层析分离法.

第三章层析分离法

1. 主要教学目标：学习和掌握柱色谱、纸色谱和薄层色谱法的原理、技术和应用。

2. 教学方法和手段：采用板书及与多媒体课件相结合，课堂上师生互动，采用启发式和提问式的教学方式，并且课堂上学习的表现记入学生的平时成绩。

3. .教学重点及难点：柱层析及基本理论；纸色谱

色谱法又称层析法，是一种广泛应用的分离方法。

色谱分析法是在1906年由俄国植物学家Tsweet首先系统地提出，他将叶绿素的石油醚液流经装有CaCO3的管柱，并继续以石油醚淋洗时，发现由于CaCO3对于叶绿素中各种色素吸咐能力的不同而使它们彼此分离，于是管中出现不同颜色的谱带，如图3─1所示。

图3-1 Tsweet的色谱工作图

尤如光谱一样，这样就有可能对它们进行定性分析和定量测定，于是他将这种彩色分层物定义为层析谱，而将这种分析方法称为色谱分析法。色谱法(Chromatograph)这—名词是由希腊字“Chroniatus”(颜色)和“graphein”(记录)二字合并而成。并发表了“植物界的色素”专论。到1931年，Kuhn和Leaerer又成功地适用Tsweet的方法分离了植物的色素，才使这一方法得到公认和广泛应用。

1935年人工合成离子交换树脂后，为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。

1938年苏联的Izmailo等创立了薄层色谱法，主要是用于药物分析，应用于无机物分析则是50年代末才开始的。应用于稀土元素的分离是1964年由Pterce开始的。

1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。

1944年Consden，Cordon和Martin首先开始了纸色谱法，Martin和Synge并用此法成功地分离了氨基酸的各种成份，获得1952年的诺贝尔奖。

1947年美国的Boyd和Spedng等人发表一系列论文，报告他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。

1952年Martin和Games开创了气一液色谱的新领域。20世纪60年代末，法国的G.Aubouin和美国的Scott等人同时各自创立了高压液相色谱法，它与分光光度、库仑、电导、荧光等方法联用，可使分离和检测实现自动化。

到目前为止，各种色谱还在不断发展，色谱设备日益完善，操作技术不断突破，色谱分析法已成为近代化学中最重要的分离分析手段之一。

色谱法有许多分支，但在色谱分析过程中总是由一种流动相(例如Tsweet工作的石油醚)，带着被分离物质(如叶绿素)流经固定相(如CaCO3)，从而使分离物中各组分分离。它有许多分类方法。

按流动相和固定相性质不同分类

流动相固定相色谱分析法种类

固体气固色谱法

气体气相色谱(气相层析)

液体气液色谱法

固体液固色谱法

液体液相色谱(液相层析)

液体液液色谱法

按操作形式分类

①柱色谱：柱色谱顾名思义就是将固定相(如硅胶、氧化铝、氧化铝、碳酸钙、淀粉、纤维素)，离子交换(树脂等)装人一根被称为色谱柱的玻璃瓶中，这种色谱柱通常又称为“层析柱”或“分离柱”。

②纸色谱：利用滤纸作为固定相，让样品溶液在其上展开，达到分离鉴定的目的。

③薄层色谱：将吸附剂研成粉末，再压成或涂成薄膜，然后用与纸色谱相类似的方法操作。

按分离过程的原理不同分类

①吸附色谱：固定相为吸附剂，利用吸附剂表面对被分离组分吸附能为强弱的差异性进行分离。气固色谱和液固色谱属这一类。

②分配色谱；是利用各个被分离组分在固定相和流动相两相间分配系数的不同来进行分离的。气液色谱和液液色谱属于这一类。

③离子交换色谱：以离子交换剂作固定相，利用各种组分的离子交换亲和力的差异来进行分离。

④凝胶色谱：又称排阻色谱。用凝胶作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分所产生阻滞作用的差异来进行分离。

气相色谱和高效液相色谱属于仪器分析，这里不作表述。本章重点介绍柱色谱、纸色谱和薄层色谱。

色谱分离法的特点

（1）高选择性：色谱分析的高选择性主要表现在它能对性质极为相似的物质，例如有机化合物中的各种类型的异构体(顺反异构体、旋光异构体、芳香烃中邻位、间位、对位异构体等)，又如氢同位素氢(H)、氘(D)、及氘(T)可以形成的六种氢分子，这些异构体和同位数，原则上都可以用色谱方法进行分离测定。

（2）高效能：是指色谱可以分离分配系数接近的组分，从而可以分析极为复杂的化合物。这是因为在分离的全过程中，可以认为是无限个流动相在无限个固定相中移动，物质即在两相中作无限次抽提、溶解，再抽提、再溶解的过程，尽管它们之间分配系数差异不大，但经反复抽提，溶解的结果，使微小的差异积累成明显的差异，因而提高了分离效率。

（3）高灵敏度：总的来说，各种色谱分析的灵敏度都比较高，样品的分析量可

以达到10-12～10-14克，因此在痕量分析上广泛应用，而且成为最重要的手段，可以鉴定出环境分析中的杂质，高分子单体、原子能裂变物等，鉴定量1ppm－0.lppb以下。

（4）高速度：色谱分析一般来说还是比较快的，如纸色谱、柱色谱可以同时分离几种或十几种物质，而且既能定性又能定量。特别是气相色谱及高效液相色谱，大部分样品只要几分钟即可完成一个分析周期。

§3-1 柱色谱

柱色谱，按其作用原理又可分为吸附柱色谱和分配柱色谱。

一、吸附柱色谱

吸附柱色谱是各种色谱法中最早建立的。所谓吸附是指物质在吸附剂表面上集中浓缩的现象，吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其表面具有许多吸附中心(或吸附位置)，这些吸附中心数量的多少及其吸附能力的强弱直接影响吸附剂的吸附性能，吸附能力减弱，加热驱除水分，可使吸附能力增强，即所谓“活化”；反之，加入一定量的水分，可使活性降低，称之为“脱活性”。

1. 吸附等温线

在一定温度下，某种组分在吸附剂表面的吸附规律可用平衡状态时此组分在两相中浓度的相对关系曲线表示。这种关系曲线称吸附等温线。吸附等温线有线性和非线性两种。如图3-2(a)所示。

