流动相的PH是不是在色谱柱PH的耐受范围(2~8)之内，以免损伤柱子!如果，确认在柱子的使用范围之内，就用做样品的流动相平衡柱子(如果流动相中含用缓冲盐溶液，在平衡柱子之前务必要先用5%甲醇或5%乙腈去过渡30分钟以上。再用带盐的流动相去平衡色谱柱。)当色谱柱平衡了足够时间，基线非常平稳的时候，方可进样分析。不管是分析什么样的产品，由于各种各样的因素，样品中总有杂质。因此，最好在色谱柱前端加上保护柱。以增加色谱柱的使用寿命！ 3、色谱柱清洗： ①如果样品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流动相，在做完样品之后可直接用55%~65%乙腈/水或者用55%~65%甲醇/水冲洗色谱柱40~80分钟，然后以纯甲醇或乙腈冲洗30分钟，即可保存；②如果样品分中流动相里含用

缓冲液或酸或离子对试剂的流动相，在做完样品之后的清洗必须按照如下步骤进行清洗柱子:先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水，以1ml/min,冲洗1.5小时以上(如果色谱柱更长，则还需要增加适当时间);然后用55%~65%甲醇//水冲洗色谱柱30~60分钟.最后用甲醇或乙腈以1ml/min冲洗30分钟。 4、色谱柱的再生： 当色谱柱用过很长的时间之后，就可能发生柱压力升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等等情况，这时我样就需要对色谱柱进行再生，以延长色谱柱的使用寿命。具体方法有如下：先用5%甲醇/水或者是5%乙腈/水，把色谱柱反向以1ml/min,冲洗60分钟以上.然后用四氢呋喃以1ml/min冲洗30分钟以上；再用65%甲醇/水或者65%乙腈/水，以流速1ml/min冲洗60分钟。最后用纯甲醇或乙腈冲洗30分钟保存即可。 备注：甲醇、乙腈、四氢呋喃均要用质量好色谱纯。水用是重蒸留水。

色谱柱的使用和维护

一.安装、启用和维护中重点注意事项 色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻等。 1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。

2. 溶剂的匹配转换 色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。 3. 新柱使用前的平衡和老化 厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语，目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流路中的吸附饱和。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，因扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。 4. pH使用范围 一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8，这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同，对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大

高效液相色谱柱的选择

液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障的排除 液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2~8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较） 二、液相色谱柱的使用 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。 1、样品的前处理 a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长期留在柱中)。 b、流动相与样品不产生化学反应 c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，

液相色谱仪色谱柱使用及维护

液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱）1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将"子弹头"预柱放入卡套片内 5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动

色谱柱使用维护保养操作规程

目的：建立色谱柱使用维护保养操作规程，规范色谱柱的使用、维护行为。 范围：适用于色谱柱的使用、维护和保养。 依据： 责任：药分部 内容: 1.操作规程 一般要求是一根柱子用于同一个系列的产品，稳定性试验用专用柱。 1.1.新色谱柱在使用之前，首先应查看说明书，检查柱子的pH值范围是否与待验产品的要求相一致，确认柱子和仪器的接头以及管路是否相匹配，并注意柱子上标示的流向箭头，一切确认无误后，编上编号，在《色谱柱启用、报废台帐》上登记开始使用时间、生产厂家、型号规格等。 1.2.使用时，应按各色谱柱的要求进行色谱柱的维护保养，并在色谱柱使用登记表中登记使用日期、所测产品的名称及批次、使用前后维护保养的具体内容； 1.3使用后，及时填写《色谱柱使用台帐》。 2.维护规程 2.1.液相色谱柱的维护 2.1.1. 色谱柱使用时，确认柱子的编号、型号规格与待验产品的要求相一致，流动相的pH值应与柱子说明书上规定的pH值相适应，然后旋开两端的封头，接到高效液相色谱仪上，使色谱柱的箭头指向与流动相流向一致。 2.1.2.流动相应经过0.45um滤膜过滤并脱气后使用，柱压不要超过300bar（3000psig），最高操作温度不得超过60℃。 2.1. 3.流动相如果是非盐类的，用流动相冲洗约30min，按《高效液相色谱仪操作规程》进行操作，然后进行样品的检验。如果是盐类的，用有机相：水=10：90的溶液冲洗约10min，再换上相对应的流动相，按《高效液相色谱仪操作规程》进行操作，然后进行样品的检验。 2.1.4.检验完毕，如流动相中含有盐类物质，应先用有机相：水=10：90的溶液以1ml/min的流速冲洗约40min，然后用HPLC级的乙腈或甲醇以1ml/min的流速冲洗约30min，关闭液相色谱仪，取下色谱柱，在柱两端旋上封头，以防止柱内的有机溶剂流失而使柱内填料发干变松，柱效下降。不用的色谱柱放入液相色谱分析室的专用贮存柜中。 2.1.5.拿用时要轻拿轻放，避免剧烈震动。 2.1.6.不允许反向连接和冲洗柱子。 2.1.7.柱子的再生：每使用二十次，就按以下程序进行再生一次，以延长柱子的使用寿命。冲洗程序：按柱子上所示箭头方向，依次用高纯水－甲醇－氯仿－甲醇以1ml/min的流速分别冲洗约

