高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景

高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景

摘要：高效液相色谱分析是一种高效、快速、准确的分离分析方法，在石油化工、生命科学、环境、医药及食品安全等领域有着广泛的应用。本文旨在简要介绍液相色谱分析法在不同领域的应用情况，并从使用频度、应用范围、检测效率、检测准确度及在本领域分析方法中的重要性等角度进行阐述。

关键词：高效液相色谱仪；石油化工；食品安全

中图分类号： O657.7+2 文献标识码：A

高效液相色谱在20世纪70年代获得迅猛的发展，是一种常规的分离技术色品分析仪的应用最广是在化学领域上，食品与环境的领域上也出现多方面的应用。其中，化合物的分析就包括高分子化合物，离子型化合物，热不稳定化合物以及生活性的化合物等都可以用不同的方式进行离子交换色谱和离子色谱，体积排除法，亲和色谱法等，进行离子分析。

一、高液相色谱分析仪发展现状

随着高效液相色谱分析仪的转换，高效液相色谱仪器成为国际分析化学界发展较快的学科，高效液相色谱是由液相系统组成，分别是检测器，色谱柱，记录仪等三个方面的部分组成，为了取得更好的效果，科研工作者需要提升准确度以及精确度和灵敏度显示科研工作的重要性。

经常采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(OC)进行含量测定，而液相色谱法(LC)只是用于对组分标样的测定和分离的可能性研究。色谱法是一

种分类和混合的开发技术，是在1913年由俄国植物学家在实验中发现并且命名的技术，将植物的叶色素和石油醚，通过装有白色的碳酸钠颗粒的玻璃管，再用石油醚进行全面的冲洗，玻璃管的内壁出现不同颜色的色带，随着冲洗剂的不断转变，色带以不同的颜色进行冲洗，不同的色带以不同的速度向下移动并且分离，色谱法由此得名。

二、色谱分析仪的使用及工作原理

色谱柱通称为不锈钢柱，内装填充剂，常用的是硅胶作为填料，用于正相色谱，化学键固定相，根据色谱化学键的固定相，可以用来作为反相或者是反高的要求。输液系统要为 HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，同时还要提供精度好、准确度高的多元溶剂梯度。早在2003年国家标准中就已经规定了液相色谱法检测食品中糖精钠和安赛蜜的检测方法，在质检机构中已经将之作为一种常规检验项目的基本检测方法来进行操作。近几年随着色谱柱填充制备技术的高速发展，已经可以一次性分离糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、柠檬黄、日落黄、胭脂红。

（一）、高效液相色谱仪的工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程高的要求。

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相

中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

二、高效液相色谱仪在石油化工的应用

高效的液相色谱分析仪在石油生产鉴定中占有重要的作用，在石油化工，农药，环保等方面，经常采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(OC)进行含量测定，而液相色谱法(LC)只是用于对组分标样的测定和分离的可能性的研究。近几年来，HPLC在油品分析，尤其是在石油中多环芳烃、重质烃的测定方面取得了突破性的进展。以正己烷、二氯甲烷为流动相，用多维高效液相色谱技术及适宜的梯度，实现了烃族良好的分离和检测。

三、高效液相色谱仪在生命科学领域的应用

生命科学研究工作中，最大的难题就是基因的解密工作，从基因组DNA 序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组学（Proteome）研究中找到答案。在所研究的细胞中会有3~5万种功能各异的蛋白质，目前蛋白质组研究所使用的双向电泳法一般只能分辨到2000~3000个蛋白质点。现代蛋白质组的分析可尝试使用第一向是体积排阻色谱的双向HPLC高效液相色谱作预分离。高效液相色谱和双向电泳将会成为蛋白质组学的重要分离工具。用HPLC-NMR研究了异环磷酰胺的毒性和代谢物，用1H-NMR观察尿液中各种指标的变化，包括尿糖、组氨酸、三甲胺丁二酸盐、乳酸、乙酸盐、甘氨酸、丙氨酸的上升和柠檬

酸盐、马尿盐酸的下降。使用HPLC-MS测定人血浆中的依那普利及相对生物利用度和人体药学动力学研究。血浆样品中加入内标阿普仑后，经离心取上清液过固相萃取小柱，以甲醇洗脱，然后采用高效液相色谱质谱方法，电喷雾电离源正源选择离子峰检测，检测效果显著。