图3--2 吸附等温线(a)和对应的洗脱曲线(b)

线性吸附等温线如图3-2(a)，当溶质A随着流动相缓缓流过层析柱中的吸附剂(即固定相)时，溶质A在两相同不断地发生吸附、脱附，再吸附、再脱附过程。以Cm 表示溶质A在流动相中的浓度，Cs表示溶质A在固定相中的浓度，吸附平衡可用下式表示：

Cm Cs

则吸附平衡的平衡常数

D Cs

K

Cm

( 3 – 1 ) 即溶质在固定相和流动相中浓度的比值，又称分配系数。对于这类吸附过程K D 为一定值。当流动相的流速保持恒定时，溶质A的区带在层析柱中将以恒速前进，随后流出柱外。若测定流出液中A的浓度，绘制出流出液浓度(C)和体积(V)的关系曲线，则得如图3-2(b1)所示曲线；为一对称形的层析图谱，或称为洗脱曲线。

非线性等温线主要可分为两种：一种是呈凸形吸附等温线，如图3-2(a2)所示；一种呈凹形等温线，如图3-2(a3)所示。由于吸附剂表面上具有吸附能力强弱不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数不同，吸附力强的吸附中心，分配系数(K D)较大，溶质分子首先占据它们，其次再占据较弱的，弱的和最弱的，于是K D值随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心的被饱和而逐渐变小，因而吸附的等温线逐渐向下弯曲而呈凸状。对于这种层析过程进行洗脱时，由于数量较多的弱的和较弱的吸附中心上的溶质先被洗下，接着较少的强吸附中心上的溶质也被洗下，于是获得的洗脱曲线呈拖尾形，如图3-2(b2)所示，吸附层析等温线以这种形式为主。但若减少溶质量，只利用凸形等温线开始的一部分，接近于线性关系，此时洗脱曲线也就变得对称了。

在试样中各组分的K D值多有差异，K D值较大的组分在柱上吸附较牢，在固定相中保留时间较长，要将它洗脱下来，所需溶剂(流动相)也较多。反之，K D值较小的组分，较易被洗脱下来。于是可利用各组分吸附能力的差异，即保留特性的差异将它们分开。

组分在柱上的保留特性可用保留时间和保留体积表示。所谓保留时间是从进样开始到流出液中出现浓度最高点的时间；所谓保留体积是从进样开始到流出液中出现浓度最高点时流过层析柱的流动相的体积。

2. 吸附剂及其选择

为了使试样中各组分分开，必须选择适宜的固定相和流动相。

吸附剂一般应为粗度均匀的细小颗粒，具有较大的表面积和一定的吸附能力，吸附剂与欲分离的试样和所用的洗脱剂不起化学反应，也不溶于洗脱剂中，常用的吸附剂有氧化铝，硅胶和聚酰胺等。

(1) 氧化铝

是由Al(OH)3在300～400℃时脱水制得。对氧化铝表面的吸附机理，人们的认识还不一致，有人认为氧化铝表面存在铝羟基A1-OH，由于羟基的氢键作用而吸附物质。氧化铝因生产条件的不同可分为中性、酸性和碱性三种，吸附性能也有差异。中性氧化铝应用广泛，适用于醛、酮、醌、酯、内酯化合物及某些苷的分离；酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素，某些氨基酸等；碱性氧化铝适用于分离碱性化合物，如生物碱、醇等。一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质也可用中性氧化铝分离。

氧化铝的活性与含水量密切相关，活性强弱用活度级I—V级表示，活度I级含水量极少，吸附力最强，V级最弱。把氧化铝加热至100～150℃，除去与羟基结合的部分水分，使氧化铝具有一定活性，加热150℃以上，氧化铝活性增至II─III级，加热至300—400℃，活性增至I-II级，再升温至600℃以上，进一步脱水，并开始烧结。由于脱水过程受许多因素影响，因此每批生产的氧化铝活性也不一致。

一般讲，分离弱极性的组分选用吸附活性强一些的吸附剂，分离强极性的组分，选用活性弱的吸附剂。

(2) 硅胶

层析用硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制得，性能稳定。硅胶表面化学组成有下面几种：

硅氧游离型束缚型活泼型

烷硅醇基硅醇基硅醇基

硅氧烷不具吸附性，硅醇基能与极性化合物或不饱和化合物形成氢键，因而具有吸附性，其中活泼型硅醇基构成最强烈的吸附中心，游离型次之，束缚型又次之。由于活性羟基在硅胶表面较小的孔穴中较多，因而表面孔穴较小的硅胶吸附性能较强，

水与硅胶表面的羟基结合成水合硅醇：、OH、OH2，使其失去吸附性，加热至100℃左右能可逆地除去这些水分，使硅胶活化，最佳的活化条件是105～110℃，加热30分钟，若加热至200℃以上，则硅胶逐渐失去结构水，形成硅氧烷，吸附力下降。

束缚型活泼型硅醇基

硅醇基

加热至400℃以上，上述反应发生在两相邻表面间，胶的表面积逐渐变小，以至于烧结。

硅胶具有微酸性，吸附能力较氧化铝稍弱，可用于分离酸性和中性物质。如有机酸、氨基酸、萜类、甾体等。

(3) 聚酰胺

它是由己内酰胺聚合而成，因而又称聚己内酰胺，或称锦纶，层析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，易溶于浓盐酸、热甲酸、乙酸、苯酚等溶剂，不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂。对碱比较稳定，对酸的稳定性较差，热时更敏感。

聚酰胺分子内存在很多酰胺键，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因面对这些物质有吸附作用，酚类和酸类是以其羟基或羧基与聚酰胺中酰胺键的羧基形成氢键；另外硝基化合物和醌类化合物是以其硝基或醌基与聚酰胺分子中酰胺键，游离胺基形成氢键，如图3-3所示。各种化合物因其与聚酰胺形成氢键能力的不同，吸附能力也不同，因此可以得到分离。一般讲，只有以下规律，能形成氢键基团较多的溶质，吸附能力较大，对位、间位取代基团都能形成氢键时，吸附力增大，邻位的使吸附力减小，芳香核具有较多共轭双键时，吸附力增大，能形成分子内氢键者，吸附力减小。

