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实验十薄层色谱和柱色谱教学教材

实验十薄层色谱和柱色谱教学教材
实验十薄层色谱和柱色谱教学教材

实验十薄层色谱和柱色谱

1.实验目的

①了解薄层色谱和柱色谱的基本原理;

②学习用薄层色谱和柱色谱分离、纯化有机化合物的技术

2.实验原理

①色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。其基本原理是利用混合物中

各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同,或其它亲和作用性能的差异,使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用,从而将各组分分开。流动的混合物溶液称为流动相;固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。根据组分在固定相中的作用原理不同,可分为吸附色谱、分配色谱等。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;

分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。根据操作条件不同,可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。

②薄层色谱:薄层色谱属于固-液吸附色谱,是一种微量的分离分析方法,具有设备简单、

速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。适用于小量样品(几到几十微克,甚至0.01μg的分离。此法特别适用于挥发性较小或者在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。其可分为吸附色谱和分配色谱。由于不同组分被固定相吸附程度不同,在流动相中溶解程度不同,因此,不同组分移动的距离不同,因而形成了互相分离的斑点

R f=溶质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离

薄层色谱用的吸附剂和支持剂:薄层色谱常用的吸附剂或支持剂是硅胶或氧化铝。薄层色谱用的硅胶分为硅胶H不含粘合剂;硅胶G含煅石膏做粘合剂;硅胶HF-254含荧光物质,可在波长254nm紫外光下观察荧光;硅胶GF-254含有煅石膏和荧光剂。薄层色谱用的氧化铝也分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254。

薄层板的制备:简易平铺法,如称取约3g硅胶G,加入到67mL 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液中,调成均匀的糊状物(可铺78张载玻片)。这一步一定要将吸附剂逐渐加入到溶剂中,边加边搅拌;如果把溶剂加到吸附剂中,容易产生结块。然后采用和倾斜法将糊状物涂布在干净的载玻片上,制成薄层板。

薄层板的活化:涂好的薄层板室温水平放置晾干后,放入烘箱内加热活化,活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温,维持105110℃活化30min。氧化铝板在200220℃烘4h可得活性Ⅱ级的薄板。150160℃烘4h 可得活性ⅢⅣ级的薄板。薄层板的活性与含水量有关,其活性随含水量的增加而下降。注意硅胶板活化时温度不能过高,否则硅醇基会相互脱水而失活。活化后的薄层应放在干燥器内保存。

点样:将样品溶于低沸点溶剂(丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳)配成1%的溶液,用内径小于1mm管口平整的毛细管点样:用毛细管取样品溶液,在薄层板一端约1.0cm处,垂直地轻轻地接触到薄层上的吸附剂,样品溶液就可靠到薄层上。在薄层色谱中,样品的用量对物质的分离效果有很大影响,所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层的厚度均有关系。样品太少,斑点不清楚,难以观察;样品量太多,往往出现斑点太大或拖尾现象,以至不易分开。若因样品溶液太稀,可重复点样,但应

待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样,样点直径一般以24mm为宜。同一薄层上的样点直径应一致。另外点样要轻,不可刺破薄层。

展开:倾斜上升法:先将一定量展开剂放在色谱缸中,盖上缸盖,再将点好试样的薄层板样点一端朝下放入缸内,盖好缸盖,展开剂因毛细管效应而沿薄层上升,样品中组分随展开剂在薄层中以不同的速度自下而上移动而导致分离。当展开剂前沿上升到样点上方810cm时取出薄层板,放平,铅笔标明溶剂前沿位置,冷风吹干溶剂。

显色:展开的薄层板上化合物斑点本身有颜色时,可直接观察。若化合物本身无色,可在紫外灯下观察荧光斑点,也可用显色剂显色。简单常用的显色剂是碘蒸气,广口瓶中放置少量碘晶体,使用时将薄层板放入,盖上瓶盖,密封瓶内的碘蒸气即可使大部分有机化合物显色(饱和烃与卤代烃除外)。

③柱色谱:原理与薄层色谱类似,常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附柱色谱通常在

玻璃管中填入表面积很大的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集;或将柱吸干,挤出后按色带分割开,再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。

吸附剂:实验室常用氧化铝、硅胶作吸附剂。吸附剂的选择一般要根据待分离的化合物类型而定。例如硅胶的性能比较温和,属无定形多孔物质,略具酸性,适合于极性较大的物质分离;同时硅胶极性相对较小,适合于分离极性较大的化合物,如羧酸、醇、酯、酮、胺等。而氧化铝极性较强,对于弱极性物质具有较强的吸附作用,适合于分离极性较弱的化合物。酸性氧化铝适合于分离羧酸或氨基酸等酸性化合物;碱性氧化铝适合于分离胺;中性氧化铝则可用于分离中性化合物。大多数吸附剂都能强烈地吸水,且水分易被其它化合物置换,因此吸附剂的活性降低。因此吸附剂使用前一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言,粒度愈小表面积愈大,吸附能力就愈高,但颗粒愈小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。

溶质结构与吸附能力的关系:化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强,各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减:酸和碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃

溶剂:柱色谱分离中,洗脱剂的选择是重要的一环,通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。但是必须注意,选择的洗脱剂极性不能大于样品中各组分的极性。否则样品组分在柱色谱中移动过快,不能建立吸附-洗脱平衡,影响分离效果。实际操作时,一般采用薄层色谱反复对比、选择柱色谱的洗脱剂。能在薄层色谱上将样品中各组分完全分开,即可作柱色谱洗脱剂。在有多种洗脱剂可选择时,一般选择目标组分Rf 值较大的洗脱剂。一般来说,洗脱剂都需要采用混合溶剂,利用强极性和弱极性溶剂复配而成。:硅胶和氧化铝作吸附剂的柱色谱,洗脱剂的洗脱能力有如下顺序:己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸。