四、高效液相色谱仪在环境领域的应用

西方发达国家将HPLC方法作为常用的环境监测方法。如美国EPA531方法，用高效液相色谱―荧光法测定饮用水中的N―甲基氨基甲酸酯杀虫剂； EPA605方法用HPLC/电化学法测废水中的联苯胺类化合物； EPA8310方法用LC/荧光分析固体废弃物中的多环芳烃，就连气体中的有害有机物不少也是用HPLC测定。HPLC已在环境分析中得到广泛应用，特别适用于低挥发性、分子量大、热稳定性差的有机污染物质的分离和分析。如多环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性剂、有机农药、除草剂等。

五、结语

综上所述，高液相色谱法主要是采用新的科研技术，在化工生产和制药上占有领先的水平，生物化工，医学临床检验和环境监测等领域获得了广泛的应用和推广，其他方面的检测方法与高效的液相色谱法比较，会得出较好的结果，经过验证得出他们的可行性和准确性，高效液相色谱分析法不仅具有研究意义，还有相当长的发展前景。

参考文献：

[1] 赵青山, 许晶, 付茂辉. 高效液相色谱仪器的进展 [J]. 生命科学仪器, 2005, 3(5): 17-18.

[2] 吴孔叨, 李鲁胜. 高效液相色谱仪常用检测器的联用技术[J]. 分析仪器, 1983(4).

[3] 罗绍远. 浅谈液相色谱仪及其在分析化学中的应用和维护[J]. 沈阳化工, 1987(6).

[4] 苟爱仙, 董宝钧, 张艳丽. 高效液相色谱法测定渣油的族组成[J]. 黑龙江石油化工, 1998(9): 45-47.

[5] 张大伟. 高效液相色谱在油品族组成和分子量及其分布测定中的应用研究[D]. 辽宁石油化工大学, 2007.

[6] 陈刚, 王军, 黄程. 高效液相色谱技术在石油化工中的应用[J]. 应用化工, 2011, 4(1): 131.

高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （ 1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（4 ）页输入后按【Exit 】；在第（ 6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （ 1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

高效液相色谱原理及应用

高效液相色谱原理及特点 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一、高效液相色谱仪有哪些特点？ 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350 ×105Pa。 2．高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。3．高效：近年来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4．高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。5．适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离 能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，而技术平台〉〉〉 高效液相色谱仪原理 不需要汽化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70%～80%。 二、高效液相色谱法可分为哪几种主要类型？各自的分离原理是什么？高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换 液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：

高效液相色谱的发展及其应用

高效液相色谱的发展及其应用 摘要：了解高效液相色谱[1]的发展历史，知道高效液相色谱的组成结构、操作 原理以及方法等等。掌握它的分类方法，通过比较得出高效液相色谱分析方法的优点与缺点。明确高效液相色谱的应用，最终分析结果。 关键词：高效液相色谱；发展历史；应用 高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 1、高效液相色谱的发展历史 1.1高效液相色谱的历史 高效液相色谱作为色谱分析法的一个分支，是在二十世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。 1.2高效液相色谱与其它色谱的比较[2] 1.2.1与经典液相色谱的比较 经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。 高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 1.2.2与气相色谱法的比较 高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析。 2、高效液相色谱 2.1高效液相色谱的特点 2.1.1高效液相色谱的优点 1.分辨率高于其它色谱法，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果； 2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成； 3.重复性高、样品不被破坏、易回收； 4.高效相色谱柱可反复使用； 5.自动化操作，分析精确度高；

37高效液相色谱法标准操作规程

高效液相色谱法标准操作规程 目的：建立高效液相色谱法标准操作规程。 适用范围：高效液相色谱法。 责任：质检员实施本操作规程，检验室主任负责监督本规程正确执行。 程序： 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1.对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和 1