3. 流动相及其选择

流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性的流动分子占据活性中心的能力强，因而具有强的洗脱作用，非极性流动相占据活性中心的能力弱，洗脱作用也要弱得多。因而为了要使试样中吸附力稍有差异的各组分分离，就必须根据试样的性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相。

图3-3 聚酰胺吸附作用原理

显然，强极性的组分容易被吸附剂所吸附，应选用极性较强的流动相才能将其从吸附剂上洗脱下来；弱极性的组分则应选用弱级性的流动相洗脱之，被分离组分的结构不同，其极性也不同，常见的功能团按其极性增强次序排列如下：烷烃＜烯烃＜醚＜硝基化合物＜二甲胺＜酯＜酮＜醛＜硫醇＜胺＜酰胺＜醇＜酚＜羧酸。

当有机分子的基本母核相同时，取代基团的极性增强，整个分子的极性增强，极性基团增多，整个分子的极性增强，分子中双键多，吸附力强，共轭双键多，吸附力增强。

流动相极性较弱时，可使试样中弱极性的组分洗脱下来，在层析柱中移动较快，而与极性较强的组分分离。同样，强极性和中等极性的流动相适用于强极性和中等极性组分的分离，常用的流动相按其极性增强顺序排列如下：

石油醚＜环己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烯＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸甲酯＜丙酮＜正丙醇＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜酸。

可将各种溶剂按不同配比配成混合溶剂作为流动相，因此流动相的种类很多，流动相的选择也比固定相的选择更为复杂了。

当然，在选择层析分离条件时，必须从分离组分，吸附剂和洗脱剂三方面考虑，对于某种试样，就必须考虑如何选择合适的固定相和流动相，上面讨论的仅是一般

规律，对于具体的某种试样尚需通过实践进行适当选择。

至于溶解试样用的溶剂，极性应与流动相接近，以免因两者极性相差过大而影响层析分离。

二、分配柱色谱

1. 比移值

分配色谱是根据欲分离组分在两种互不混溶(或部分混溶)溶剂间溶解度的差异而分离的。在层析中，这两种互不混溶的溶剂之一是流动相；另一种是吸收在载体或粗体(往往也把它们称为吸附剂)中的溶剂，这种溶剂在层析过程中不流动，是固定相，例如含有一定量水分的硅酸，吸附性能消失(或极弱)，它含有的水分是固定的，硅胶为粗体。当流动相带着试样中的各种组分沿着层析柱流动肘，试样中的各种组分就在流动相和固定相两种溶剂间进行分配，不同两组分分配系数有差异肘，它们在层柝柱中前进的速度就不相同，于是得以分离。分配柱层析中的分配系数以K D 表示之。 在分配柱层析中，若在单位时间内，一个分子在流动相中停留的时间分数(即在流动相中出现的几率)以R 表示，若R = 1/3，卸表示读分子有1/3时间在流动相，2/3时间在固定相，对于大量的分子，则可认为有1/3的溶质分子在流动相，有2/3(即1一R)的溶质分子在固定相。在流动相和固定相中溶质的量可分别用Cm 、Vm 及Cs 、Vs 表示，其中Vm ，Vs 分别为层析柱中流动相和固定相的体积，于是

1D R Cs Vs Vs K R Cm Vm Vm -== ( 3 – 2 )

整理上式得：

11D Vs K R Vm =+

( 3 – 3 ) 1

1D R Vs K Vm =+

R 是溶质分子出现在流动相中的几率，它表示层析过程中溶质分子在层析柱中移动的情况，如表示溶质分子与流动相分子在层析柱中移动速度的相对值，常以R f 表示，称为比移值。从式3-3可见，在一定层析条件下，Vs 和Vm 是定值，R f 值只和分配系数K D 有关，各种不同组分，由于分配系数的不同，比移值不同，从而达到分离目的。△R f 值相差较大有利于分离。

2. 分配柱层析的担体、固定相和流动相

(1) 担体

担体也常被称为吸附剂。严格讲，担体又起负载固定相的作用，本身应是情性的但实际并非如此，对于同一种试样，改变担体，常常会使R f值发生变化，这可能是由于担体表面固定液膜较薄，—部分担体裸露于外，起了吸附剂作用，这也就是分配层析常混杂着吸附层析的原因。分配柱层析常用韵担体有如下几种：硅胶：在分配柱层析中用作担体的硅胶应在较低温度下活化，使其表面残留一定量的水分作固定相。

纤维素：层析用纤维素可分两种，即天然纤维系和微晶纤维素，前者是由质量较好的纸浆，经干燥、粉碎后制成，纤维长约2-20 m，平均聚合度为400 – 500；微晶纤维素是由棉花等较纯的纤维素，与强酸一起加热，部分水解后形成的微小晶体纤维素，平均聚合质为40-200。纤维素上有许多羟基，易与水形成氢键而将水吸附，这种吸附着的水分形成分配层析中的固定相。

硅藻土：系天然存在的非晶形硅胶，其中除SiO2外，还含A12O3、Fe2O3、CaO、Na2O和有机物及水分等，需净制才能供层析用，硅藻土表面积小，仅1-5m2／g，不适于作吸附剂用，但作担体较为适宜。

(2) 固定相

分配柱层析中常用的固定相为水，也有用稀硫酸、甲醇、甲酷酰胺等强强极性溶剂。

(3) 流动相

分配柱层析中的流动相一般是与水不相棍溶的有机溶剂，如正丁醇、正戊醇等，为了防止层析过程中流动相把吸附于担体上的少量水带走，流动相应予先用水饱和，并要加入羟酸、氨水等弱酸，弱咸，防止某些被分离组分的离解。

