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纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸

目的和要求

掌握分配层析的原理,学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。

原理

层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时,各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱,故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体,显示了这一分离技术的高度分辩力,从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来,层析技术的发展越来越快,五十年代开始,相继出现了气相色谱和高压液相层析,其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便,样品用量可大可小,既可用于实验室分离分析,又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。

根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类:1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析;2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析;3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。

纸层析所依据的原理是分配层析,故属于分配层析的范畴。

㈠分配层析

分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内,再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱,同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相,把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内,需要有一种固体物质把它吸牢,这种固体物质本身对分离无作用,对溶质也几乎没有吸附能力,称为支持物。进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同,因此当流动相移动时,不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快,在固定相中溶解度大的组分移动就慢,结果得以分离。

显然,分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同,分配系数(α)的定义是:α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L)

滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素,其–OH基为亲水性基团,可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。通常把有机溶剂作为流动相(L)。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后,该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中,有机溶剂作为流动相自上而

下移动,称为下行层析;反之,使有机溶剂自下而上移动,称为上行层析。流动相流经支持物时即可与固定相对溶质进行连续的抽提,物质在两相间不断分配的结果即得到分离。滤纸层析原理还可进一步解释如下:把滤纸看成一个层析柱,后者由多个连续的微板层构成,与溶剂饱和水一道组成固定相;某有机溶剂用作流动相。当第一层流动相中加入分配系数不同的单位量A、B两物质后,各溶质即可根据一定的分配系数在两相中进行分配,而随着流动相继续向下层移动,各层固定相与新流下的流动相之间会不断进行新一轮的分配。如此继续抽提下去,A、B两物质就可以完全分开。显然,各物质分配系数相差越大,则越易分开。

物质分离后在图谱上的位置可用比移值Rf来表示,Rf值的定义是:从溶质层析的起点(原点)到层析斑点中心的垂直距离与从原点到溶剂流动的前沿的垂直距离的比值:

Rf = 原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

两相体积比在同一实验情况下是不变的,所以Rf值的主要决定因素是分配系数(α)。由于每一物质在一定条件下α值是固定的,因此Rf值为其特征常数,可做为定性鉴定的参考数值。

㈡影响Rf值的主要因素

1. 物质结构对于Rf值的影响:“物以类聚”,极性物质易溶于极性溶剂(水)中,非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多,因此Rf值低于后者。

2. 溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响:这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键,对分配系数的影响就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地与溶质形成氢键。某些溶剂(例如酚,正丁醇等)是质子的供体,而水既是质子的供体又是质子的受体。当溶质结构中增加能接受质子的基团(例如-NH2)时,因酚与水都能给-NH2提供质子,所以酚和水两相对接受质子的基团的引力,基本上是一致的,因此当溶质结构中增加氨基时,该物质与酚和水的作用对其在酚和水两相间的分配影响不大,对Rf值影响较小。又例如当有机溶剂是质子的受体(如三甲基吡啶等),而溶质也是质子的受体(如-NH2基),这时有机溶剂对-NH2没有引力,而水却有引力,于是水的引力就大于有机溶剂,因此溶质就被水拉向水相,对Rf值的影响就大。

3. pH对Rf值的影响:这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大,解离度越大,极性越强,极性强的物质在两相溶剂中分配时,偏向于极性强的一相,这样,改变pH就会同时改变分配系数,从而使Rf也会相应变化。在氨基酸的层析法中,改变溶剂的pH,使酸性和碱性氨基酸的Rf值变动较大,而中性氨基酸的Rf值变动较小。在正丁醇中加甲酸,可使酸性氨基酸的极性降低,从而使Rf值变大,而使碱性氨基酸的Rf变小。反之,如在正丁醇中加氨,可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小,而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的Rf值变大。

4. 滤纸对Rf值的影响:滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大,所以

不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异,质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致,随着纤维的纹理流动紊乱,另一方面纸的含水量不均一,也不能得到理想的分离效果。

5. 温度对Rf值的影响:Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同,因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些,有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格,敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变,所以Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的,室温可在20℃至40℃,温度改变不超过±0.5℃。

无色物质的层析图谱可用光谱法(如核苷酸类物质用紫外光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂有茚三酮、吲哚醌。本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH,时间影响较大。如果要使结果重复,必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。样品中含大量盐时显色点上会出现白斑,空气中其它的杂质如氨,硫化氢或酚等皆会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物,颜色较稳定,用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点,可以通过比色法定量测定氨基酸含量。由于纸上层析设备条件较简单,操作比较简便,并可以分离微量样品,因此纸层析方法已成为生化分析和研究的主要方法之一,广泛应用于氨基酸、肽、核苷酸,糖、维生素以及脂肪酸等的分离鉴定。

操作步骤

标准氨基酸纸上层析(单向上行层析)

滤纸:选用国产新华1号滤纸(若有较多的样品需在纸上分离,可采用新华3号滤纸),戴上橡皮手套,将滤纸裁剪成28cm×28cm,在距纸边2cm处,用铅笔轻轻划一条线,于线上每隔适当距离画一小圆圈作为点样处,圈直径不超过0.5cm。

点样:点样要合适,样品点的太浓,斑点易扩散或拉长,以致分离不清,氨基酸的点样量以每种氨基酸含5~20μg为宜,将准备好的滤纸平铺在实验台上,用点样管(也可用血色素管代替)吸取氨基酸样品10μg(1μg/μL),与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心,这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内,点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴,为使样品加速干燥,可使用吹风机吹干。记下点样位置(标样及混合样)。

将点好样品的滤纸两侧比齐,用线缝好,揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐,影响Rf值。

展层及显色:配制酸性溶剂系统(20 ml/份):正丁醇:80%甲酸:水=15:3:2(体积比),加入茚三酮显色液并混匀。

将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁),盖好钟罩进行展层(60~90 min),当溶剂展层至距离滤纸上沿约1cm时,取出滤纸,立即用铅

笔标出溶剂前沿位置,置烘箱烘干至显色。

标准氨基酸Rf值的计算:用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离,求出此值,即得某特定氨基酸的Rf值。

依据各标准氨基酸的层析位置推断混合样品中含有哪些成份。

注意事项:

(1)使用茚三酮显色法时应在整个层析操作中避免手直接接触层析纸,因为手上常常有少量含氮物质,显色时亦呈现紫色斑点而污染层析结果,因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。

(2)为了鉴定未知样品中某几种氨基酸的存在,仅用一种溶剂系统展层通常是不够的。一船应采用2~3种溶剂系统展层,显色后再分别与这些溶剂系统的标准氨基酸图谱比较以相互印证,才能作出比较确切的结论。

试剂和器材

试剂

1. 若干种氨基酸标准液(1mg/mL)

2. 氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)

3. 0.5%茚三酮丙酮溶液(显色)

4. 正丁醇(需重蒸,沸程:116~120℃)。

5. 80%甲酸

器材

新华滤纸培养皿(直径115mm) 电热鼓风干燥箱吹风机

点样管针、线、尺橡皮手套钟罩

思考题

1. 为什么在展层时有时用一种溶剂系统,而有时用两种溶剂系统?

2. 酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?

3. 滤纸上点上1μl l0.02mol/L 的甘氨酸(分子量=75)溶液,请问实际上点了多少

微克的氨基酸?

4. 该实验中有哪些因素可能会影响到氨基酸的层析效果?

附1:分配层析原理

αA = 1 αB = 1/3

1st次分配2nd次分配3rd次分配

纸层析法分离氨基酸

显然,分配系数愈小(流动相溶解度愈大)则移动愈快,反之亦然

附2:层析图谱

R f = X/Y Y

X1 X2

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