气相色谱的使用经验和色谱柱的选择

如何能选择到理想的色谱柱, 如何知道应该选用什么色谱柱 一些分析工作只能选定一种特定的色谱柱而不能自由的选择色谱柱.有的分析方法虽然可以选用相同的色谱柱也可以工作, 但是对这些样品却并非是最佳的选择. 所使用柱子选择是否正确所选择的柱子是否是经过性能调查取得最佳结果所使用的柱子是否是色谱仪方法调试时刚巧装上以后便直接使用, 色谱柱的选择对分析方法是否成功是一个很苛刻的问题. Restek 有900 多种不同的毛细管柱.如果不知道如何准确的选择色谱柱, 其结果将会影响分析结果. 我们介绍的的色谱柱材料,参数,诸如固定相极性,内径,膜厚和柱长等将有助于分析时选择合适的色谱柱.另外也可以帮助你审定一下你已经 采用的色谱柱是否是最佳选择.可以从中选择最恰当的色谱柱以帮助提高分辨率,分析速度以及定量的结果. 色谱柱材料:石英柱管及MXT柱管 石英和MXT不锈钢两种柱管材料都具有钝化和柔性的优越性.在很多的应用场合都使用这两种材料.由于MXT柱管材料的优越性,现在很多毛细管GC 都越来越多的使用这种材料.MXT柱管材料抗磨损,耐刮擦,当GC 在任何温度下工作时,产生自然断裂的机会很少.它可以卷成很小的螺旋直径以适应类似手提便携式色谱使用.在操作条件恶劣情况下,不锈钢MXT柱是最佳选择.另外,MXT柱管在高温色谱中耐温可达430℃(取决于固定相的耐温情况).当对折断的问题考虑较少,而且希望能观察鉴别柱内不挥发物质的污染时最好选择石英玻璃柱.石英玻璃柱适合于使用紧压式接头方式安装保护柱,也可以做成一体柱. 固定相选择 选择一个新色谱柱的时候, 首要是要考虑的是固定相. 在分析物质和固定相功能团之间有不同的相互作用关系.这种相互作用对分析的影响比任何其他因素都重要.因此应该尽量的多了解色谱柱和要分析的样品.固定液的选择应遵循"相似相溶"的基本原理.在分析非极性的样品时, 非极性固定液是首选.这时, 固定液与被分离组分间主要靠色散力起作用,固定液的次甲基越多, 色散力越强. 各组分基本上按沸点顺序彼此分离. 沸点低的先流出. 如果被分离的组分是极性和非极性的混合物, 则同沸点的极性物质先流出. 对于极性物质的分离, 首选为极性固定液. 这类固定液分子中含有极性基团, 组分与固定液之间的作用力主要是静电力, 诱导力和色散力则占次要地位. 各组分的流出顺序按极性排列, 极性小的先流出, 极性大的后流出.如果样品是极性和非