分配柱层析常用来分离强极性的、亲水性的物质，如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等。

分配柱层析速度较慢，处理量小，温度的影响较大。因此能用吸附柱层析分离的试样总是尽量采用吸附柱层析。

三、柱色谱的操作

柱色谱常用的层析柱如图3-4所示，基本上与Tsweet当年用的相

似。用玻璃或塑料制成，其直径与长度比约为1：10～1：60，底部塞

以玻璃纤维或脱脂棉，然后可将吸附剂装入柱内，装柱可用干法、湿

法两种。

1. 干法装柱

将已选定并经处理的吸附剂通过漏斗缓缓流入柱中，必要时可轻

轻敲打管柱，使之装填均匀，装毕后，在吸附剂表面铺—层滤纸，然

而打开旋塞，并从管口徐徐加入洗脱剂，注意勿冲起吸附剂，吸附剂

润湿后，注意柱内要无气泡；但干法装柱常会在柱内出现气泡，使

图3-4 层析柱层析时发生沟流现象。

2. 湿法装柱

先在柱内加入已选定的洗脱剂，将下端旋塞稍打开，将吸附剂缓缓加入管中，加入的速度不要太快，以免带入空气。必要时轻轻振动管柱，有助于填充均匀，并使吸附剂带入的气泡外溢。

装填完毕后，可加入试液，前面已提到，溶解试样的溶剂极性应与洗脱剂相似，将试液小心地注入管柱上端，勿使吸附层受到扰动。试液要浓，体积要小，这样使试样集中在管柱顶部层可能小的范围内，以利于展开。若试样难溶于极性与洗脱剂相似的溶剂中，可先溶于适当溶剂中，加入少量吸附剂，拌匀，待溶剂挥发后，再将吸附着试样的吸附剂加于柱中吸附层上，然后进行层析分离。

将已选定的洗脱剂小心地从管柱顶端加人柱中，勿冲动吸附层，并保持一定液面高度，控制流速，一般为0.15～2mL/min。若是有色物质，展开后可看到不同颜色的谱带。

分离后的各组分，可分段洗脱，分别测定，就可将整条吸附剂从柱中推出，分段切开，分别洗脱后测定。

由于柱层析可处理较大量的试样，因而常用来提纯某些物质。

四、液相色谱的基本理论

1. 基本保留方程式

假设有A 和B 两种组分在层析柱上进行分离，溶质分子在行经层析柱的过程中是保持分配平衡的，则每一种组分在平衡状态时两相间的浓度比，称为分配系数(K D )

D Cs K Cm

K D 值愈大，则该组分在固定相中浓度分配愈大，较难洗脱下来，反之则易于洗脱。故根据K D 值的大小，可以判断两种组分分离的难易。

如果试样组分的进样量非常小时，可获得对称性的色谱峰(分配系数与试样浓度呈线性关系)，在这样的条件下，可以把达到最大峰值的洗脱时间与平衡分配系数联系起来，这个时间叫保留时间( t R )，如图3-5所示

洗脱时间是流动相流速的函数，因为最基本的留值参数是保留体积(V R )。所谓保留体积就是层析柱上洗脱下某一组分所需流动相的毫升数。任一组分的保留体积，可直接从测量该组分的保留时间乘以用mL/ S 表示的体积流速而得到，即 V R = t R × F 0

( 3 – 4 ) F 0为体积流速。

图3-5还给出了非滞留（或称非吸着)组分的保留时间(t 0)，即在固定相中，完全不吸附或不溶解的物质。因此它与流动相以同一速率流过柱子，其保留体积是 V M = t 0 × F 0 ( 3 – 5 ) V M 是柱子中所含有流动相总体积的一个量度，又称柱的“死体积”。

对于任何色谱过程的基本保留方程式可用下式表示

V R = V M + K D Vs

( 3 – 6 ) 图3-5 保留时间(t R )色谱示意图

(w 为峰宽 to 为非滞留时间)

式中，Vs 是固定相的体积，这个色谱的基本方程式，将组分的保留体积与柱的死体积及分配系数和固定相体积的乘积联系起来。

2. 容量因子('k ) 其定义为：D CsVs Vs k K CmVm Vm '===?固定相中溶质的量流动相中溶质的量 ( 3 – 7 ) 容量因子基本上是样品组分的量在两相间的比例，是当样品通过整个柱时，分配程度的一个尺度，将(3-6)和(3-7)结合起来，得

(1)R V Vm k '=+ ( 3 – 8 )

由此可见，当'k = 0时，V R ＝ V M ，表明样品组分不被滞留(即不被吸着)。 将(3-4)、(3-5)代人(3-8)式，得： 000(1)R t F t F k '=+ （3 – 9）

一般流动相的流速常保持恒定，因此，容量因干('k )可以保留时间表示出：

00

R t t k t -'= 容量因子(k ')就是净保留时间与非滞留(非吸着)时间的比值。

非滞留时间(t 0)等于柱长(L)除以流动相的线速度(V)，即等于L/V ，因此，(3-9)式可改为

(1)R L t k V '=+ ( 3 – 10 )

此式给出了保留值与平衡，柱长和流动相流速间的基本关系。柱长加长一倍，保留时间也相应加大一倍，而流动相流速增加一倍，保留时间就相应减半。通过与容量因子的关系，保留时间也与固定相和流动相的相对量有关，较大量的固定相将导致较大的保留时间，影响保留值的另一个因素分配系数(K D )，K D 愈大，保留时间也愈长。 相对保留值(α)，或叫分离因数，也是一个重要的色谱参数。所谓相对保留值(α)，就是两个组分净保留时间之比，也可以看作是两个组分容量因子之比，或者是两个组分分配系数之比，即

22102101R D R D t t K k a t t k K -'==='- ( 3 – 11 )

K D 值相差愈大，或两容量因子相差愈大，分离因数(α)就愈大，两组分分离率愈高。

3. 分辨率

在柱色谱中，为了定量描述两个相邻谱带之间的分离效果，一般采用分辨率(Rs)，或称分离度，其定义为两谱带中心之间的距离除以同单位表示的谱带平均宽度，即

21

122()R R t t Rs W W -=+(以时间单位表示) ( 3 – 12 )

或

21

122()R R V R Rs W W -=+(以体积单位表示) ( 3 – 13 )

从峰的转折点所引切线与基线相交，即可求得峰宽w 。

保留时间t R 或保留体积V R 反映了色谱的热力学性质，它与被分离组分固定相与流动相的性质有关。当色谱体系确定后，某一组分的保留时间或保留体积由该组分的性质决定。因此，保留时间或保留体积是色谱定性的基本方法。谱峰的宽度反映了色谱的动力学性质，它与流动相的流速，固定相的粒度等有关。分辨率Rs 综合了色谱过程的热力学和动力学特性，比较全面地表示出两种组分色谱分离的实际效果。当相邻两组分色谱峰保留值之差愈大，或两组分色谱峰的宽度愈窄，分辨率就愈大，表示两组分色谱分离的效果愈好。