3.实验药品和仪器

偶氮苯的苯溶液,苏丹II的苯溶液,苏丹III的苯溶液,乙醇,石油醚,亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液

薄层板,色谱柱,漏斗,毛细管

4.实验步骤

①点样:在薄层板距一端1cm处用铅笔轻轻划一横线,取毛细管插入样品溶液中,在一块

板起点线上点偶氮苯、苏丹II、混合液三个样本点,在第二块板起点线上点偶氮苯、苏丹III、混合液,第三块板上点偶氮苯、未知样、混合液。

②在缸内配置乙醇和石油醚4:1的混合溶液作为展开剂,待样点干燥后,将薄层板放入展

开。观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm处取出,尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号,比较二者Rf值的大小。

③在色谱柱内依次加入0.5cm厚的石英砂、到柱高3/4处的氧化铝、0.5cm厚的石英砂,

填装紧密。将烧杯置于色谱柱下端,将乙醇加入色谱柱至没过表面。当液面下降至氧化铝上端表面时,加入亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液。用乙醇淋洗保持湿润,直至观察到色层带的形成和分离,改用乙醇与水的混合溶液淋洗,分层明显后再换用水淋洗。当亚甲基蓝带到达柱底时,立即换另一接收器,收集全部此色层带,然后换另一接收器收集荧光黄色层带。

5.实验注意事项

①色谱柱填装的紧密与否,对分离效果很有影响。若柱中气泡或各部分松紧不均时,会影

响渗透速率和显色均匀。但如果过分敲击,又会因为太紧密二流速太慢。

②为了保持色谱柱的均一性,使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的。否则当柱中溶

剂或溶液流干时,就会使柱身干裂,影响渗滤和显色的均一性。

6.实验数据记录与处理

7.实验思考与讨论

①在一定操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物?

答:在特定的展开剂中,Rf值几乎可以认为是物质的特性之一。取标准品和样品,如果

在两个以上的展开剂系统中,样品都有和标准品相同Rf的点,基本可以确定样品中含

有标准品。如果样品在多种展开剂中,都显示只有一个点,而这个点的Rf和标准品(或

者报道的标准品的)Rf总是相同,那么此样品就是标准品所含物质。TLC用于鉴定,是

最简便而又常用的方法之一。

②在混合物薄层色谱中,如何判定各组分在薄层上的位置?

答:薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样,主要根据样品的极性,溶解度和吸附剂的活

性等因素来考虑。凡溶剂的极性越大,则对化合物的洗脱力也越大,也就是说Rf值也

(如果样品在溶剂中有一定溶解度)。因为根据溶剂的极性,化合物的极性及Rf值,越大,

可知各组分在薄层板上的位置。

③展开剂的高度若超过了点样线,对薄层色谱有何影响?

答:这样所点试样将被溶剂所洗脱,薄层色谱无法展开。

④柱色谱中为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱?

答:根据相似相溶原理,极性大的组分在极性大的溶剂中溶解度较大,易于洗脱。

⑤柱中若留有空气或填装不均,对分离效果有何影响?如何避免?

答:造成洗脱剂流动不规则而形成沟流,引起色谱带变形,影响分离效果。向柱子中倒

入溶剂约为柱高3/4处,打开活塞,然后慢慢加入吸附剂,用木棒或带橡皮管的玻棒轻

轻敲打柱身下部,使填装紧密。

有机化学实验十柱色谱

实验十柱色谱 一.实验目的: 1. 学习柱色谱的原理及方法。 二.实验重点和难点: 1.学习柱色谱的原理及方法。 实验类型:基础性实验学时:4学时 三.实验装置和药品: 主要实验仪器:色谱柱(或25mL碱式滴定管) 25mL锥形瓶 普通漏斗玻璃棉或脱脂棉量筒试管电子天平烧杯 主要化学试剂:石油醚(600C—900C)丙酮中性氧化铝(100--200目) 500g 菠菜色素95%乙醇 四.实验装置图: 五.实验原理: 柱色谱法是色谱方法之一。 图 1 柱色谱装置色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。 (一)色谱法的基本原理: 是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配) 的不同,或其它亲 和作用的性能的差异,使混合物的溶液流经该种物质,进行反复的吸附或分配等作用,从 而将各组分分开。 (二)色谱法的分类: 1.根据组分在固定相中的作用原理不同,可分为吸附善谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。 2.根据操作条件的不同,可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相 色谱等类型。 (三)柱色谱原理: 柱色谱是化合物在液相和固相之间的分配,属于固--液吸附层析。 图1就是一般柱色谱装置。柱内装有”活性”固体(固定相) 如氧化铝或硅胶等。液 体样品从柱顶加入流经吸附柱时,即被吸附在柱的上端,然后从柱顶加入洗脱溶剂冲洗。由于固定相对各组分吸附能力不同,以不同速度沿柱下移,形成若干色带。再用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出,分别收集各组分,再逐个鉴定。 1.吸附剂:常用的吸附剂有:氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般 要经过纯化和活性处理。选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。吸 附能力与颗粒大小有关。颗粒太粗,流速快分离效果不好。颗粒小,表面积大,吸附能力 就高,但流速慢,因此应根据实际分离需要而定。色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性 三种。 2.溶质的结构与吸附能力的关系:化合物的吸附能力与分子极性有关。分子极性越强,

