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各生理指标的测定方法

各生理指标的测定方法
各生理指标的测定方法

各生理指标的测定方法

一、脯氨酸含量的测定

1.茚三酮法

1.1原理

在正常环境条件下,植物体内游离脯氨酸含量较低,但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时,植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍,并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。

用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。

1.2步骤

试剂:(1)25%茚三酮:茚三酮------------0.625g

冰乙酸------------15ml

6mol/L磷酸--------10ml

70°C水浴助溶;

(2)6mol/L磷酸:85%磷酸稀释至原体积的2.3倍;

(3)3%磺基水杨酸:磺基水杨酸------3g

加蒸馏水至------100ml

实验步骤:

(1)称取0.1g样品放入研钵,加5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆,100°C沸水浴15min;

(2)冰上冷却,4000rpm离心10min;

(3)提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀,100°C沸水浴30min,冰上冷却;

(4)加4ml甲苯混合均匀,震荡30s,静置30min;

(5)以甲苯为空白对照,再520nm下测定吸光值。

1.3计算方法

脯氨酸含量(μg/gFW)= X * 提取液总量(ml)/

样品鲜重(g)*测定时提取液用量(ml)*10^6

公式中:X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg)

提取液总量---------------------------5ml

测定时提取液用量---------------------2ml

问题及质疑:

1.酸性体系下,脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色,再实验过程中,仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。

2.经查看文献资料,反应步骤已经是优化的,没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物,消除了多余未反应的茚三酮,磺基水杨酸,提取液中其他杂质(如色素)以及PH变化

的干扰。

3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析:

(1)反应体系的PH控制很重要,保持酸性环境,否则,反应产物的最大吸光值并不在520nm。(2)极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大,材料干重比新鲜材料多数倍,加相同量的茚三酮,反应程度应该有所不同。而脯氨酸含量少的样本,容易受到各种因素的干扰。

二、丙二醛含量的测定

1.原理

植物在逆境下遭受伤害(或衰老)与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关,膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛(MDA)是膜脂过氧化最重要的产物之一,因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度,以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸(TBA)反应产生红棕色的产物3,5,5′-三甲基恶唑2,4-二酮(三甲川),该物质在532 nm处有一吸收高峰,并且在660nm处有较小光吸收。由于醛、可溶性糖对此反应有干扰,在450 nm处有一吸收峰,用双组分分光光度法加以排除。

2.步骤

试剂:(1)10%三氯乙酸(TCA):TCA--------------25g

加ddH2O至---------250ml

(2)0.6%硫代巴比妥(TBA):TBA------------0.6g

加5%TCA至---------100ml

实验步骤:

(1)称取材料0.1g,加10% TCA 2ml研磨至匀浆,再加8ml进一步研磨;

(2)4000rpm离心10min,取上清至新管;

(3)2ml提取液+2ml 0.6% TBA,混合均匀,2ml ddH2O+2ml 0.6% TBA为空白对照;

(4)混合沸水浴15min,冰上冷却;

(5)4000rpm 离心10min ;

(6)取上清再532nm ,600nm ,450nm 波长下的光密度值。 3. 计算方法

式中,Vt :提取液总体积(mL )----------------10ml ; Vs :测定用提取液体积(ml )-------------2ml ; FW :样品鲜重(g )---------------------0.1g 。 注意事项:

1.可溶性糖与TBA 显色反应的产物在532 nm 也有吸收(最大吸收在450 nm ),当植物处于极度干旱时可溶性糖含量会增高,必要时要排除可溶性糖的干扰。

2.低浓度的铁离子能增强MDA 与TBA 的显色反应,当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+(最终浓度为0.5 nmol · L-1)

3.如待测液浑浊,可适当增加离心力及时间,最好使用低温离心机离心。

三、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法

【原理】

过氧化氢酶(CAT )属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

22==R(Fe +3+OH -

)

22O 2==R(Fe +2)2+2H 2O+O 2

据此,可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的H 2O 2溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H 2O 2

5H 2O 2+2KMnO 4+4H 2SO 4 5O 2+2KHSO 4+8H 2O+2MnSO 4

即可求出消耗的H 2O 2的量。 【仪器和用具】

研钵;三角瓶50ml ×4;酸式滴定管(10ml );恒温水浴;容量瓶25ml ×1。 【试剂】

10% H 2SO 4;0.2mol/L 磷酸缓冲液pH7.8;

0.1mol/L 高锰酸钾标准液:称取KMnO 4(AR )3.1605g ,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ,用0.1mol/L 草酸溶液标定;

0.1mol/L H 2O 2:市售30% H 2O 2大约等于17.6mol/L ,取30% H 2O 2溶液5.68ml ,稀释至1000ml ,用标准0.1mol/ KMnO 4溶液(在酸性条件下)进行标定;

0.1mol/L 草酸:称取优级纯H 2C 2O 4 ·2H 2O 12.607g ,用蒸馏水溶解后,定容至1L 。 【方法】

1.酶液提取取小麦叶片

2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转入容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2.取50ml三角瓶4个(两个测定两个对照),测定瓶中加入酶液2.5ml,对照瓶中加入煮死酶液2.5ml,再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2,同时计时,于30℃恒温水浴中保温10min,立即加入10% H2SO4 2.5ml。

3.用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H2O2,至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。

4.结果计算:

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示:

酶活(mgH2O2/gFW·min)=().

A B V

FW V t

T

-??

??

17

1

式中A—对照KMnO4滴定毫升数;

B—酶反应后KMnO4滴定毫升数;

V T—酶液总量(ml);

V1—反应所用酶液量(ml);

W—样品鲜重(g);

1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。

【注意】

所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

四、植物叶绿素含量的测定(分光光度法)

一、原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比,即A=αCL 式中:α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm时,α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种:叶绿素a 和b,两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小,比值高则大,比值小则反之。

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料:新鲜(或烘干)的植物叶片。

(二)仪器设备:1)分光光度计;2)电子顶载天平(感量0.01g);3)研钵;

4)棕色容量瓶; 5)小漏斗;6)定量滤纸;7)吸水纸; 8)擦境纸;9)滴管。(三)试剂:1)95%乙醇(或80%丙酮);2)石英砂;3)碳酸钙粉。

三、实验步骤

(1)取新鲜植物叶片(或其它绿色组织),擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。

(2)称取剪碎的新鲜样品 0.2g ,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml 95%乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。静置3~5min。

(3)取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。

(4)用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml,摇匀。

(5)把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内,以95%乙醇为空白,在波长663nm和645nm下测定吸光度。

四、(4)95%乙醇为空白对照,在645nm、663nm、652nm波长下测定光密度值。

1.3 计算方法

D663=82.04Ca +9.27Cb

D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位:g/mL)

CA= 12.72D663– 2.59D645

CB= 22.88D645– 4.68 D663

CT = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位:mg/L)

Chl(mg/g叶)= C(mg/L)*提取液总量(L)*稀释倍数/FW(g)

注意事项:

(1)避光。

(2)时间控制,研磨以及放置时间不宜过长。

(3)叶绿素一定要提干净,以免造成误差。

叶绿素a、b的总含量 = 8.02?OD663 + 20.20?OD645 注意:1.叶绿素一定要提干净,避免造成测定误差

2.叶绿素初提液体积不要太多,以免浪费试剂,如果浓度太高可进行适当稀释

六、种子淀粉酶活性的测定

一【原理】

几乎所有植物中都存在淀粉酶,尤其是萌发的禾谷类种子,淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键,作为淀粉分解的起始酶而起主要作用;其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖;β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键,水解产物为麦芽糖,并能使一部分糊精糖化。

两种淀粉酶具有不同理化特性,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化;β-淀粉酶不耐热,在70℃下15min则被钝化。据此,在测定时钝化其中之一,就可以测定出另一种酶的活力,本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力,再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较,求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

二【仪器与用具】

分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;具塞刻度试管(25ml×13);吸管(1ml,2ml,5ml各1支);容量瓶(50ml×2)。

三【试剂】

1)麦芽糖标准液(1mg/ml):称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100ml;

2) 3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20ml 2mol/L NaOH溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞,勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用;

3)0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液:配制方法如下:

A液(0.1mol/L柠檬酸)—称取分析纯柠檬酸21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L;