4. 塔板理论

当试样组分在层析柱中分离时，总伴有谱带的展宽，这时组分的分离是有害的。为了描述怎样衡量一根层析柱的好坏，即色谱展宽的程度。Marmt 和Synge 首先将蒸馏塔板理论用于色谱分离中，把层析柱比拟分馏塔，并假定每个塔板高度间隔内，被分离组分在两相间达到分配平衡。保留体积小的，或分配系数小的，先从层析柱中流出。色谱中的塔板理论，虽然是半经验性的理论，但可用理论塔板数N 和理论塔板的高度H 来衡量层析柱的效率。对一根层析柱来说，N 值愈大，柱效愈高；H 愈小，柱效愈高，计算理论塔板数N 值，常采用如下公式

2216()()R B V V V N W σ== ( 3 – 14 )

式中V R 是组分的保留体积，w 是峰宽，t σ是高斯函数的标准偏差，以体积为单位表示。

如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法

如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法 谢沐风 (上海市药品检验所上海200233) 摘要本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。 关键词薄层色谱法（TLC法）有关物质方法建立 有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在药品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。 TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。 1．测定方法类型 常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。 2．展开剂的确定（即专属性试验） 专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来

薄层色谱 的详细步骤

. 薄层色谱分析步骤详解 薄层色谱法(thin layer chromatography简写TLC)是一种物理化学的分离技术，常用于药物的分离与分析。现对此方法的分析步骤及留意事项提点建议。 完成TLC分析通常需经制板、点样、展开、检出4步操纵。 ⑴制板 在一平面支持物(通常为玻璃)上，均匀地涂制硅胶、氧化铝或其他吸附剂薄层、样品的分离、检测就在此薄层色谱板上进行。 一般选用适当规格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄层板规格有：10cm×20cm、5cm×20cm、20cm×20cm等。称取适量硅胶，加进0.2％～0.5%羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na），充分搅拌均匀，进行制板。一般来说10cm×20cm的玻璃板，3～5g硅胶/块；硅胶与羧甲基纤维素钠的比例一般为1：2～1：4。制好的玻璃板放于水平台上，留意防尘。在空气中自然干燥后，置1l0℃烘箱中烘0.5～lh，取出，放凉，并将其放于紫外光灯(254nm)下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。 ⑵点样 用微量进样器进行点样。点样前，先用铅笔在层析上距末端lcm 处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，假如要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm.底线距基线1～2．5cm，点间间隔为lcm左右，样点与玻璃边沿间隔至少lcm，为防止边沿效应，可将薄层板两边刮往1～2cm，再进行点样。 ⑶展开 将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定间隔后，取出薄层板，样品组分固移动速度不同而彼此分离。 ①展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加进足够量的展开剂；或者在壁上贴两条与室一样高、 宽的滤纸条，一端浸进展开剂中，密封室顶的盖。 ②展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。 ③薄层板点样后，应待溶剂挥发完，再放人展开室中展开。 ④展开应密闭，展距一般为8～15cm。薄层板放进展开室时，展开剂不能没过样点。一般情况下，展开剂浸进薄层下真个高度不宜超过0.5cm。 ⑤展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用。 ⑥展开后的薄层板用适当的方法，使溶剂挥发完全，然后进行检视。 ⑦Rf值一般控制在0.3～0.8，当Rf值很大或很小时，应适当改变活动相的比例。 ⑷斑点的检出 展开后的薄层板经过干燥后，常用紫外光灯照射或用显色剂显色检出斑点。对于无色组分，在用显色剂时，显色剂喷洒要均匀，量要适度。紫外光灯的功率越大，暗室越暗，检出效果就越好。 展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比移值(Rf值)来表示。化合物斑点中心至原点的间隔与溶剂前沿至原点的间隔的比值就是该化合物的Rf值。 ;.

实验十一 色素的分离(层析法)

实验十一色素的分离(层析法) 一、目的要求 1．进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。 2．学会用层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识。 二、实验原理 层析分离技术是一种物理分离方法，按分离原理的不同，层析法可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、亲和层析等数种方法。按操作方式的不同，又可分为柱型、薄层和纸型。在本实验中采用柱吸附层析法分离叶色素，由于叶色素中各色素被吸附剂吸附的程度不同以及它们被溶剂溶解的能力不同，所以在层析柱中向下移动的距离不同而得以分离。 用适当的溶剂如石油醚、甲醇、丙酮、苯等，可将绿叶中的色素（叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素）提取出来，提取液通过吸附柱将其中的各种色素分开，吸附柱常用蔗糖、碳酸钙、氧化铝等吸附剂制成。 三、实验器材 抽滤瓶、研钵、带托玻璃棒、层析柱(20㎝×1㎝)、分液漏斗、烧杯，具塞试管。 40 ℃烘干的菠菜叶、脱脂棉 四、实验试剂 1.石油醚 2.甲醇 3.苯 4.无水硫酸钠 5.细粉状蔗糖 6.无水碳酸钙 7.氧化铝 8.海砂 五、操作步骤 1．取烘干的菠菜叶1 g置于研钵中，加少许海砂研碎。浸入含有22.5 mL 的石油醚、2.5 mL苯和7.5 mL甲醇的混合溶剂中，放置约1 h。 2．将上述溶液置于分液漏斗中，加5 mL水轻轻上下颠倒数次，静置后弃去水层（其中溶有甲醇），应避免剧烈振荡，否则发生乳化现象。将剩余的液体通过装有无水硫酸钠（5 g）的漏斗过滤除去水分，即得到色素提取液(必要时可在通风橱中小心浓缩)。提取液于干燥的试管中保存，并用塞子将试管塞紧。 3．取层析柱1支（也可用25 mL酸式滴定管代替），在下端塞上一块脱脂棉，将约2 g细粉状氧化铝装入柱中，每装少许就用带托的玻璃棒压紧，尤其四周要与柱壁紧密相接，不得留有空隙。装到3 cm高为止。用同样的方法装入约2.5 g 细粉状碳酸钙，高度为5 cm，然后再用同样的方法将约3.5 g的细蔗糖粉末装入柱内，高度为7 cm。最后在蔗糖上面再放一块脱脂棉，将准备好的吸附柱装在抽滤瓶上(见图实-3)。