乙酰二茂铁的制备及柱色谱分离预习实验报告及思考题

乙酰二茂铁的制备及柱色谱分离 一.实验目的 1. 通过乙酰二茂铁的制备,理解Friedel-Crafts 酰基化反应原理。 2. 掌握机械搅拌等操作。 3. 掌握用柱色谱分离和提纯化合物的原理和技术。 二.实验原理 1.乙酰二茂铁的制备 二茂铁及其衍生物是一类很稳定的有机过渡金属络合物。二茂铁是橙色的固体,又名双环戊二烯基铁,是由两个环戊二烯负离子和一个二价铁离子键合而成,具有夹心型结构。二茂铁具有类似苯的一些芳香性,比苯更容易发生亲电取代反应。以乙酸酐为酰化剂,三氟化硼、氢氟酸或磷酸为催化剂,二茂铁可以发生Friedel-Crafts 酰基化反应,主要生成一元取代物及少量1,1′-二元取代物。二茂铁及其衍生物可作为火箭燃料的添加剂、汽油的抗爆剂、硅树脂和橡胶的防老剂及紫外线吸收剂等。 二茂铁的乙酰化可以形成乙酰二茂铁,根据反应条件,可以生成单乙酰二茂铁或者双乙酰二茂铁。由于二茂铁分子中存在亚铁离子,对氧化的敏感限制了它在合成中的应用,如不能够用混酸对其消化。制备乙酰二茂铁的反应式如下: 32 343+3H 3二茂铁 乙酰二茂铁 1,1′-二乙酰基二茂铁 在上述条件下,主要生成单乙酰二茂铁,双乙酰二茂铁很少,但同时有未反应的二茂铁。 2.柱色谱分离 本实验用柱色谱分离提纯产品。柱色谱分离提纯是根据二茂铁和乙酰二茂铁对硅胶吸附能力的差异而进行分离提纯。 柱层析是在层析柱中装入作为固定相的吸附剂,把试样流经固定相而被吸附,然后利用薄层层析中探索到的能分离组分的溶剂流经层析柱,试样中的各组在固定相和溶剂间重新分配,分配比大的组分先流出,分配比小的组分后流出,对于不易流出的组分可另选择合适的溶剂再进行洗脱,这样就可以达到各组分的分离提纯。 柱色谱(柱上层析)常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。? 吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以

薄层色谱法实验报告

实验报告 一、实验目的 掌握薄层色谱的基本原理及其在有机物分离中的应用 二、实验原理 有机混合物中各组分对吸附剂的吸附能力不同,当展开剂流经吸附剂时,有机物各组分会发生无数次吸附和解吸过程,吸附力弱的组分随流动相迅速向前,而吸附力弱的组分则滞后,由于各组分不同的移动速度而使得她们得以分离。物质被分离后在图谱上的位置,常用比移值Rf表示。 原点至层析斑点中心的距离 R f二原点至溶剂前沿的距离 三、实验仪器与药品 5.0cm x 15.0cm硅胶层析板两块,卧式层析槽一个,点样用毛细管 四、物理常数 五、仪器装置图

“浸有层析板的层析槽”图 1 2 3 4 1-层析缸,2-薄层板,3-展开剂饱和蒸汽,4-层析液 六、实验步骤 (1)薄层板的制备: 称取2?5g层析用硅胶,加适量水调成糊状,等石膏开始固化时,再加少许水,调成匀浆,平均摊在两块5.0 X 15cm的层析玻璃板上,再轻敲使其涂布均匀。(老师代做!) 固化后,经105 C烘烤活化0.5h,贮于干燥器内备用。 (2)点样。 在层析板下端2.0cm处,(用铅笔轻化一起始线,并在点样出用铅笔作一记号为原点。)取毛细管,分别蘸取偶氮苯、偶氮苯与苏丹红混合液,点于原点上(注意点样用 的毛细管不能混用,毛细管不能将薄层板表面弄破,样品斑点直径在1~2mm为宜!斑 点间距为1cm) (3)定位及定性分析 用铅笔将各斑点框出,并找出斑点中心,用小尺量出各斑点到原点的距离和溶剂前沿到起始线的距离,然后计算各样品的比移值并定性确定混合物中各物质名称。 ........ 溶剂前沿 T ②T 1① I T 纯混 纯染料混合染料

氨基酸的离子交换柱色谱分离

氨基酸的离子交换柱色谱分离 【原理】 本实验采用磺酸型阳子交换树脂(732型)分离酸性氨基酸(天冬氨酸Asp pI=2.97)和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下,因为低于Lys的pI值,Lys可解离成阳离子挂在树脂上;高于Asp的pI值,则Asp可解离为阴离子,不能被树脂吸附而直接流出色谱柱,在pH 12条件下,因高于Lys的pI值,Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来,这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。 【操作】 1、树脂的处理 关于市售新树脂的处理见注1,关于树脂浮洗的方法参照讲义所述,本实验采用处理好的树脂。 2、装柱:将色谱柱垂直装好,关闭柱底出口,在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。 将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中,加进1~2倍体积的柠檬酸缓冲液,经抽气处理后,搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满,倒时不要太快,以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2~3cm高时,用吸管吸去柱内上层所出现的清液,慢慢打开柱底出口,继续加注树脂悬液,直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败,另外树脂悬液的温度要相对恒定(特别是对于采用高温法)。装好的柱体应该没有纹路,没有裂痕,没有气泡和柱顶表面平整而均匀,这样方可投入使用,否则要重装。 3、平衡:柱装好后接上预先调好的恒流泵,用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡,直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止(pH试纸检查),这大约需要2~3倍床体积。 4、加样与洗脱:移去柱上的液器塞,打开柱底出口,小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。沿柱壁小心地加入柱中,加样时不要过快,以免冲坏树脂表面,加样后慢慢打开柱底阀,使液面再与树脂面相齐时关闭,然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1~2次。洗涤后,用缓冲液在柱内加到约2cm高的液层,然后接上恒流泵,调流速0.5ml/分即开始洗脱。 注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡,并且在调节时不要过猛,以免影响色谱行为。 5、收集:柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。 6、改换高pH洗脱收集:关闭恒流泵及柱底阀,将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液,然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。 7、测定:(注2)将收集的各管编号后,分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中,加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液,0.5ml茚三酮试剂,混合后在100℃水浴上加热25分钟。然后水冷却5~10分钟,加3m160%乙醇衡稀释,摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。测定后,以光密度为纵坐标,收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。 8、再生,对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱,再用蒸馏水洗至中性后重复使用。 注:1、对于市售的干树脂其处理方法为:先经水充分溶胀后,倾去上面的泥状细粒,反复洗几次直到水澄清为止,然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂,浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗,每次半小时,换酸或碱时用水先将树脂洗至中性,最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型(对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定),在蒸馏水洗至中性备用。 2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右,这样在本实验中,改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。 【器材】