B液(0.1mol/L柠檬酸钠)—称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L;

取A液55ml与B液145ml混匀,即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液;

4) 1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

以下按论文顺序:

1材料

1.1材料取自大润发超市

1.2方法

1.2.1材料处理

发芽处理时,称取干种子40克,放在烧杯里用水浸润2小时以上,浸好后放在垫有纱布的培养皿上,种子上面再放浸湿的一层纱布,盖好,放在30度的培养箱里培养。每培养一天,要对种子及纱布进行水投处理。

1.2.2标准曲线测定取试管7个编号,分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml)0.0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml,然后加蒸馏水使各管都达到2.0ml。再各加入3,5-二硝基水杨酸2.0ml,置沸水浴中5min,冷却后再用蒸馏水稀释至25ml,即再加蒸馏水21 ml。在520nm处测其吸光值(A)。

以麦芽糖浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标作曲线,即为麦芽糖的标准曲线。

1.2.3 样品的测定

1.2.3.1酶液的提取称取1g样品研磨成匀浆,取10ml蒸馏水用以研磨和洗涮研钵,移入离心管后在室温下放置15~20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取。在3000rpm转速下离心5min,取上清液倒入50ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液5ml,放入50ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀粉酶稀释液。

1.2.3.2淀粉酶活性的测定取4支试管编号,先取2支,测定α-淀粉酶活性,于每管中各加入酶提取液1.0ml。各管在70度恒温水浴中预热15min。取出迅速冷却。再取另2支,测定总淀粉酶活性,于每管中各加入酶稀释液1.0ml。在四个试管中均加入1.0mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。并均置40度恒温水浴15min,

再分别在各管中加入40度预热的淀粉溶液2.0ml,混匀,立即放入40度水浴中保温15min,以促进酶促反应,再向各管中迅速加入4.0ml0.4mol/LNaOH,以终止酶的活性,然后准备测定。(为便于操作可参考下列表1)

再取各管的处理溶液2.0ml,放入25ml试管中,再加入2.0ml 3,5-二硝基水杨酸试剂,混匀。置沸水浴中5min,冷却后再用蒸馏水稀释至25ml。在520nm处测其吸光值(A)。并将1和2管,3和4管计算平均值。

然后由此平均数值从标准曲线中查出相应的麦芽糖含量(mg)。

1.2.3.3计算

1)α-淀粉酶活性(麦芽糖mg/g鲜重5min)=α-淀粉酶麦芽糖含量×样品稀释体积/样品重(g)×显色时所用酶液体积

2)总淀粉酶活性(麦芽糖mg/g鲜重5min)=总淀粉酶麦芽糖含量样液稀释体积/样品重(g)×显色时所用酶液体积

附:样液稀液体积(α-淀粉酶为50ml,总淀粉酶为500ml);样品重为1克。显色时所用酶液体积25 ml

附表1:淀粉酶测定操作步骤表

表1 淀粉酶测定操作步骤表

七、可溶性糖含量的测定

1.蒽酮法

1.1原理

糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在可见光吸收峰位620nm。

测定对象:几乎可以测定所有的碳水化合物,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应,所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量)。

1.2 步骤

试剂:(1)浓硫酸;

(2)蒽酮乙酸乙酯试剂:蒽酮------------1g

加乙酸乙酯至----50ml

实验步骤:

(1)称取样品0.1g,置于研钵中,加4ml ddH2O研磨成匀浆,8ml ddH2O洗涤研钵。

(2)100°C沸水浴10min,冰上冷却。

(3)4000rpm离心10min。

(4)取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。

(5)1ml提取液+ 1ml ddH2O+0.5ml蒽酮+5ml浓硫酸,轻轻混合均匀,100°C沸水浴10min,冰上冷却。

(6)620nm处测吸光值。

1.3 计算方法

可溶性糖含量% = C*V/(W*10^6)*100%

V为植物样品稀释后的体积(ml)------100ml

C为提取液的含糖量(μg/ml)--------根据标准曲线计算

W为植物组织鲜重量(g)-------------0.1g

问题及质疑:

1.目标糖含量:

标准曲线是用葡萄糖位标准制作的,而蒽酮法是测总糖的量,包括己糖、戊糖,浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖,将总糖得出的OD值代入由单一糖做出的标准曲线,有一定误差存在。注:查看所有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。

2.误差分析:

(1)不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖最浅造成误差。

(2)蒽酮试剂溶解度较低,非常容易析出,在反应时加入糖的水溶液中,出现浑浊现象,影响反应进行。(3)介于以上原因,将上清5ml转移至100ml容量瓶定容,稀释程度过大,当糖含量少的时候,大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。

方案修改意见:

1.首先,做五到六组空白,测试分光光度计误差程度。

2.增加平行组数,由三组增加至五组,减少每个样品测试次数。

改变测试样品定容量,由100ml变为50ml。

八、植物体内可溶性蛋白质含量的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时,常以比活(酶活力单位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制剂纯度。因此,测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。本实验将分别介绍这两种方法。

一、考马斯亮蓝法

【原理】

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色,当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(0~100μg/ml),蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1h内保持稳定。该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,所以是一种比较好的蛋白质定量法。

【仪器与用具】

分光光度计,10ml量筒1支;研体;10ml容量瓶1支;1ml刻度吸管3支;10ml具塞刻度试管14支。

【试剂】

(1)牛血清白蛋白配成1000μg/ml和100μg/ml;

(2)考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 90%乙醇中,加入85%

(W/V)磷酸100ml,最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液在常温下可放置一个月;

(3)90%乙醇;(4)磷酸(85%,W/V)。

【方法】

1.标准曲线的绘制

(1)0~100μg/ml标准曲线的制作取6支试管,按表28-1数据配制0~100μg/ml 血清白蛋白液各1ml。准确吸取所配各管溶液0.1ml,分别放入10ml具塞试管中,加入5ml 考马斯亮蓝G-250试剂,盖塞,反转混合数次,放置2min后,在595nm下比色,绘制标准曲线。

表28-1 配制0~100μg/ml血清白蛋白液

管号 1 2 3 4 5 6

100μg/ml牛血清蛋白量(ml)

蒸馏水量(ml)

蛋白质含量(mg)

1.0

0.2

0.8

0.02

0.4

0.6

0.04

0.6

0.4

0.06

0.8

0.2

0.08

1.0

0.10

(2)0~1000μg/ml标准曲线的制作另取6支试管,按表28-2数据配制0~1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。与步骤(1)操作相同,绘出0~1000μg/ml的标准曲线。

表28-2 配制0~1000μg/ml血清蛋白血液

管号7 8 9 10 11 12

1000μg/ml牛血清白蛋白(ml)

蒸馏水量(ml)

蛋白质含量(mg)

1.0

0.2

0.8

0.2

0.4

0.6

0.4

0.6

0.4

0.6

0.8

0.2

0.8

1.0

1.0

2.样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取样品提取液0.1ml(样品提取见各酶活测定),放入具塞刻度试管中(设两个重复管),加入5ml考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后在595nm下比色,记录吸光度值,通过标准曲线查得蛋白质含量。

3.结果计算

样品蛋白质含量(mg/g鲜重)=W a V

C

式中C-查标准曲线所得每管蛋白质含量(mg);

V-提取液总体积(ml);

a-测定所取提取液体积(ml);

W-取样量(g)。

九、植物细胞质膜透性的测定

一、目的

植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面,对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。但植物常受到外界不良因子的影响,而不同植物种类其抗逆性则不同。用电导仪率法测定植物质膜透性的变化,可作为植物抗逆性的生理指标之一。本实验主要测定低温对

细胞质膜透性的影响,并掌握用电导仪法测定植物细胞质膜透性的原理及方法。

二、原理

植物细胞的细胞质由一层质膜包围着,这种质膜具有选择透性的独特功能。植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。如极端的温度、干旱、盐渍,重金属离子(如Cd2+等)和大气污染物(如SO2、HF、O3)等都会使质膜受到不同程度的损伤,其表现往往为细胞膜透性增大,细胞内部分电解质外渗,外液电导率增大。该变化可用电导仪测定出来。细胞膜透性变得愈大,表示受害愈重,抗性愈弱,反之则抗性愈强。