层析分离技术

第六章层析分离技术 第一节吸附 一、吸附层析的原理与特点 吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面，而从混合物中的分离的的过程。 典型的吸附过程包括四个步骤： 固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小， 因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 吸附的类型 （1）物理吸附: 放热，可逆，单分子层或多分子层，选择性差 （2）化学吸附: 放热量大，单分子，选择性强 （3）交换吸附: 吸附剂吸附后同时放出等当量的离子到溶液中 物理吸附与化学吸附的特点 吸附法特点 （1）不用或少用有机溶剂 （2）操作简便、安全、设备简单 （3）生产过程pH 变化小 （4）从稀溶液分离溶质 （5）吸附剂对溶质的作用小 （6）吸附平衡为非线性 （7）选择性较差 吸附法的应用 气体过滤 水处理

脱色、除臭 目标产物的分离 二、吸附剂（固定相）的选择 吸附剂通常应具备以下特征： ?表面积大、颗粒均匀、 ?对被分离的物质具有较强的吸附能力 ?有较高的吸附选择性 ?机械强度高 ?再生容易、性能稳定 ?价格低廉。 常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。 羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等属前者，活性炭属后者 人工合成的如大网格吸附剂、分子筛等两种都有。但大多属非极性的常用的吸附剂 1大网格聚合物吸附剂： 2活性碳：助滤，脱色，去热原 使用:偏酸性(pH 5-7),加热(50-60℃)搅拌30min 活性白土：脱组胺类过敏物，脱色。 硅藻土：助滤，澄清 1.大网格聚合物吸附 树脂的网络骨架 大网格树脂吸附法 Ⅰ. 基本概念 一．什么是大网格树脂吸附法？ 将多孔的大网格吸附树脂作为吸附剂，利用表面分子与物 质分子间范德华引力，把液相中物质吸附到吸附树脂表面。 ◆大网格树脂吸附法与离子交换法的比较： 相同：①操作方法：静态法、动态法； ②骨架结构：树脂均有溶胀孔隙和永久孔隙的大 网格骨架结构。 区别 介质不同： 离交法－离交树脂，骨架上接有离子交换基团，利用表面层 和孔隙中离子基团起作用； 吸附法－吸附树脂，无离交基团（称白球），利用外表面和

柱层析分离的实验方法和技巧

柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二：关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm ×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。

薄层层析的原理与操作

薄层层析的原理与操作 薄层色谱，或称薄层层析(thin-layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采用。 一、基本原理 薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。 物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值(后面介绍Rf值)对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。 薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟;混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0.01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。 二、固定相支持剂的选择和处理 在薄层层析时，对支持剂的选择主要考虑两方面：一是支持剂的性质与适用范围;二是支持剂的颗粒大小。一般来说，所选吸附剂应具有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力;所选吸附剂与溶剂及样品组分不会发生化学反应。吸附力的强弱规律可概括如下：吸附力与两相间界面张力的降低成正比，某物质溶液中被吸附的程度与其在溶剂中的溶解度成反比。极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。同族化合物的吸附程度有一定的变化方向，例如，同系物极性递减，而被非极性表面吸附的能力将递增。

层析分离技术.

F t V R R ?=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术 色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。 按固定相的基质（载体）类型分类： 层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。 色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。也有人将层析称为色谱。 用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。 层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。 高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。 色层分离过程包含两部分： ●固定相：载体或载体+功能基团 ●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。 液相色谱的基本原理和参数 ●保留时间(t R )和保留体积(V R ) 从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。 理论塔板数的计算公式为：2)(σR t N = 容量因子k ' 和平衡常数K 某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量= ) /)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。于是有 溶质在固定相停留的时间分数= ' 1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)' 11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反 比： R o R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+=' 0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。 塔板高度（H ）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP 或H)。 理论塔板数的计算公式为： 式中R t 为标准偏差。 理论塔板高度为： 式中， L ? 柱长。 m u 2)(σR t N =L H =m R V V =00'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-=

层析分离法.

第三章层析分离法 1. 主要教学目标：学习和掌握柱色谱、纸色谱和薄层色谱法的原理、技术和应用。 2. 教学方法和手段：采用板书及与多媒体课件相结合，课堂上师生互动，采用启发式和提问式的教学方式，并且课堂上学习的表现记入学生的平时成绩。 3. .教学重点及难点：柱层析及基本理论；纸色谱 色谱法又称层析法，是一种广泛应用的分离方法。 色谱分析法是在1906年由俄国植物学家Tsweet首先系统地提出，他将叶绿素的石油醚液流经装有CaCO3的管柱，并继续以石油醚淋洗时，发现由于CaCO3对于叶绿素中各种色素吸咐能力的不同而使它们彼此分离，于是管中出现不同颜色的谱带，如图3─1所示。 图3-1 Tsweet的色谱工作图 尤如光谱一样，这样就有可能对它们进行定性分析和定量测定，于是他将这种彩色分层物定义为层析谱，而将这种分析方法称为色谱分析法。色谱法(Chromatograph)这—名词是由希腊字“Chroniatus”(颜色)和“graphein”(记录)二字合并而成。并发表了“植物界的色素”专论。到1931年，Kuhn和Leaerer又成功地适用Tsweet的方法分离了植物的色素，才使这一方法得到公认和广泛应用。 1935年人工合成离子交换树脂后，为离子交换色谱的广泛应用提供了物质基础。 1938年苏联的Izmailo等创立了薄层色谱法，主要是用于药物分析，应用于无机物分析则是50年代末才开始的。应用于稀土元素的分离是1964年由Pterce开始的。