实验_柱色谱

实验 10 柱色谱分离实验报告 --亚甲基蓝与荧光黄的分离 一实验目的 学习并掌握色谱法的原理及其应用。 学习并掌握柱色谱的实验操作技能。 二实验原理 色谱法亦称色层法,层析法等,是分离,纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配)的不同,或其它亲和作用性能的差异,混合物的溶液流经该种物质,进行反复的吸附或分配等作用,从而将各组分分开。 色谱分离法的分类 (按操作条件的不同)

色谱分离法的分类 (按组分在固定相中的作用原理不同) 色谱法的应用 色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几个方面: (1)分离混合物 (2)精致提纯化合物 (3)利用比移值(Rf)鉴定化合物 (4)跟踪反应进程 柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者以硅胶,硅藻土和纤维素为支持剂,以吸收大量的液体为固定相。 当加入的洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,因而以不同的速度沿柱向下流动,继续洗脱时,吸附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗脱过程中,不同组分或不同色带就能分别收集,从而达到分离纯化的目的。

1 吸附剂 常用的吸附剂:氧化铝,硅胶,氧化镁,碳酸钙,活性炭或纤维素粉。选择吸附剂的首要条件:不与被分离物或展开剂发生化学反应。 吸附能力与以下几点有关: (1)吸附剂颗粒大小 (2)吸附剂含水量 柱色谱 2 溶剂 通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附活性等来考虑。先将带分离的样品溶于尽量少的非极性溶剂中,从柱顶流入柱中,依次增大溶剂的极性,将不同化合物依次洗脱。 常用洗脱剂的极性: 石油醚<环己烷<四氯化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水<乙酸 三实验步骤及注意事项 (1)取一支色谱柱,在柱子的收缩部塞一小团脱脂棉花,注意松紧要适度。然后在棉花上铺一层粗硅胶或石英砂。 (2)将色谱柱垂直固定在铁架台上,往柱内加适量70%乙醇溶液,打开活塞,赶走气泡。 (3)再向柱中倒入适量70%乙醇溶液,打开活塞,控制滴速为1滴/秒,用小锥型瓶承接,同时通过漏斗慢慢装入5gAl2O3,使其逐渐沉入底部。 【在装吸附剂的过程中,应用质软的物体如试管夹、吸耳球等轻轻敲击柱身,促使吸附剂装填紧密,排除气泡。最终应使吸附剂的上端平整,无凹凸面。】(4)加完吸附剂后,在吸附剂上再盖一张直径大小合适的小滤纸。 (5)当溶剂的液面刚好流至滤纸面时关闭二通活塞,立即用移液管加入1mL亚甲基蓝和荧光黄的乙醇混合液,尽量免待分离混合液粘附在柱的内壁上。 (6)打开二通活塞,等柱内的溶剂恰好流到滤纸面时,关闭二通活塞,向柱内加入70%乙醇,打开二通活塞进行洗脱。 (7)用锥形瓶收集蓝色的亚甲基蓝溶液。【洗脱时切勿使溶剂流干!】 (8)当蓝色溶液收集完后,等柱内的70%乙醇溶液恰好流到滤纸面时,关闭二通活塞,加入适量2%氨水作为洗脱剂。打开二通活塞收集黄绿色的荧光黄溶液,直到其完全被洗出。 (9)用量筒分别量取所分离出来的亚甲基蓝和荧光黄溶液的体积后,倒入指定的回收瓶中。 (10)分离结束后,应先让溶剂尽量流干,然后倒置,用吸耳球从活塞口向管内挤压空气,将吸附剂从柱顶挤压出。使用过的吸附剂倒入垃圾桶里,切勿倒入水槽,以免堵塞水槽。 四操作注意事项 特别注意:有机溶剂对身体特有害别是心肺;肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行!!!柱色谱是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望对大家能有所帮助。 1、柱子可以分为:加压,常压,减压压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间