三、材料、仪器设备

1.材料:植物叶片。

2.仪器设备:电导仪;电子天平;冰箱;真空泵;真空干燥器;恒温培养箱;电炉;50ml 烧杯;50ml量筒;小镊子;纱布;表皿;滤纸条;镜头纸;剪刀;玻棒;胶头滴管;瓷盘。

四、实验步骤

1.清洗用具

所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗,然后用自来水、蒸馏水洗3次,干燥后备用。

2.实验材料的准备及处理

选取叶龄相似的植物叶片,剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗,除去表面沾污物,再用蒸馏水冲洗1~2次,用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分,然后剪成约1cm2的小叶片(或用直径为1的打孔器钻取小园片),注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀,快速称取鲜样三份,每份1g,分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理:A杯放入冰箱0℃以下作低温处理,处理15~30min后取出(供试叶片也可以在实验前低温处理好待用,处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定),加入蒸馏水50ml。

B杯常温处理,加入蒸馏水50ml。

将A、B二杯放入真空干燥器,用真空泵抽气20—30min(以抽出细胞间隙中的空气),然后缓缓放入空气,从真空干燥器中取出A、B杯。

C杯加入蒸馏水50ml,称重,盖上表皿,置于电炉上煮沸10~15min(煮沸时间依不同植物叶片而定),冷却后再称重并加蒸馏水至原重量,继续浸泡叶片。

将A、B、C三杯放置室温下浸提1 h左右(经常摇动,以有利电解质外渗)。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。

3.电导率测定

用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率,同时测定蒸馏水(空白)的电导率(注意:每测定完一个样液后,用蒸馏水漂洗电极,再用滤纸将电极擦干,然后进行下一个样液的测定),所测得的结果记入下表:

电导率测定记录表

C(煮沸)

五、结果计算

按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率:

处理电导率-空白电导率

电解质的相对外渗率(%)=——————————————× 100

煮沸电导率-空白电导率

十、过氧化物酶活性的测定(比色法)

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

在有过氧化氢存在的条件下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,该物质在 470 nm 处有最大吸收,可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。

一、仪器、药品与材料

(一)实验材料

新鲜植物组织。

(二)仪器与用品

分光光度计,研钵,恒温水浴锅,100 mL 容量瓶,吸管,高速冷冻离心机,秒表,磁力搅拌器。(三)试剂

1.愈创木酚。

2.30%过氧化氢。

3.100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0 (见附录7)。

4.反应混合液:取100 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)50 mL 于烧杯中,加入愈创木酚28 μL,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 30 % 过氧化氢 19 μL,混合均匀,保存于冰箱中备用。

二、实验步骤

1.称取植物材料 0.1 g ,剪碎,放入研钵中,加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次,以 4000 rpm 低温离心 15 min ,上清液即为粗酶液,定容至10 mL刻度,贮于低温下备用。

2.取2支试管,于1只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液1mL,作为对照,另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释之)。迅速将两支试管中溶液混匀后,倒入比色杯,置于分光光度计样品室内,立即开启秒表记录时间,于470 nm 处测定吸光度(OD)值,每隔10S读数一次。3.结果计算:以每分钟OD变化值(ΔA470 / gFW min)表示酶活性大小,。也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。

过氧化物酶活性(U/gFW·min)= ΔA470×VT/W×VS×0.01×t

式中:

ΔA470——反应时间内OD变化值。

VT ——提取酶液总体积(mL)。

W ——植物鲜重(g)。

Vs ——测定时取用酶液体积(mL)。

t ——反应时间(min)。

十一、呼吸速率的测定

一、实验目的:掌握小篮子法测定植物呼吸速率

二、实验原理:

植物进行呼吸作用放出CO2,计算一定植物样品在单位时间内放出CO2数量,即为该样品的呼吸强度。呼吸作用的强弱即呼吸速率的大小是植物生命活动最重要的指标之一。一般地说,呼吸速率大表示新陈代谢旺盛,呼吸速率小则说明代谢活动弱,植物呼吸速率的大小因植物类型、组织种类、生育期的差异而不同,也受着外界环境的影响。测定呼吸速率的方法很多,如红外线CO2分析法,氧电极法,瓦氏呼吸仪法,呼吸瓶法等。本实验采用广口瓶与小篮子测定呼吸速率的方法。植物进行呼吸时吸收O2,放出CO2,计算一定的植物样品在单位时间内放出CO2的数量,即为该样品的呼吸速率。植物材料呼吸过程中释放的CO2可用氢氧化钡溶液吸收。实验结束后,用草酸溶液滴定剩余碱量,由空白和样品二者消耗草酸溶液的之差即可计算出呼吸过程中释放的CO2量。

三、仪器、药品与材料

(一)实验材料

橘子生毛豆熟毛豆

(二)仪器与用品

500ml广口瓶,天平,酸碱滴定台与酸式滴定管,量筒,天平,钟表,温度计,干燥管,尼龙网制小篮。

(三)试剂

1.0.05 mol/L左右的Ba(OH) 2:称取8.6 g Ba(OH)2溶于1000 mL蒸馏水中,密封保存。2.1/44 mol/L 草酸溶液:准确称取2.8651 g重结晶的H2C2O2?2H2O溶于蒸馏水中并定容至1000 mL。

3.酚酞指示剂:称取1 g酚酞溶于100 mL 95%乙醇中,并贮于滴瓶中。

二、实验步骤

1.取500 mL广口瓶一个,瓶口用打有二孔的橡皮塞塞紧,一孔插一盛碱石灰的干燥管,使呼吸过程中能进入无CO2的空气,另一孔直径约1 cm,供滴定用,平时用一小橡皮塞塞紧。瓶塞下方挂一小篮,以便装植物样品(也可用单层纱布包裹种子代替)。

2.向瓶中准确加入约0.05 mol/L 的Ba(OH) 2溶液20 mL,立即塞紧橡皮塞(不加样品),充分摇动广口瓶2 min,待瓶内CO2全部被吸收后,拔出小橡皮管塞,加入酚酞指示剂2滴,把滴定管插入孔中,用标准草酸溶液进行空白滴定,直到红色刚刚消失为止。记录所用草酸溶液体积V0 mL。

3.倒出废液,用无CO2的蒸馏水(煮沸过的)洗净后,重加上述Ba(OH) 2溶液20 mL,同时称取植物样品20~30 g,装入小篮子中,挂于橡皮塞下,塞紧瓶塞,并用熔化的石蜡密封瓶口,防止漏气。开始记录时间,每过10min左右,轻轻地摇动广口瓶数次,使溶液表面的BaCO3薄膜被破坏,以利于充分吸收CO2。1小时后,小心打开瓶塞,迅速取出小篮,加1~2滴指示剂,立即重新盖紧瓶塞混匀,然后拔出小橡皮塞,把滴定管插入小孔中,用草酸滴定,直到红色刚刚消失为止。记录所用草酸溶液体积V1mL。

4.结果计算

(1)计算公式:

植物呼吸速率Rn=(Ci-C0)/h?m?V0

h为时间(10min),m为质量,V0规定为=4.5升,C0为初值CO2浓度(%),Ci为终值CO2浓度(%)

(2)数据记录及处理:

5.结果分析

先测定初值二氧化碳的浓度,再测定终值二氧化碳的浓度,后者减前者则为样品呼吸作用产生的二氧化碳的值。由实验结果可见,橘子的呼吸速率比新鲜毛豆的呼吸速率弱,表示新鲜毛豆的新陈代谢强度大于橘子的。熟毛豆的呼吸速率测得为0,因为,毛豆被煮熟后,失去生理活性,代谢过程停止,不能进行呼吸作用,所以测得的二氧化碳的初值和终值相等。不过,实验过程中存在许多误差:a.称量样品时不够精准;b.广口瓶口封得不够严,可能有漏气现象;c. BaCO3吸收CO2不够充分等。

十二、植物根系活力的测定

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官,根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。本实验学习测定根系活力的甲烯蓝法。