1941年Martin和Synge首先介绍了分配色谱法，并将蒸馏塔板理论应用于色谱分离中，使色谱方法在理论上向前推进了一步。 1944年Consden，Cordon和Martin首先开始了纸色谱法，Martin和Synge并用此法成功地分离了氨基酸的各种成份，获得1952年的诺贝尔奖。 1947年美国的Boyd和Spedng等人发表一系列论文，报告他们应用离子交换色谱法分离裂变产物和稀土元素混合物的情况。 1952年Martin和Games开创了气一液色谱的新领域。20世纪60年代末，法国的G.Aubouin和美国的Scott等人同时各自创立了高压液相色谱法，它与分光光度、库仑、电导、荧光等方法联用，可使分离和检测实现自动化。 到目前为止，各种色谱还在不断发展，色谱设备日益完善，操作技术不断突破，色谱分析法已成为近代化学中最重要的分离分析手段之一。 色谱法有许多分支，但在色谱分析过程中总是由一种流动相(例如Tsweet工作的石油醚)，带着被分离物质(如叶绿素)流经固定相(如CaCO3)，从而使分离物中各组分分离。它有许多分类方法。 按流动相和固定相性质不同分类 流动相固定相色谱分析法种类 固体气固色谱法 气体气相色谱(气相层析) 液体气液色谱法 固体液固色谱法 液体液相色谱(液相层析) 液体液液色谱法 按操作形式分类 ①柱色谱：柱色谱顾名思义就是将固定相(如硅胶、氧化铝、氧化铝、碳酸钙、淀粉、纤维素)，离子交换(树脂等)装人一根被称为色谱柱的玻璃瓶中，这种色谱柱通常又称为“层析柱”或“分离柱”。

薄层层析方法与注意问题

薄层层析 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析；同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析。 薄层层析的操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需15-30min，分辨力比纸层析高10-100倍，它既能分离0.01μg的微量样品，又能分离500mg 基至更多的样品作制备用。薄层的制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响。其缺点是Rf值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想。 一、支持剂的选择与处理 薄层层析的支持剂种类很多。使用时应根据欲分离物质的种类进行选择。 支持剂颗粒大小要适当。颗粒大，展开速度快。但颗粒过大时，分离效果不好；而颗粒过小，则展开速度太慢，容易出现拖尾现象。一般有机类支持剂如纤维素粉的颗料为70-140目(直径0.1-0.2mm)，薄层厚度为1-2mm；无机类支持剂如氧化铝、硅胶等的颗粒一般为150-300目，薄层厚度为0.25-1mm。 在薄层层析中，使用较多的是硅胶、氧化铝等吸附剂，其处理方法同吸附柱层析。同样，用离子交换剂，凝胶过滤剂等为支持剂时，支持剂均要按柱层析处理填料的相应方法处理。 二、薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可以直立展开，而软板只能接近水平展开。

层析技术的应用

层析技术的应用

层析技术的应用 一、层析技术的原理和分类 （一）层析技术的原理 层析法是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。 层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。 （二）层析法分类见表16-5～7 （三）层析法的特点与应用 表16-5按两相所处状态分类 流动相 液体气体 液体液-液层析法气-液层析法 固定相 固体液-固层析法气-固层析法 层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层

析图。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。 表16-6按层析原理分类 名称分离原理 组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力吸附层析法 不同 各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不分配层析法 同 固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不离子交换层析法 同 固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶层析法 凝胶上受阻滞的程度不同 固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲亲和层析法 和力的其它组份分离 表16-7按操作形式不同分类 名称操作形式 柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离 将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流薄层层析法 动相展开，使各组份分离 用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组纸层析法 份分离 将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析薄膜层析法 方法进行物质的分离

薄层色谱中展开剂的选择分解

薄层色谱中展开剂的选择 2007-04-05 02:03 （一）有机合成中展开剂的选择 做有机合成时走板子是常有的事，展开剂的选择就至关重要了。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷<己烷<苯<乙醚

薄层层析方法与注意问题

薄层层析 薄层层析是将作为固定相地支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜地溶剂展开，从而使样品各组分达到分离地层析技术.如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时地主要依据是分配系数地不同，则称之为薄层分配层析；同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析. 薄层层析地操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需，分辨力比纸层析高倍，它既能分离μ地微量样品，又能分离基至更多地样品作制备用.薄层地制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响.其缺点是值地重现性比纸层析差，对生物大分子物质地分离效果不大理想.资料个人收集整理，勿做商业用途 一、支持剂地选择与处理 薄层层析地支持剂种类很多.使用时应根据欲分离物质地种类进行选择. 支持剂颗粒大小要适当.颗粒大，展开速度快.但颗粒过大时，分离效果不好；而颗粒过小，则展开速度太慢，容易出现拖尾现象.一般有机类支持剂如纤维素粉地颗料为目(直径-0.2mm)，薄层厚度为-2mm；无机类支持剂如氧化铝、硅胶等地颗粒一般为目，薄层厚度为-1mm. 在薄层层析中，使用较多地是硅胶、氧化铝等吸附剂，其处理方法同吸附柱层析.同样，用离子交换剂，凝胶过滤剂等为支持剂时，支持剂均要按柱层析处理填料地相应方法处理. 二、薄层板地制作 支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、干燥. 常用地薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分.在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等)，调成糊状物所制成地薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成地薄层板为软板.硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可以直立展开，而软板只能接近水平展开. 资料个人收集整理，勿做商业用途 薄层板常用地制作方法有： .浸涂法：将玻璃板在调好地支持剂浆液中浸一下，使浆液在玻璃板上形成薄层. .喷涂法：用喷雾器将调好地浆液喷在玻璃板上，形成薄层. .倾斜涂布法：将调好地支持剂浆液倒在玻璃板上，然后将玻璃板前后左右倾斜，使支持剂漫布于整块玻璃板上而形成薄层. .推铺法：在一根玻璃棒地两端适当距离处分别绕几圈胶布条，胶布条地圈数视所需薄层厚度而定，然后把准备好地支持剂倒在玻璃板上，用玻璃棒压在玻璃板上，将支持剂均衡地向一个方面推动，而制成薄层. 推铺法既适用于干板地涂布和湿板制作.其他方法只能用于湿板制作. 湿板制作中地一个重要环节是调浆，一般支持剂与蒸馏水或缓冲液之比一般为∶至∶ .调浆时要调和均匀，但不宜用力过猛，以免产生气泡而影响分离效果. 薄层板涂好后，让其自然干燥后方能使用.若为吸附薄层层析，制好板后还需加热活化，目地是使其减少水分而具有一定有吸附能力. 资料个人收集整理，勿做商业用途 三、层析方法 .点样 点样操作与纸上层析相似.点样前，先将制好地薄层修整一下，然后在距一端2cm左右处划一原线，并每隔2cm左右划一原点.样品用合适地溶剂溶解，吸附薄层层析一般用氯仿、乙醇等有机溶剂溶解，不宜用水溶解.点样可用微量注射器，或微量吸管、毛细管.点样量一般在μ 之内，点样体积不宜超过μ.样品液可直接点在薄层板地原点上.也可点在圆形滤纸片