薄层色谱实验

、实验目的: 1、掌握湿法制作薄层色谱的操作方法。 2、了解薄层色谱的基本原理和应用。 3、掌握使用薄层色谱的操作技术。 4、掌握样品检测前的处理方法。 二、实验原理: 1、原理 薄层色谱常用TLC表示,又称薄层层析,属于固-液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂(固定相)和溶剂(移动相)之间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同,在展开剂上移时,它们进行不同程度的解吸,从而达到分离的目的。 2、薄层色谱的用途: 1)化合物的定性检验。(通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定) 在条件完全一致的情况,纯净化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离,称比移值(Rf值),所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定物质种类。 影响比移值的因素很多,如薄层的厚度,吸附剂颗粒的大小,外界温度和展开剂纯度、黏度等。要获得重现的比移值就比较困难。为此,在测定某一试样时, 最好用已知样品进行对照。 R f =溶质最高浓度中心至原点中心的距离 溶剂前沿至原点中心的距离 2、快速分离少量物质。(几到几十微克,甚至0.01 Q 3、跟踪反应进程。在进行化学反应时,常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失,来判断反应是否完成。 4、化合物纯度的检验(只出现一个斑点,且无拖尾现象,为纯物质。) 此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分 析的物质。 三、实验仪器、试剂。 1.仪器:载玻片(5块)、玻璃棒、小烧杯(100ml)、烘箱、干燥器、普通天平、吹风机、紫外灯、分液漏斗、锥形瓶(250ml)、广口瓶、毛细管、量筒(10ml)、镊子、表面皿、铅笔、尺子。 2.试剂:硅胶GF254 1%羧甲基纤维素钠(CMC、APC药片1片、二氯甲烷、无水MgSO、水、展开剂(苯:乙醚:冰醋酸:甲醇=120: 60: 80: 1的混合溶液)

实验一 柱色谱

实验一柱色谱、薄色谱 一、实验目的 1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。 2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。 二、实验原理 色谱法(Chromatography)亦称色层法、层析法等。 色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(分配)的不同,或其亲和性的差异,使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用,从而使各组分分离。 色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面: 1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物,一般应用化学方法分离很困难,但应用色谱法分离,有时可得到满意的结果。 2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质,不易除去,可利用色谱法分离以除去杂质,得到纯品。 3、鉴定化合物在条件完全一致的情况,纯碎的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离,称比移值(Rf值),所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多,如薄层的厚度,吸附剂颗粒的大小,酸碱性,活性等级,外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以,要获得重现的比移值就比较困难。为此,在测定某一试样时,最好用已知样品进行对照。 4、观察一些化学反应是否完成,可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失,以证明反应完成与否。 吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂,将一些物质自溶液中吸附到它的表面上,而后用溶剂洗脱或展开,利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用,和它们在溶剂中不同的溶解度,也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之

薄层色谱中展开剂的选择

薄层色谱中展开剂的选择 2007-04-05 02:03 (一)有机合成中展开剂的选择 做有机合成时走板子是常有的事,展开剂的选择就至关重要了。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为:石油迷<己烷<苯<乙醚

柱层析分离的实验方法和技巧

柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多,所以下面我就几年来过柱的体会写些心得,希望能有所帮助。 一:柱子可以分为:加压,常压,减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二:关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm ×20cm的柱子);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等。

薄层色谱实验

薄层色谱实验 一、实验目的: 1、了解薄层色谱的基本原理和应用。 2、掌握薄层色谱的操作技术。 二、实验原理: 1、原理 薄层色谱(Thin Layer Chromatography) 常用TLC 表示,又称薄层层析,属于固-液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂(固定相)和溶剂(移动相) 之间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同,在展开剂上移时,它们进行不同程度的解吸,从而达到分离的目的。 2、薄层色谱的用途: 1)化合物的定性检验。(通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定)在条件完全一致的情况,纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距 离,称比移值(Rf 值),所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多,如薄层的厚度,吸附剂颗粒的大小,酸碱性,活性等级,外界温度和展开剂纯度、组成、 挥发性等。所以,要获得重现的比移值就比较困难。为此,在测定某一试样时,最好用已知样品进行对照。 溶质最高浓度中心至原点中心的距离 R f 溶剂前沿至原点中心的距离 2、快速分离少量物质。(几到几十微克,甚至0.01 μg) 3、跟踪反应进程。在进行化学反应时,常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步 消失,来判断反应是否完成。

4、化合物纯度的检验(只出现一个斑点,且无拖尾现象,为纯物质。)

此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱 分析的物质。 三、实验装置 薄层板在不同的层析缸中展开的方式 四、实验操作步骤: 1、吸附剂的选择 薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。 1)、硅胶: “ 硅胶H”—不含粘合剂; “ 硅胶G”—含煅石膏粘合剂; 其颗粒大小一般为260 目以上。颗粒太大,展开剂移动速度快,分离效 果不好;反之,颗粒太小,溶剂移动太慢,斑点不集中,效果也不理想。 化合物的吸附能力与它们的极性成正比,具有较大极性的化合物吸附较 强,因而R f 值较小。 酸和碱> 醇、胺、硫醇> 酯、醛、酮> 芳香族化合物> 卤代物、醚> 烯> 饱和烃 本实验选择的吸附剂为薄层色谱用硅胶G。 2、薄层板的制备(湿板的制备)

柱色谱实验操作方法

一、液-固色谱原理 液-固色谱是基于吸附和溶解性质的分离技术,柱色谱属于液-固吸附色谱。 当混合物溶液加在固定相上,固体表面借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分,以不同的作用强度被吸附在固体表面。 由于吸附剂对各组分的吸附能力不同,当流动相流过固体表面时,混合物各组分在液-固两相间分配。吸附牢固的组分在流动相分配少,吸附弱的组分在流动相分配多。流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动,吸附弱的组分以较快的速率向下移动。随着流动相的移动,在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配,新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程,结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面,吸附强的组分移动在后面,吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动,各种化合物在色谱柱中形成带状分布,实现混合物的分离。 二、柱色谱分离条件 (1)固定相选择 柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂。

吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。以氧化铝作为固定相时,非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用,吸附较弱;极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用,有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为: 成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。有机物的极性越强,在氧化铝上的吸附越强。 常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等(表1)。 色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝pH约为4~4.5,用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质;中性氧化铝pH值为7.5,用于分离中性物质,应用最广;碱性氧化铝pH为9~10,用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。

吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低,活性越高。脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。 硅胶是中性的吸附剂,可用于分离各种有机物,是应用最为广泛的固定相材料之一。 活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。 吸附剂的粒度越小,比表面越大,分离效果越明显,但流动相流过越慢,有时会产生分离带的在重叠,适得其反。 (2)流动相选择 色谱分离使用的流动相又称展开剂。 展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。 在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配,强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多,弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多,随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。 在氧化铝柱中,选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带,流出色谱柱。 当一种溶剂不能实现很好的分离时,选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物,对其它组分不能展开洗脱,需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。 三、柱色谱分离操作

氨基酸的薄层层析实验报告

生物化学实验报告 姓名: XXXXX 学号: XXXXXXXXXXXXXX 专业年级: XXXXXXXXXXXXXXX 组别:第X实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称氨基酸的薄层层析 实验日期XXXX-XX-XX 实验地点第X实验室 合作者XXXX 指导老师XXX 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握薄层层析法的实验原理。 2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作方法。 3、掌握如何根据移动速率(R f值)来鉴定被分离的物质(即氨基酸混合液)的方法。 二、实验原理 1、薄层层析法是色谱分析技术的一种。 是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板(如玻璃板、塑料片、金属片等)上,形成薄层(常用厚度为0.25毫米左右)后,在此薄层上进行层析分离的分析方法。一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相(展开溶剂)在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样,不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样,点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同,因而可以彼此分开。(即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行,而将样品各组分分离开来) 硅胶吸附薄层层析: 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶:表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质,它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基(-Si-OH),这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附. 硅胶吸附薄层层析的特点: ②硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱,其吸附活性也与含水量呈负性相关。

②硅醇基显较弱的酸性,因此,硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离,碱性成分不能用它分离。 ③硅胶的活化温度通常为105℃-110℃,不能过高。 2、氨基酸与茚三酮的显色反应: 茚三酮水化后生成水化茚三酮,它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛,与此同时,还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 3、混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—R f值(rate of flow)来表示。 层析中,物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为R f 值。 即: Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到斑点对应前沿的距离 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的,故移动速率(R f 值)也是恒定的,因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法: (一)、材料:分析样品(氨基酸混合液)、吸附剂(硅胶)、粘合剂(0.5%的羧甲基纤维素钠)、氨基酸的异丙醇溶液(丙氨酸、精氨酸、甘氨酸)、展开-显色剂(正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液); (二)、器材:层析板(5cm×15cm)、尺子、铅笔、小烧杯、玻棒、量筒(10ml)、吹风机、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱; (三)、方法: 1、实验流程: 2、操作步骤:

薄层层析实验报告

薄层层析实验报告 篇一:薄层色谱法实验报告 有机化学第二课堂实验报告 一,基本信息 姓名: 年级:XX级专业层次:队别: 日期:XX年5月23日实验室:有机化学实验室二二、实验报告正文 实验题目:薄层板的制作及薄层色谱的应用实验目的 掌握薄层色谱的基本原理及其在有机物分离中的应用。 实验原理 1.有机混合物中各组分对吸附剂的吸附能力不同,当展开剂流经吸附剂时,有机物各组分会发生无数次吸附和解吸过程,吸附力弱的组分随流动相迅速向前,而吸附力弱的组分则滞后,由于各组分不同的移动速度而使得她们得以分离。物质被分离后在图谱上的位置,常用比移值Rf表示。 Rf? 原点至层析斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离

实验仪器与药品 实验仪器:硅胶层析板两块,卧式层析槽一个,点样用毛细管,紫外荧光灯, 铅笔暖风机、载玻片、钢勺、镊子等 药品:碱性湖蓝与荧光黄混合样品、咖啡因与阿司匹林混合样品、阿司匹林 纯样品二氯乙烷层析液、95%的乙醇溶液,硅胶粉、5%的羧甲基纤维素钠(CMC)的水溶液等 仪器装置图 “浸有层析板的层析槽”图 1-层析缸(广口瓶),2-薄层板,4-层析液 实验步骤 (1)薄层板的制备:(本文来自:https://www.docsj.com/doc/2215480768.html, 小草范文网:薄层层析实验报告) 取3g 硅胶G粉于研钵中,加相当于8ml左右的用5%的羧甲基纤维素钠(CMC)的水溶液,用力研磨1-2分钟,至成糊状后立即倒在准备好的薄层板中心线上,快速左右倾斜,使糊状物均匀地分布在整个板面上,厚度约为0.25mm,然后平放于平的桌面上干燥15分钟,再放入100℃的烘箱内活化

2小时,取出放入干燥器内保存备用。 (2)点样。在层析板下端1.0cm处,(用铅笔轻化一起始线,并在点样出用铅笔作一记号为原点。)取拉好的毛细点样管,分别蘸取咖啡因与阿司匹林混合样品、阿司匹林纯样品,点于原点上(注意点样用的毛细管不能混用,毛细管不能将薄层板表面弄破,样品斑点直径在1到2mm为宜!斑点间距稍大一点。点样次数5到7次)另取一块薄层板,点碱性湖蓝与荧光黄混合样品。(3)定位及定性分析将点好样的薄层板分别放入装有二氯乙烷层析液和5%的乙醇溶液的两个广口瓶中,盖上盖子,待层析液上行至距薄层板上沿1cm左右时,有镊子取出,铅笔将各斑点框出,并找出斑点中心,用小尺量出各斑点到原点的距离和溶剂前沿到起始线的距离(点有阿司匹林的薄层板需用暖风机吹干),算各样品的比移值并定性确定混合物中各物质名称。 实验结果记录及分析 实验结果图 1、铺板时一定要铺匀,特别是边、角部分,晾干时要放在平整的地方。 2、点样时点要细,直径不要大于2mm,间隔0.5cm以上,浓度不可过大,以免出现拖尾、混杂现象。