【原理】

根据沙比宁等的理论,植物对溶质的吸收具有表面吸附的特性,并假定被吸附物质在根系表面形成一层均匀的单分子层;当根系对溶质的吸附达到饱和后,根系的活跃部分能将吸附着的物质进一步转移到细胞中去,并继续产生吸附作用。在测定根系活力时常用甲烯蓝作为吸附物质,其被吸附量可以根据吸附前后甲烯蓝浓度的改变算出,甲烯蓝浓度可用比色法测定。已知1mg甲烯蓝形成单分子层时覆盖的面积为1.1m2,据此可算出根系的总吸收面积。从吸附饱和后再吸附的甲烯蓝的量,可算出根系的活跃吸收表面积,作为根系吸收活力的指标。【材料、仪器与试剂】

1.材料:植物根系。

2.仪器及用具:分光光度计;移液管;烧杯;比色管。

3.试剂:0.01 mg?mL-1甲烯蓝溶液;0.0002 mol?L-1(0.075 mg?mL-1)甲烯蓝溶液。

【方法与步骤】

1. 甲烯蓝标准曲线的制作按表2-1用0.01 mg?mL-1甲烯蓝溶液配制系列标准溶液,于660 nm处测定吸光度,以甲烯蓝浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

表2-1 甲烯蓝系列标准溶液的配制

2. 将待测的植物根系洗净沥干,浸在装有一定量水的量筒中,用排水法测定根系的体积(或用体积计测定)。

3. 将0.0002 mol?L-1的甲烯蓝溶液(每毫升溶液中应含0.075 mg甲烯蓝,为消除溶液配制和比色误差,其含量需要重新进行比色,查标准曲线确定)分别倒入3个小烧杯中,编号,每个烧杯中溶液体积约10倍于根系的体积。准确记下每个烧杯中的溶液量。

4. 将洗净的待测根系,用吸水纸小心吸干,然后依次浸入盛有甲烯蓝溶液的烧杯中,每杯中浸1.5 min,注意每次取出时,都要使根上的甲烯蓝溶液流回到原杯中去。

5. 从3个小烧杯中各吸取甲烯蓝溶液1 mL,用去离子水稀释10倍后,于660 nm处测定吸光度,根据标准曲线,查得各杯浸根后甲烯蓝的浓度。

【结果与计算】

(1)总吸收面积(m2)=[(c1—c1’)×v1+(c2—c2’)×v2]×1.1

(2)活跃吸收面积(m2)= [(c3—c3’)×v3]×1.1

(3)活跃吸收面积%=根系活跃吸收面积(m2)/根系总吸收面积(m2)×100%

(4)比表面积(cm2·cm-3)= 根系总吸收面积(cm2)/根体积(cm3)

式中c:各杯未浸泡根系前的甲烯蓝浓度(mg?mL-1);

c’:各杯浸泡根系后的甲烯蓝浓度(mg?mL-1);

v:各杯中的溶液量(mL)。

最新植物生理指标测定方法

实验一植物叶绿素含量的测定(分光光度法) (张宪政,1992) 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比,即A=αCL式中:α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位,液层厚度为1cm时,α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。高等植物中叶绿素有两种:叶绿素a 和b,两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小,比值高则大,则反之。 二、材料、仪器设备及试剂 试剂:1)95%乙醇(或80%丙酮) 三、实验步骤 称取剪碎的新鲜样品0.2~0.3g,加乙醇10ml,提取直至无绿色为止。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内,以95%乙醇为空白,在波长663nm和645nm下测定吸光度。四、实验结果按计算 丙酮法(Arnon法)【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的计算】 叶绿素a的含量(mg/g)=(12.71?OD663 – 2.59?OD645)V/1000*W 叶绿素b的含量(mg/g)=(22.88OD645 – 4.67OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量(mg/g)=(8.04?OD663 +20.29?OD645) V/1000*W 按Inskeep公式 叶绿素a的含量(mg/g)=(12.63?OD663 – 2.52?OD645)V/1000*W 叶绿素b的含量(mg/g)=(20.47OD645 – 4.73OD663) V/1000*W 叶绿素a、b的总含量(mg/g)=(7.90?OD663 + 17.95?OD645) V/1000*W

生理指标测定实验方案设计设计汇总情况情况

预测指标: 1?抗氧化酶系统、MDA 2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基 3. 叶绿素、类胡萝卜素 4. 可溶性糖 5. 游离氨基酸 6. 过氧化氢 7. 谷胱甘肽、ASA 1. 抗氧化酶系统、MDA A酶活测定 试剂: PBS 缓冲液0.05M (pH 7.8 ):取0.663g NaH2PO4 ? 2H2O 16.384g Na2HPO4 ? 12H2O , 加PVPIOg,并加EDTA或者EDTA盐,使其浓度为2mM,加蒸馏水定容至1L。用前冰箱或冰上预冷。样品制备 鲜样0.1-0.5g加入1 ml磷酸缓冲液(0.05M , pH 7.8 ),稍许石英砂,研磨成匀浆;移入 10 ml离心管中,再用4ml磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中;10000 X g 4 C 下离心20 min ;上清夜贮于4 C冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份(0.1g左右)烘干称重。 试剂配制: 实验步骤: 2.725mL反应液+ 250uL蒸馏水+ 25uL酶液【样品管】 2.75mL反应液+ 250uL蒸馏水(光照作为100%CK )【照光对照管】 2.75mL反应液+ 250uL蒸馏水(黑暗作为调零)【空白调零管】 4000IX日光灯下反应20分钟,560nm比色。反应温度25~35 C。 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50 %为一个酶活性单位表示按下式计算SOD 活性:SOD 总活性=(Ack —AE)*V/ (0.5*Ack*w*Vt ) (式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示,Ack为照光对照管的吸光度,AE为样品管的吸光度,V为样品液的总体积ml , Vt为测定时样品用量ml , w为样品鲜重g)

植物生理生化测定

2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5% NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养,培养条件为27±1℃,每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后,取其叶片测定其SOD 活性,每个样品设3次重复,求其平均数,并进行多重比较。 2.1.8.1主要试剂及配方 (1)0.1 mol/l pH 7.8磷酸钠(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液 A液(0.1 mol/l Na2HPO4溶液):称取Na2HPO4·12H2O 7.163 g,用少量蒸馏水溶解后定容至200 ml,4℃冰箱中保存备用; B液(0.1 mol/l NaH2PO4溶液):称取NaH2PO4·2H2O 0.780 g,用少量蒸馏水溶解后定容至50 ml,4℃冰箱中保存备用; 取上述A液183 ml与B液17ml充分混匀后即为0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液,4℃冰箱中保存备用。 (2)0.026 mol/l甲硫氨酸(Met)磷酸钠缓冲液 称取甲硫氨酸(C5H11NO2S)0.388 g,用少量0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液溶解后,再用相同磷酸钠缓冲液定容至100 ml,现用现配,4℃冰箱中保存可用1~2 d。 (3)7.5 × 10-4 mol/l NBT溶液 称取NBT(C40H30Cl2N10O6)0.153 g,用少量蒸馏水溶解后,定容至250 ml,现用现配,4℃冰箱中保存可用2~3 d。 (4)含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液 A液:称取EDTA 0.003 g,用少量蒸馏水溶解; B液:称取核黄素0.075 g,用少量蒸馏水溶解; C液:合并A液和B液,定容至100 ml,此溶液即为含0.1 mmol/l EDTA的2 mmol/l 核黄素溶液,避光保存(可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好),4℃冰箱中可保存8~10 d,当测定SOD酶活时,将C液稀释100倍,即为含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液。 (5)含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液50 ml,加入2 g PVP(聚乙烯吡咯烷酮),充分溶解后移入100 ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀,4℃冰箱中保存备用。 2.1.8.2提取及测定方法 (1)称取1.0 g样品叶片于预冷的研钵中,加入4 ml预冷的提取介质(含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液),冰浴研磨匀浆,转入10 ml离心管,并用提取介质定容至