糖类的提取分离与薄层层析分析

糖类的提取分离与薄层层析分析 实验简介：薄层层析(thin layer chromatography,TLC)是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪酸、脂肪类、糖类、磷脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。本实验是从水果中提取单糖、双糖和多糖组分，采用硅胶G薄层层析法分析糖类成分。 一、实验目的 1、了解并初步掌握从水果中分离提取单糖、蔗糖及淀粉的原理。 2、学习薄层层析的一般操作及定性鉴定的方法。 二、实验原理 1、单糖及多糖的提取 凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。因此，单糖和双糖一般可用热水或乙醇将其提取出来。 多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有复杂的生理功能。多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。 2、薄层层析 薄层层析的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。 糖的分离鉴定可用吸附层析或分配层析，吸附层析常用的吸附剂为硅胶，分配层析常用的支持剂是硅藻土。在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上。硅胶G是一种已添加了黏合剂—石膏(CaSO4)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄板上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。若采用硼酸溶液代替水调制硅胶G制成的薄板可提高糖的分离效果。 薄层层析的展层方式有上行、下行和近水平等。一般常采用上行法，即在具有密闭盖子的玻璃缸(即层析缸)中进行，将适量的展层溶剂倒于缸底，把点有样品的薄层板放入缸中即可(如图1所示)。保证层析缸内有充分展层溶剂的饱和蒸汽是实验成功的关键。

分离纯化蛋白质的方法及原理

（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有： 1、溶液的pH； 2、离子强度； 3、介电常数； 4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀： 原理： 蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶： 原理： 低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的

自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法： 与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分 离纯化蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。 4、温度对蛋白质溶解度的影响： 在一定温度范围内，约0~40℃之间，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加，在40~50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。 （三）根据电荷不同

层析分离技术

第四节层析分离技术 层析法又称色谱法，色层法或层离法(chromatography)，是广泛应用的一种生物化学技术。层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相的称为气相层析。 按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型： 吸咐层析：利用吸咐剂表面对不同物质吸咐性能的差异进行分离。 分配层析：利用不同物质在流动相和固定相之间的分配系数或溶解度不同，使物质分离。 离子交换层析：利用不同物质对离子交换剂亲和力不同而分离。 凝胶层析：利用某些凝胶对不同分子量的物质阻滞作用不同进行分离，亦称分子筛层析。 亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。 层析法采用的方式主要是柱层析和薄层层折，前者将固定相或载体装入柱内，使被分离的物质沿一个方向移动而达到分离，后者将吸附剂涂布成薄层，使样品在薄层上进行分离。 一、吸附层析 氧化铝，硅胶等物质具有吸咐其它一些物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同。吸附力的强弱，除与吸附剂本身的性质有关外，也与被吸附物质的性质有关。 (一)柱层析法 柱层析是用一根玻璃管。管内加吸附剂粉末，用溶剂湿润后，即成为吸咐柱，然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A和B，则二者被吸咐在柱上端，形成色圈，样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流动而移动，最后达到分离。 在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如被吸附的A粒子被溶解随溶剂下移，但遇新的吸附剂，又将A吸附，随后，新溶剂又使A溶解下移。由于溶剂与吸附剂对A与B的溶解力与吸附力不完全相同。A 与B移动的距离也不同，连续加入溶剂，连续分段收集洗脱液。各成分即可顺序洗出。

薄层色谱法实验报告 ()

实验报告 一、实验目的 掌握薄层色谱的基本原理及其在有机物分离中的应用。 二、实验原理 有机混合物中各组分对吸附剂的吸附能力不同，当展开剂流经吸附剂时，有机物各组分会发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前，而吸附力弱的组分则滞后，由于各组分不同的移动速度而使得她们得以分离。物质被分离后在图谱上的位置，常用比移值R f表示。 三、实验仪器与药品 5.0cm×15.0cm硅胶层析板两块，卧式层析槽一个，点样用毛细管。 四、物理常数 五、仪器装置图 “浸有层析板的层析槽”图 1-层析缸，2-薄层板，3-展开剂饱和蒸汽，4-层析液 六、实验步骤

（1）薄层板的制备： 称取2～5g层析用硅胶，加适量水调成糊状，等石膏开始固化时，再加少许水，调成匀浆，平均摊在两块5.0×15cm的层析玻璃板上，再轻敲使其涂布均匀。（老师代做！）固化后，经105℃烘烤活化0.5h，贮于干燥器内备用。 （2）点样。 在层析板下端2.0cm处，（用铅笔轻化一起始线，并在点样出用铅笔作一记号为原点。）取毛细管，分别蘸取偶氮苯、偶氮苯与苏丹红混合液，点于原点上（注意点样用的毛细管不能混用，毛细管不能将薄层板表面弄破，样品斑点直径在1~2mm为宜！斑点间距为1cm） （3）定位及定性分析 用铅笔将各斑点框出，并找出斑点中心，用小尺量出各斑点到原点的距离和溶剂前沿到起始 实验注意事项 1、铺板时一定要铺匀，特别是边、角部分，晾干时要放在平整的地方。 2、点样时点要细，直径不要大于2mm,间隔0.5cm以上，浓度不可过大，以免出现拖尾、混杂现象。 3、展开用的烧杯要洗净烘干，放入板之前，要先加展开剂，盖上表面皿，让烧杯内形成一定的蒸气压。点样的一端要浸入展开剂0.5cm以上,但展开剂不可没过样品原点。当展开剂上升到距上端0.5－1cm时要及时将板取出，用铅笔标示出展开剂前沿的位置。 讨论：

薄层色谱法

薄层色谱，或称薄层层析(thin—layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。 薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在流动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。 物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生

平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 薄层层析有许多优点：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟；混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，它既适用于只有0．01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。