实验一 薄层层析板的制备

实验一薄层层析板的制备 一、实验目的 制备薄层层析板,使叶绿素在层析板上分离显色。 二、实验原理 薄层层析,常用 TLC(Chromatography)表示,又称薄层色谱,属于液-固吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法,它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品(几到几十微克,甚至 0.01 μg )的分离;另一方面若在制作薄层板时,把吸附层加厚,将样品点成一条线,则可分离多达 500mg 的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。 薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺和纤维素。其颗粒大小,一般要求直径为10~40μm。硅胶是无定形多孔性物质,略具酸性,适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为:“硅胶H ”—不含粘合剂;“硅胶G ”—含煅石膏粘合剂;“硅胶HF 254 ”—含荧光物质,可用于波长为 254nm 紫外光下观察荧光;“硅胶GF 254 ”—既含煅石膏又含荧光 剂等类型。粘合剂除上述的煅石膏(半水合硫酸钙: 2CaSO 4 · H 2 O )外,还 可用淀粉、羧甲基纤维素钠。 三、实验材料、器具 1、试剂硅胶、4‰的CMC溶液(羧甲基纤维素钠) 2、实验用具:药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒 四、实验步骤 1、载玻片要求平滑清洁,没有划痕,在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤,再用水冲洗干净。(干净的标准:水不是呈股流下,而是呈瀑布状态流下。) 2、与硅胶混合:CMC-Na溶液与硅胶的比例为3:1(3ml:1g)。取CMC-Na溶液倒入研钵中,然后加入硅胶,在研钵中研磨,按一个方向研磨,自下而上,然后自上而下,以赶尽气泡为佳。 3、铺板:将载玻片置于平台上,用药匙舀取糊状硅胶,均匀地铺在载玻片表面。铺板时,可以顺着板中间倒,也可以顺着某个边缘倒,也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上,倒时也要注意不要引入小气泡。尤其是载板的四个角,容易高出玻璃板其他部位,所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好的板,表面看上去要光滑平整,没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台面上,否则难保证板面硅胶的厚度均匀。(3g硅胶大约可铺7.5×2.5cm载玻片5-6块) 4、晾干:置水平台上于室温下晾干。 5、活化:将晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min,然后取出,放入干燥器中,备用。活化硅胶有利于提高硅胶的吸附性能,同时排除硅胶内部已吸收的水分及其他气体。通过活化硅胶,主要改变了硅胶内部的微孔结构,使其孔径的大小及微孔结构的排列得到进一步的改善。但是这样硅胶的吸附变大,可能会使样品分离困难。

柱色谱

实验目的:学习柱色谱的操作方法。 实验原理:(同实验六) 柱色谱(柱上层析)常用的有吸附色谱和分配色谱两类。吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;而分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。 吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大经过活化的多孔性或粉状固体吸附剂。当待分离的混合物溶液流过吸附柱时,各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时,由于不同化合物吸附能力不同,往下洗脱的速度也不同,于是形成了不同层次,即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带,再用溶剂洗脱时,已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集;或将柱吸干,挤出后按色带分割开,再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。 实验装置及样品: 1 、装置图:(略) ( 1 )吸附剂 常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。吸附剂一般要经过纯化和活性处理,颗粒大小应当均匀。对于吸附剂而言,粒度愈小表面积愈大,吸附能力就愈高,但颗粒愈小时,溶剂的流速就太慢,因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性、碱性三种: 酸性氧化铝用 1% 盐酸浸泡后,用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液 pH 为 4 ,用于分离酸性物质。 中性氧化铝其悬浮液的 pH 为 7.5 ,用于分离中性物质。 碱性氧化铝其悬浮液的 pH 为 10 ,用于胺或其它碱性物质的分离。 大多数吸附剂都能强烈地吸水,而且水分易被其它化合物置换,因此吸附剂的活性降低,通常有加热方法使吸附剂活化。氧化铝随着表面含水量的不同,而分成各种活性等级。 活性等级的测定一般采用勃劳克曼( Brockmann )标准测定法. ( 2 )溶质的结构与吸附能力的关系 化合物的吸附性与它们的极性成正比,化合物分子中含有极性较大的基团时,吸附性也较强,各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减: 酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 > 烯 > 饱和烃 在本实验中,乙酰二茂铁极性大于二茂铁,因此,二茂铁首先被洗脱下来。 ( 3 )溶剂 溶剂的选择是重要的一环,通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。

薄层色谱

实验二十薄层色谱 一、实验目的 1、学习薄层色谱法的原理和方法; 2、掌握比移值的计算方法; 3、了解比移值的影响因素。 二、实验原理 薄层色谱(thin layer chromatography)常用TLC表示,依其所采用的薄层材料性质和物理、化学原理的不同,可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和排阻薄层色谱等。 吸附薄层色谱采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层,将样品以毛细管点在原点处,用移动的展开剂将溶质解吸,解吸出来的溶质随着展开剂向前移动,遇到新的吸附剂,溶质又会被吸附,新到的展开剂又会将其解吸,经过多次的解吸-吸附-解吸的过程,溶质就会随着展开剂移动。吸附力强的溶质随展开剂移动慢,吸附力弱的溶质随展开剂移动快,这样不同的组分在薄层板上就得以分离。 一个化合物在吸附剂上移动的距离与展开剂在吸附剂上移动的距离的比值称为该化合物比移值R f 展开剂是影响色谱分离度的重要因素。一般来说,展开剂的极性越大,对特定化合物的洗脱能力也越大,一般常用展开剂按照极性从小到大的顺序排列大概为:石油醚<己烷<甲苯<苯<氯仿<乙醚