常用运动生理学实验操作流程

常用运动生理学实验操作流程体育系运动人体科学实验中心

人体安静、运动时脉搏、血压的测定 [实验目的] 了解人体动脉血压测定的原理,学会人体在安静时和运动前后脉搏及血压的测定。 [实验原理] 血压的测定,最常用的是间接法。通过使用血压计在动脉外加压,根据血管音的变化测定血压。通常血液在血管内流动时并没有声音,如果对血管施加压力,使血管腔变窄而形成血液涡流时可发生血管音。当外加压力超过动脉血压的收缩压时,受压部位的血流完全被阻挡,此时在受压部位的远侧听不到声音。当外加压力低于收缩压而高于舒张压时,血液则可断续地通过受压部位使血流形成涡流而发出声音。当继续降低压力时,且外加压力等于舒张压时,受压部位的血流由断续流动恢复到持续流动,受压部位远侧的声音则由强变弱或突然消失。因此,动脉血流刚能发出声音时的最大外加压力相当于收缩压,而动脉内血流声音突变后消失时的外加压力则相当于舒张压。正常成人安静时心率约在60—-100次/分。心率常受年龄、性别、生理状况、训练水平、体力劳动及体育运动的影响。在实践中通过测定血压、心率可了解受检查者循环系统的功能,了解运动量、运动强度、运动训练对人的影响、运动后的恢复情况、运动的密度。 [实验对象] 人体 [实验器材]

血压计、听诊器、秒表、电子节拍器 [实验步骤] 一、安静时脉搏血压的测定 (一)脉搏的测定 1.扪诊法桡动脉扪诊法:在测试安静脉搏时较为方便。 颞浅动脉扪诊法:位于耳前部略偏上,颞浅动脉经过此处,适合于运动后。 心前区扪诊法:位于左心前区心尖部,适合于运动后。 颈动脉扪诊法:位于胸锁乳头肌前、下颌角下部。 2.器械法 听诊法:用听诊器在心前区直接听诊,计算心率。 心率遥测仪:可准确记录运动中和运动后心率。 (二)安静时动脉血压的测定。 1.将脉压带绑在被试者的上臂,其下缘应距肘关节上约2--3厘米,松紧以能放入一指为宜。 2.在肘窝内侧找到搏动点,将听诊器头紧贴肘窝肱动脉处。 3.把气球的气门旋紧打气,随脉压带内的压力升高,逐渐可以听到有节奏的“咚咚”声,继续打气等声音消失时再使压力升高20--30毫米汞柱或2--4千帕,然后旋开气门徐徐放气。 4.在放气时注意听有节奏的“咚咚”声响的第一声出现时,水银面所指示的压力即为收缩压。 5.继续放气,随压力逐渐下降,听到突然变声或声音消失时,水银面

测定各生理指标的试验方法

测定各生理指标的试验方法 1.4.1 电导率的测量(浸泡法)[5] 取大小相当的植物叶片(尽量保证叶片的完整性,少含茎节),用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分,将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉),快速称取鲜样,每份0.1g,分别置于10ml去离子水的刻度试管中,盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理12h,用电导仪测定浸提液电导(R1),然后沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀,再次测定浸提液电导(R2)。根据公式:相对电导率=R1/R2×100% 算出电导率。 1.4.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定(氮蓝四唑法)[5] 取各株植物相同部位的叶片(去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使最终体积为5ml。取1.5~2ml于4000r/min 下离心10min,上清液即为SOD粗提取液。取32支试管(30支测定管,2支对照管),分别加入1.5ml0.05mol/l磷酸缓冲液、0.3ml130nmolMet溶液、0.3ml750μmol/l NBT溶液、0.3mol100μmol/l EDTA液、0.3ml20μmol/l核黄素、0.05ml酶液(其中2支对照管以缓冲液代替酶液)、0.25ml蒸馏水,混匀,将一支对照管置于暗处,其他各管于4000lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时缩短,低时延长)。反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其他各管的吸光度。 计算公式:SOD总活性(U/g)=[(A CK -A E )×V]/(0.5×A CK ×W×Vt) 注:SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示(U/g);A CK 为照光对照管的 吸光度;A E 为样品管的吸光度;V为样品液总体积(ml);Vt为测定时样品用量(ml);W为样品鲜质量(g)。 1.4.3 过氧化物酶(POD)活性的测定(愈创木酚法) [5] 酶液提取:取5.0g植物叶片,洗净,剪碎,放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中,于3000rmp离心10min,上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取2次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,低温下保存备用。分别在各试管中加入0.05mol/l磷酸缓冲液 2.9ml,2%H2O21.0ml,0.05mol/l愈创木酚1.0ml和0.1ml酶液来制备酶活性测定

植物生理生化指标测定

小黑豆相关生理指标测定 1.表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重:取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量,每个测6个重复。 株高:取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度,记录,每个测6个重复。 主根长:取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最远点长度,记录,每个测6个重复。 叶面积:取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面积,叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长,测叶片最窄处长度作为叶的宽,叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。 2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA)和H2O2含量测定 样品处理:取0.5g样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净),速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入1.5ml的Tris-HCl(pH7.4)抽提,将抽提液转移到2ml的EP管中,于4℃,12000rpm离心15min,取上清,保存在-20℃下,上清液可用于总蛋白、丙二醛(MDA)、可溶性糖和H2O2含量测定。 总蛋白测定(Bradford法):样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样品),空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford)。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量,X代表OD595),计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定:样品反应体系(1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液);空白对照(1ml蒽酮+180ul ddH2O),测定OD625后带入标准曲线:Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625,X代表可溶性糖含量(ug)) 蒽酮配方:称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸(76ml浓硫酸+30mlH2O).注意:浓硫酸加入水中时,一点一点递加,小心溅出受伤。 丙二醛(MDA)测定:在酸性和高温条件下,丙二醛可与硫代巴比妥(TBA)反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮,在532nm处有最大吸收波长,但该反应受可溶性糖的极大干扰,糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收,但其最大吸收波长在450nm处。采用双组分分光光度法,可计算出MDA含量。MDA的计算公式为:MDA(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450. 反应体系为:400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品,80℃水浴10min后,测OD532和OD450。对照用Tris-HCl. 0.6%TBA配方:称取硫代巴比妥0.6g,溶于少量1M NaOH中,待其完全溶解后用10%TCA(称取10gTCA三氯乙酸,溶于100ml蒸馏水中,待其溶解即可)定容至100ml。 H2O2测定(二甲酚橙法):样品反应体系(82ul溶液A+820ul溶液B (A:B=1:10)+150ul样品提取液),30℃水浴30min,测OD560。标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560,X代表H2O2含量)

植物生理生化指标测定(精)

小黑豆相关生理指标测定 1. 表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重 :取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量,每个测 6个重复。 株高 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度,记录,每个测6个重复。 主根长 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最远点长度,记录,每个测6个重复。 叶面积 :取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面积,叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长, 测叶片最窄处长度作为叶的宽, 叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测 6个重复。 2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量测定 样品处理:取 0.5g 样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净 ,速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4℃, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20℃下,上清液可用于总蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含量测定。 总蛋白测定(Bradford 法 :样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 , 空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准曲线 Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定:样品反应体系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul样品提取液 ; 空白对照 (1ml 蒽酮 +180ul ddH2O , 测定 OD625后带入标准曲线 : Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量(ug

植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定 在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有:合成纤维素组成细胞壁;转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等;分解产物是其他许多有机物合成的原料,如糖在呼吸过程中形成的有机酸,可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸;糖类作为呼吸基质,为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用,所以是营养中最基本的物质,也是需要量最多的一类。 Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖 一、原理 糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖的定量测定。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖含量,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应),所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ,故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 (一)实验材料 任何植物鲜样或干样。 (二)试剂 1. 80 %乙醇。 2. 葡萄糖标准溶液(100 μg/mL ):准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖,溶于蒸馏水并定容至100 mL ,使用时再稀释 10 倍( 100 μg/mL )。 3 .蒽酮试剂:称取 1.0 g 蒽酮,溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释,把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中) 1000 mL 中,冷却至室温,贮于具塞棕色瓶内,冰箱保存,可使用 2 ~ 3 周。 (三)仪器设备 分光光度计,分析天平,离心管,离心机,恒温水浴,试管,三角瓶,移液管( 5 、 1 、0.5 mL ),剪刀,瓷盘,玻棒,水浴锅,电炉,漏斗,滤纸。 三、实验步骤 1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ~ 1.0 g (或干样粉末 5 ~100 mg ),放入大试管中,加入15 mL 蒸馏水,在沸水浴中煮沸20 min ,取出冷却,过滤入100 mL 容量瓶中,用蒸馏水冲洗残渣数次,定容至刻度。 2. 标准曲线制作取 6 支大试管,从 0 ~ 5 分别编号,按表 24-1 加入各试剂。 表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量 将各管快速摇动混匀后,在沸水浴中煮10 min ,取出冷却,在620 nm 波长下,用空白调零测定光密度,以光密度为纵坐标,含葡萄糖量( μg )为横坐标绘制标准曲线。 3 .样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ,同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。