实验四( ) 薄层色谱

实验四( ) 薄层色谱 实验四(1)薄层色谱 一、实验目的 1、学习学习薄层色谱法的原理,了解其意义和应用。 2、掌握薄层板的制作及薄层色谱的操作方法。 二、实验原理 薄层色谱法是以薄层板作为载体,让样品溶液在薄层板上展开而达到分离的目的,故 也称为薄层层析。它是快速分离和定性分析少量物质的一种广泛使用的实验技术,可用于 精制样品、化合物鉴定、跟踪反应进程和柱色谱的先导(即为柱色谱摸索最佳条件)等方面。 1、薄层色谱常用的吸附剂 硅胶和氧化铝是薄层层析常用的固相吸附剂。化合物极性越大,它在硅胶和氧化铝上 的吸附力越强,所以吸附剂均制成活性精细粉末。活化通常是加热粉末以脱去水分。硅胶 是酸性的,用来分离酸性或中性的化合物。氧化铝有酸性、中性和碱性的,可用于分离极 性或非极性的化合物。商用的硅胶和氧化铝薄层板可以买到,这些薄板常用玻璃或塑料制成。溶剂在薄层板上爬升的距离越长,化合物的分离效果越好。宽的薄层板也可用于量较 大的样品,具有1~2mm 厚的大板可用于50~1000mg 样品的分离制备。 2、样品的制备与点样 样品必须溶解在挥发性的有机溶剂中,浓度最好是1~2%。溶剂应具有高的挥发性以便于立即蒸发。丙酮、二氯甲烷和氯仿等是常用的有机溶剂。分析固体样品时,可将 20~40mg样品溶到2mL 的溶剂中。在距薄层板底端约1cm 处,用铅笔划一条线,作为起点线。用毛细管(内径小于1mm )吸取样品溶液,垂直地轻轻接触到薄层板的起点线上。样品量不能太多,否则易造成斑点过大,互相交叉或拖尾,不能得到很好的分离效果。 3、展开 将选择好的展开剂放在层析缸中,使层析缸内空气饱和,再将点好样品的薄层板放入 层析缸中进行展开。使用足够的展开剂以使薄层板底部浸入溶剂3~5mm ,但溶剂不能太多,否则样点在液面以下,溶解到溶剂中,不能进行层析。当展开剂上升到薄层板的前沿(离 顶端5~10mm处)或各组分已明显分开时,取出薄层板放平晾干,用铅笔划出前沿的位置 后即可显色。根据R f 值的不同对各组分进行鉴别。 4、显色

生化实验报告离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

实验报告 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法 二、实验内容和原理 1、离子交换层析 由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中,粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷,因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附,然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液,使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂的亲和力降低,把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来,从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测 蔗糖酶是一种水解酶,它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖)。(50℃水解) 3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。(100℃显色) 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化(溶解即为样品Ⅲ) 2、实验试剂 ⑴ ⑵ 20 7.3 缓冲液 ⑶ 20 (1 )7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液,4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液 ⑹ 3,5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器 (1)高速冷冻离心机 (2)层析柱(φ1.0×20㎝ )(1支/组)

(3)? (1套/组) (4)部分收集器及收集试管(4管)(1台/组) (5)-20℃冰箱(保存样品用) (6)微量移液枪 200、1000 (7)1.5离心管(留样品Ⅲ和样品Ⅳ用) (8)7离心管(留样品Ⅳ用) (9)恒温水浴(50℃、100℃) (10)试管、移液管、试管架等 四、实验方法和步骤 1、仪器连接 (1)接通各仪器电源,将泵头分别放置A,B两个溶液瓶中。注意B为含溶液。 (2)点击电脑桌面上软件图标,打开软件。选择,点击,进入操作界面。点击 (3)在操作界面的工具栏,点击。出现窗口,调节为 1,确定。 2、装柱与平衡 (1)检查层析柱的两端接头,底端有膜的置于下方。 (2)程序暂停。将层析柱放入卡槽,上端接头与混合器()相连,下端接头与样品阀( )相连。 (3)平衡一个柱体积(约2020) 3、加样 停止加入20 7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时,程序暂停。旋开柱上方接头,用胶头滴管缓慢将5蔗糖酶蛋白样品溶液(样品Ⅲ)加入层析柱中,注意顺着柱壁滴加,尽可能保持胶面平整。程序继续,使样品溶液进入胶体,待样品溶液完全进入胶体后,程序暂停,用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下,并完全进入胶体后,再加缓冲液至一定高度。 4、洗脱(梯度洗脱法) (1)加样后,先用进行洗脱,洗去未被凝胶吸附的杂蛋白(20左右); (2)待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定,在程序主界面的工具栏→ → → ,在两个框内均填入100,点击,最后点击一次,开始梯度洗脱。每2接一管,当上升至8 时,开始测定各管的蔗糖酶活力; (3)将蔗糖酶活力高的若干管酶液(2-3管)合并,测量总体积V4(样品Ⅳ),样品用7离心管-20℃保存。 5、蔗糖酶活力检测

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