各生理指标的测定方法

各生理指标的测定方法 一、脯氨酸含量的测定 1.茚三酮法 1.1原理 在正常环境条件下,植物体内游离脯氨酸含量较低,但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时,植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍,并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。 用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸的含量。 1.2步骤 试剂:(1)25%茚三酮:茚三酮------------0.625g 冰乙酸------------15ml 6mol/L磷酸--------10ml 70°C水浴助溶; (2)6mol/L磷酸:85%磷酸稀释至原体积的2.3倍; (3)3%磺基水杨酸:磺基水杨酸------3g 加蒸馏水至------100ml 实验步骤: (1)称取0.1g样品放入研钵,加5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆,100°C沸水浴15min; (2)冰上冷却,4000rpm离心10min; (3)提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀,100°C沸水浴30min,冰上冷却; (4)加4ml甲苯混合均匀,震荡30s,静置30min; (5)以甲苯为空白对照,再520nm下测定吸光值。 1.3计算方法 脯氨酸含量(μg/gFW)= X * 提取液总量(ml)/ 样品鲜重(g)*测定时提取液用量(ml)*10^6 公式中:X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg) 提取液总量---------------------------5ml 测定时提取液用量---------------------2ml 问题及质疑: 1.酸性体系下,脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色,再实验过程中,仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。 2.经查看文献资料,反应步骤已经是优化的,没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物,消除了多余未反应的茚三酮,磺基水杨酸,提取液中其他杂质(如色素)以及PH变化

生长发育生理功能指标的测量讲义.

生长发育生理功能指标的测量 一、测量脉博 测量工具:秒表、带秒针的手表或钟表。 测量方法: 由于脉搏受体力活动和情绪变化的影响较大,因此,应在安静状态下进行测量。 1. 受测者取坐位,右前臂平放在桌面,手心向上。 2. 测量者坐在对面或右侧,用食指、中指和无名指的指端触压受测者手腕部的桡动脉。 3. 测量前要先确定受测者为安静状态。即以10秒钟为单位,连续测量三个10秒钟的脉搏,若其中两次测量值相同并与另一次相差不超过一次时,即可认为受测者处于相对安静状态;否则应适当休息,直至符合要求。 4. 测1分钟的脉搏数。记录以次/分为单位。 注意事项: 1. 测量前1~2小时内,受测者不要进行剧烈的身体活动。 2. 测量前,受测者要静坐10分钟以上,互相不要打闹,保持情绪安定。 3. 触诊时,应特别注意脉搏的频率和节律与心跳的一致性。 二、测量血压 测量工具:台式水银血压计、听诊器,电子血压计(分臂式和腕式两种)。 测量方法: 由于血压受活动、体位变动、情绪等因素的影响较大,因此,在进行测量时应在安静状态下进行,通常用台式水银血压计测量右臂血压。 1. 校验 (1)打开血压计之后,扳开水银阀门,看看水银柱是否处于“0”刻度,如果不是,则应当进行校准,否则会影响测出的数值。还要观察水银柱有无气泡,如有气泡应予以排除。 (2)将球囊的开关关闭,一手压住袖带,另一手捏球囊向袖带内充气,看看水银柱是否会随

之升高,或者是否有水银中断的现象。如果不能上升或是有裂隙,就说明该血压计有漏气的情况,或者是水银量有所减少,这样的血压计就不能再用来测量了。 2. 测量 (1)受测者取坐位,右臂自然前伸,平放在桌面,掌心向上,使上臂与血压计、心脏基本处于同一水平。 (2)测量者将袖带内的空气排尽后,平整地缠在受测者的上臂,袖带下缘距肘窝2~3厘米,松紧适度,以能伸进两个手指为宜。 (3)在肘窝内侧摸到肱动脉跳动后,将听诊器的探头放在肱动脉上,使其与皮肤密切接触。切不可贪图方便省事而将其塞到袖带里面,这样会使测出的血压值比实际要高。 (4)戴好听诊器,关闭球囊开关,打气入带,使水银柱上升至肱动脉的搏动音消失,接着再往里充气,使水银柱继续上升20~30毫米汞柱。双眼保持与水银柱刻度平视。 (5)打开球囊开关,使水银柱缓缓下降,同时仔细听诊,当听到第一次脉跳声时,水银柱所指刻度便是收缩压;继续边放气边听,当声音突然变弱或消失时,水银柱所指刻度就是舒张压。 (6)放松球囊阀门,使水银柱回到零位。2分钟后,进行重测,取2次测量的平均值。记录以毫米汞柱(mmHg)为单位。如果2次测量的收缩压或舒张压读数相差>5mmHg,则相隔2分钟后再次测量,然后取3次读数的平均值。 3. 整理 测量结束后,取下袖带,挤压排尽空气,关闭球囊的开关,折叠好之后放入盒子里。一定不要忘记将血压计的盒盖向右倾斜45度,使水银完全回流槽内,再关闭水银槽的开关,阖上盒盖。如果不将水银回流,就会导致下一次使用时水银柱出现断裂,水银的挥发也会变得很快。 注意事项: 1. 测前1~2小时内,受测者不要进行剧烈的活动。 2. 测前让受测者静坐10~15分钟,稳定情绪,接受测试。 3. 测试前应检查和校正血压计的水银柱。 4. 必须选择宽度合适的袖带,以覆盖受测者上臂长的1/2~2/3为宜。袖带过宽测出血压偏低,过窄则偏高。7岁以下儿童常用8cm宽的袖带。 5. 测量时受测者需裸露手臂或只穿贴身薄衣。袖口太紧或衣服太多会导致血压值偏高。 三、测量肺活量 测量工具:浮筒式(湿式)肺活量计,电子肺活量仪。

植物生理学实验指导

植物生理学实验指导主编胡君艳陈国娟张汝民 浙江农林大学植物学科 2013年8月

实验一植物组织水势的测定 水势与渗透势的测定方法可分为3大类:⑴液相平衡法,包括小液流法、重量法测水势,质壁分离法测渗透势;⑵压力平衡法(压力室法测水势);⑶气相平衡法,包括热电偶湿度计法、露点法等。 Ⅰ小液流法 【实验目的】 了解采用小液流法测定植物组织水势的方法。 【实验原理】 水势表示水分的化学势,像电流由高电位处流向低电位处一样,水从水势高处流向低处。植物体细胞之间,组织之间以及植物体和环境间的水分移动方向都由水势差决定。 当植物细胞或组织放在外界溶液中时,如果植物的水势小于溶液的渗透势(溶质势),则组织吸水而使溶液浓度变大;反之,则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小;若植物组织的水势与溶液的渗透势相等,则二者水分保持动态平衡,所以外部溶液浓度不变,而溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液的浓度变化,然后根据公式计算渗透势。 【实验器材与试剂】 1.实验材料:八角金盘、大叶黄杨等。 2.实验试剂:0.05、0.10、0.15、0.20、0.30mol·L-1蔗糖溶液、甲烯蓝溶液。 3.实验仪器:试管10支、微量注射器、镊子、打孔器、垫板。 【实验步骤】 1.取干燥洁净的试管5支为甲组,标记1~5,各支中分别加入0.05~0.30mol·L-1蔗糖溶液5mL。另取5支干燥洁净的试管为乙组,标记1'~5',各试管中分别加入0.05~0.30mol·L-1蔗糖溶液2ml。 2.取待测样品的功能叶数片,用打孔器打取小圆片约50片(避开叶脉),混合均匀。用镊子分别夹入10个小圆片到乙组试管中。并使叶圆片全部浸没于溶液中。放置约30~60min,为加速水分平衡,应经常摇动试管。 3.到时间后,在乙组试管中加入甲烯蓝溶液1~2滴,并用微量注射器取各试管糖液少许,将注射器插入对应浓度甲组试管溶液中部,小心地放出一滴蓝色溶液,并观察蓝色小液流的

测生理指标的方法

实验路线及安排:项目主要在晋西北地区展开区域化试验,供试品种4个,均为当年生扦插苗,每个品种15株,采用完全随机区组设计进行,其中包 括4个处理,3个重复。所测定内容包括12项生理指标在相应部位(根、茎、叶)的年变化规律,并从形态、生理和生物化学方面对其抗寒抗旱性机理进行 研究探讨。 在每个小区分别选健康植株2株,每株取其中上部位叶片1-2片,组成混 合样,编号,带回实验室用一部分样品进行抗旱指标测定,其余样品放入冰箱低 温处理,处理温度为0℃、-10℃,-20℃,然后进行抗寒指标测定,每月采样 一次。根的取样方法为每个小区分别选健康植株10株,挖出其部分根系组成 混合样,处理方法同叶片;茎的取样方法为选健康植株10株,取其上部嫩茎组 成混合样,处理方法同上。2009年10月-2010年3月对所选材料进行人工 低温干旱处理,完成相关实验指标的测定工作。低温处理通过相对电导率及相 关指标评价其抗寒性;干旱处理是通过对所栽品种进行适宜土壤水分、中度干旱、严重干旱条件的人为处理,测定杨树的蒸腾速率和相应指标,评价其抗旱性。 实验方法 一.光合效率、气孔导度、蒸腾速率三项指标用光合仪直接测定; 二.水势(小液流法) 1.取10个干净的试管,分成A组和B组,都贴上0.05mol/L、0.1 mol/L、 0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L 6个不同浓度标签,并向这两组试管中分别移 取相应浓度的CaCl 2 溶液4mL。 2.取待测叶子数片,用打孔器在其上均匀打孔,混匀,将其分别装入A组试 管(每支试管装10片),摇匀,滴入一滴相同浓度的甲烯蓝溶液,再摇匀。 3.用干净的毛细移液管,吸取1~2滴蓝色溶液,小心的插入装着相同浓度的 B组试管中部,轻轻的挤出一滴蓝色溶液,观察蓝色液滴流动方向。 按下公式计算植物组织水势:Ψ=-iRTC 式中:Ψ为植物组织水势(MPa);C为CaCl2溶液的摩尔浓度(mol/L);R为摩尔气体常数,0.008314MPa·L/mol·K;T为热力学温度(K),即273+t(t为当时摄 氏温度);I解离常数(CaCl 2 =2.6) 三.叶绿素含量(直接浸提法) 80%的丙酮液的配制:4L丙酮 + 1L蒸馏水。 称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管(做三个重复),加入25ml浓度为80%的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm下测定光密度,以80%的丙酮液为空白。 按下列公式计算样品中叶绿素含量。 C A =12.72A 663 -2.59A 645 (1) C B =22.88A 645 -4.67A 663 (2) C T =C A +C B =A 652 ×1000/34.5 (3)在652nm时可一次测出叶绿素总含量 mg/g FW)=(CV T /FW×1000)n (4) 以上公式中,C A 、C B 、C A+B 分别为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的浓度(mg/L); FW为鲜重(g);C:叶绿体色素的浓度;V T 为提取液总体积(mL);n为稀释倍数。

生理指标测定

生理指标测定_16种 1、冻害指数——3~5株观察形态 【4种常绿水生鸢尾抗寒性的初步研究】张京,2012 李刚,姜卫兵,翁忙玲,等.木兰科6种常绿树幼苗抗寒性的初步研究[J].园艺学报,2007,34(3):783-786. 描述叶色变化: 在最冷月( 2月中旬) , 所有供试树种均有不同程度的冻害表现, 乐东拟单性木兰受冻害最轻,只有部分植株的少量叶片有些许水渍状, 大部分植株完好无损, 冻害指数为041, 基本不受冻害;阔瓣含笑也长势良好, 有少部分叶片出现褐色水渍状, 冻害指数为14, 受轻度冻害; 金叶含笑受到了中度水平的冻害, 部分植株的叶片整个叶面呈现红褐色水渍状, 冻害指数为25; 红花木莲、醉香含笑和观光木受到了重度冻害, 大多数植株的部分叶片呈焦黄、褐色脱落, 有的整个植株呈萎蔫状,长势非常差, 冻害指数分别为3.2、3.9、4.3. 2、相对含水量 叶片相对含水量采用饱和称重法[21]测定。选取各处理部位一致、成熟完好的叶片迅速称其鲜重,再用蒸馏水浸泡8~24 h,使组织吸水达到饱和状态,取出后吸去表面水后立即称其饱和重,然后在105 ℃下杀青30min,在80 ℃下烘干至恒重(1h~24h),放在干燥器中冷却,称其烘干重。根据公式计算:LRWC( %) = [ (鲜重-干重) /(饱和重-干重) ] × 100%

3、光合参数(光合仪测定) 光合速率、CO2浓度、光合有效辐射、叶绿素 或用95%乙醇浸泡法,浸泡4~5d,测定叶绿素。《植物生理生化实验原理和技术》 4、膜质过氧化:相对电导率(略)、MDA MDA(丙二醛)的测定 试剂:三氯乙酸10% (TCA 溶液):称取100g溶于1L 蒸馏水中; 0.6%硫代巴比妥酸溶液(6%TBA):1.8g溶于300ml TCA 溶液中(加热溶解) 称取植物叶片0.3克, 先加入2ml TCA和少量石英砂研磨至匀浆,再加入4ml 10%三氯乙酸(TCA)进一步研磨(总体积为6ml),然后以4000g离心10min, 取上清液待测。吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水),加入2ml 0.6% TBA,混匀物于沸水浴上反应15分钟,迅速冷却后再离心(在冰箱中冷却较快)。取上清液测定在532,600和450nm波长下比色。 公式C MDA (nmol L-1)=[(A532-A600)-0.0571×(A450-A600)]/0.155计算MDA量(排除多糖干扰),用每克干(鲜)重中MDA的量表示MDA的含量,单位μmol g-1干(鲜)重或nmol g-1干(鲜)重。 1、含量计算 双组分光光度计法:已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm波长下的比吸系数分别为 85.40,7.40;MDA与 TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收,其吸收系数为0,532nm下比吸 收系数为155,根据双组分光光度计法建立方程组,计算公式如下: C 1(mmol/L)=11.71 D 450 C 2 =[6.45(D 532 —D 600 ) — 0.56 D 450 ]X提取液总体积/测定时用的提 取液体积*样品鲜重 C 1:可溶性糖的浓度, C 2 为MDA的浓度, D 450 D 532 D 600 分别代表450,532,600nm下的消光度值. 参:Brege J G.Microsomal lipid peroxiodation. Methods in Ezymmology.1978,52:302-306 J.G. Buege and S.D. Aust, Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol.52(1978), pp. 302–306. 注: 沸水浴时,可使用小试管,然后上部用保鲜膜包扎.(如橡皮筋) 附4.1 MDA、可溶糖含量—硫代巴比妥酸加热显色法 【原理】植物遭遇逆境胁迫或衰老过程中,由于自由基、活性氧的积累引起膜脂过氧化,产生脂质自由基,进一步诱发膜脂连续过氧化并导致蛋白质交联变性,而引起细胞损伤或死亡。MDA 是膜脂过氧化的最终产物,通过其含量的测定可了解膜脂氧化伤害的程度,比较不同植物抗逆性的差异。 在酸性和高温条件下,MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)反应,生成红棕色的产物三甲川(3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮)。该产物在532nm处有最大吸收峰,测定反应产物在532nm处的光密度值,可计算出MDA含量。但植物组织中的可溶性糖亦与TBA产生颜色反应,其产物对532nm 光的吸收干扰测定。采用双组分光光度法及其计算式,可排除干扰,计算出MDA的含量。 【器材】分光光度计离心机水浴锅研钵剪刀试管

(完整版)逆境生理指标的测定

逆境生理指标的测定 要求:选三个指标 一、植物组织中超氧物歧化酶活性的测定 催化下列反应: 2 +2H + → H 2O 2 + O 2 反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系,故成为植物逆境生理学的重要研究对象。 原理 本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT )在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 , 可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物,蓝色化合物在560nm 处有最大吸收,而SOD 可清除 从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后,反应液蓝色愈深说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计 算出酶活性大小。 试剂 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8); 130mmol/L 甲硫氨酸(Met )溶液:称1.9399g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml ; 750μmol/L 氮蓝四唑溶液:称取0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存; 100μmol/L EDTA-Na 2溶液:取0.03721g EDTA -Na 2用磷酸缓冲液定容至100ml ; 20μmol/L 核黄素溶液:取0.00753g 核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml 避光保存(当天配制)。 方法 1、酶液提取 取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g 于预冷的研钵中,加1ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml 。取2~3ml 于10000rpm 下离心10分钟,上清液即为SOD 粗提液。 2、显色反应 取5ml 试管(或指形管,要求透明度好)7支,3支试管为测定管,另4支为对照管,按表1加入各溶液。 混匀后将1支对照管置暗处,其他各管置于4000lx 日光灯下反应20min (要求各管受光情况一致,反应室的温度高时反应时间可以缩短,温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。 表1 各溶液加入量 3、蛋白浓度的计算 蛋白浓度= W a ? 单位:mg 蛋白/g 样重 c -通过标准曲线查得的每管中蛋白含量(mg ) v -样液总体积(ml ) a -测定时提取液体积用量(ml ) W -样重(g ) O 2●O 2●O 2●O 2●O 2●

植物生理测定方法

1 叶圆片放氧活性的测定 原理:同光合速率一样,叶片光合放氧速率是反应光合能力的一项重要指标,其大小本质上取决于PSII活性的大小。 称取2~3 cm2 叶片约0.2g,用打孔器2-3 mm2的小圆片后放入含有200mmol Trincine-NaOH,100 mmol NaHCO3,pH7.0 的缓冲液中,并用注射器抽真空1min 左右,使缓冲液充分渗入到叶肉细胞里,最后将叶圆片连同缓冲液转移至极谱氧电极(Hansatech,英国)的反应杯里测定放氧活性,测定在20℃及800μmol.m-2.s-1光强下进行,每个样品测定3个重复。 2 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBPCase)活性测定 原理:Rubiscase是光合作用中最重要的关键酶,它既催化RuBP羧化反应,又催化RuBP加氧反应,对植物的光合作用具有重要的调控作用。 参照李合生等[57]的方法,称取0.5g叶片加入匀浆液6ml(100mmol/L Tris-HCl 缓冲液pH7.8,10 mmol/L MgCl2,1.0 mmol/L EDTA,20 mmol/L 2-巯基乙醇,2%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨匀浆,14000g、4℃离心20min,上清液作酶液活性分析。反应液总体积为200μL,内含反应介质100mmol/L Tris- HCI 缓冲液(pH7.8)、0.4mmol/L EDTA、12 mmol/L MgCl2)93.3μL、50 mmol/L ATP、50mmol/L 磷酸肌酸,200mmol/L NaHCO3各13.3μL,160 u/ml 磷酸肌酸激酶,160 u/ml 磷酸甘油酸激酶,160 u/ml 磷酸甘油醛脱氢酶各6.7μL,5mM/L NADH,蒸馏水各13.3μL,RuBPCase提取液6.7μL 30℃恒温水浴10 min, 最后加入9 mmol/L RuBP 6.7μL反应开始,用Theymo1500型酶标仪96孔板测定340 nm下光吸收的变化。以ΔA340·min-1下降0.01为l U,每个样品测定3个重复。

第三次实验课人体多功能生理指标检测与测定一、人体心电图【实验

第三次实验课人体多功能生理指标检测与测定 一、人体心电图 【实验目的】 学习人体心电图描记方法和心电图波形的测量方法,辨认正常心电图的波形并了解其生理意义和正常值范围。 【实验原理】 人体心电图(ECG )是由人体表面一定部位记录出来的心脏电变化曲线。它反映心脏兴 奋的产生、传导和恢复过程中的生物电变化。 【实验对象】人 【器材与用品】心电图机、酒精棉球、量规。 【实验步骤】 1.准备 (1)让受试者安静,舒适地平卧在检查床上,肌肉放松。 (2)接好心电图机的电源线、地线和导联线。开启电源开关(POWER ),选择仪器记录方式AC (CHG-DC-AC ),使LINE 指示灯亮。选择灵敏度按钮(SENTITIVITY )为“1,” 走纸变速按钮(PAPER SPEED)置于“25mm/s”,“开始、调节和停止”按钮(START,CHECK ,STOP)置于“调节”,按动导联选择按钮(LEAD SELECTOR ),使导联指示灯在“Ⅱ”导联闪亮。调节基线移位滚轮,使描笔位于记录纸合适的位置。 (3)将“开始、调节和停止”按钮置于“调节”,重复按动定标按钮,1 mv 标准信号应使描笔振幅为10mm 。再将开关按至“开始”位,重复按定标按钮,在心电图纸上描记标准信号。若标准信号幅值有差异,可微调增益细调电位器。然后将“记录、观察和准备”开关拨置“调节”位。 (4)在前臂屈侧腕关节上方及内踝上方安放引导电极(胸前用吸附电极)。安放电极前,先用酒精棉球将要放置电极部位的皮肤擦净(可以改善皮肤的导电性,使心电图曲线光滑)。 (5)按电极颜色接好导联线: 2.描记 将“开始、调节和停止”开关拨向“调节”位。待描笔稳定后,即可拔至“开始”位,记录心电图波形。以后每次变换导联或更换胸前电极的位置,均按照上述步骤重复一次。 3.分折(图5-9 ) (1)辨认P波、QRS 波群、T 波、R-R 间期、P-R 间期、S-T 段及Q-T 间期。 (2)测量Ⅱ导联中上述各波段时程。心电图的纸速一般采用25mm/s,即心电图纸上横

人体生理指标大全

人体生理指标大全 温度用腋下测量正常是36-37摄氏度 心率正常是60-100次/分钟 血压正常不高于140/90mmHg,不低于90/60mmHg 血液 总血量: 65--90ml/kg, 全血比重:男1.054--1.062 女1.048--1.062 血浆:1.024--1.029 渗透(量)压 血胶体渗透压:21±3mmHg(2.80±0.40kPa) 血晶体渗透压:280--310mOsn/kg(280--310mmol/L) 红细胞数: 男(4.0--5.5)×10^12/L(4.0--5.5×10^6/ul) 女(3.5--5.0)×10^12/L(3.5--5.5×10^6/ul) 血红蛋白: 男120--160g/L(12--16g/dl)女110--150g/L(11--15g/dl) 红细胞压积: 男0.4--0.5(40--50vo%) 女0.37--0.48(37--48vol%) 红细胞平均直径: 7.33±0.29um 红细胞平均血红蛋白(H): 29.36±3.43pg(29.36±3.43uug) 红细胞平均体积(V): 93.28±9.80fl(93.28±9.80um^3) 红细胞平胞血红蛋白浓度(HC): 0.31--0.35(31--35%) 网织红细胞数: 0.005--0.015(0.5--1.5%)

红细胞平均渗透性脆性试验: 在0.44--0.47%(平均0.45%)盐液内开始溶解,在0.31--0.34(平均0.32%)盐液内全部溶解。 白细胞数: (4--10)×10^9/L(4000--10000/ul) 白细胞分类计数 中性粒细胞:0.5--0.7(50--70%) 嗜酸粒细胞:0.005--0.03(0.5--3%) 嗜碱粒细胞:0.00--0.0075(0--0.75%) 淋巴细胞:0.2--0.4(20--40%) 单核细胞:0.01--0.08(1--8%) 嗜酸粒细胞直接计数: (0.05--0.30)×10^9/L(50--300/ul) 血小板数:(100--300)×10^9/l(10--30万/ul) 出血时间:(Duke法)1--3min(lvy法)0.5--6min 凝血时间: (毛细管法)3--7min (玻片法)2--8min (试管法)4--12min 凝血酶原时间: 凝血酶原消耗时间>20sec为消耗正常 血块收缩时间: 30--60min开始回缩,18h后明显收缩,24h已完全收缩 部分凝血活酶时间: 35--45sec 凝血酶时间: 13--17sec 复钙时间: 1.5--3min 凝血活酶生成试验: 正常值在4--6min内,基质血浆凝固时间为9--11sec。病人标本

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