2 调整。应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 (1) 色谱柱的理论板数（n ） 在选定的条件下；注入供试品对仪器或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R （以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54(t R /（W h/2）计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改普通色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。 (2)分离度 定量分析时，为便于准确测量，要求定时峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： ()21122w w t t R R R +-= 式中 2R t 为相邻两峰中后一峰的保留时间； 1R t 为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1及W 2为此相邻两峰的保留时间； 除另有规定外，分离度应大于1.5。 (3)重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。 (4)拖尾因子 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子 拖尾因子公式为： 1 05.02d W T h = 式中W 0.05h 为0.05峰高处的峰宽； d 1为峰极大至峰前沿之前的距离。 除另有规定外，T 应在0.95～1.05之间。 3.测定法

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景

高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景 摘要：高效液相色谱分析是一种高效、快速、准确的分离分析方法，在石油化工、生命科学、环境、医药及食品安全等领域有着广泛的应用。本文旨在简要介绍液相色谱分析法在不同领域的应用情况，并从使用频度、应用范围、检测效率、检测准确度及在本领域分析方法中的重要性等角度进行阐述。 关键词：高效液相色谱仪；石油化工；食品安全 中图分类号： O657.7+2 文献标识码：A 高效液相色谱在20世纪70年代获得迅猛的发展，是一种常规的分离技术色品分析仪的应用最广是在化学领域上，食品与环境的领域上也出现多方面的应用。其中，化合物的分析就包括高分子化合物，离子型化合物，热不稳定化合物以及生活性的化合物等都可以用不同的方式进行离子交换色谱和离子色谱，体积排除法，亲和色谱法等，进行离子分析。 一、高液相色谱分析仪发展现状 随着高效液相色谱分析仪的转换，高效液相色谱仪器成为国际分析化学界发展较快的学科，高效液相色谱是由液相系统组成，分别是检测器，色谱柱，记录仪等三个方面的部分组成，为了取得更好的效果，科研工作者需要提升准确度以及精确度和灵敏度显示科研工作的重要性。 经常采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(OC)进行含量测定，而液相色谱法(LC)只是用于对组分标样的测定和分离的可能性研究。色谱法是一

种分类和混合的开发技术，是在1913年由俄国植物学家在实验中发现并且命名的技术，将植物的叶色素和石油醚，通过装有白色的碳酸钠颗粒的玻璃管，再用石油醚进行全面的冲洗，玻璃管的内壁出现不同颜色的色带，随着冲洗剂的不断转变，色带以不同的颜色进行冲洗，不同的色带以不同的速度向下移动并且分离，色谱法由此得名。 二、色谱分析仪的使用及工作原理 色谱柱通称为不锈钢柱，内装填充剂，常用的是硅胶作为填料，用于正相色谱，化学键固定相，根据色谱化学键的固定相，可以用来作为反相或者是反高的要求。输液系统要为 HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，同时还要提供精度好、准确度高的多元溶剂梯度。早在2003年国家标准中就已经规定了液相色谱法检测食品中糖精钠和安赛蜜的检测方法，在质检机构中已经将之作为一种常规检验项目的基本检测方法来进行操作。近几年随着色谱柱填充制备技术的高速发展，已经可以一次性分离糖精钠、安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、柠檬黄、日落黄、胭脂红。 （一）、高效液相色谱仪的工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程高的要求。 储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相

高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱在生物制药中的应用 高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。 1.高效液相色谱的介绍 高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型： 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）

高效液相色谱法操作规程

目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1 ?定义及概述： 1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2. 高效液相色谱仪的使用要求：

2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3. 操作前的准备： 3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45a m。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时, 对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45a m适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3检查上次使用记录和仪器状态:检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4操作： 4.1泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml,设置高流速（9ml/min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP冲洗，关闭排放阀。 4.1.3将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示 应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 4.2.1开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，

高效液相色谱的应用与发展前景

高效液相色谱的应用呵发展前景 液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过 改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快. 分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。 高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。 对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个 不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。 2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优 点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技 术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必

最新高效液相色谱使用方法

最新高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。

试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。

Water 2695 高效液相色谱仪操作规程

Water 2695 高效液相色谱仪操作规程 1目的 用于规范检验人员正确操作使用Waters 2695 高效液相色谱仪。 2 适用范围 适用于使用Waters 2695高效液相色谱仪检测分析的操作管理。 3 职责 使用Waters 2695高效液相色谱仪进行检验的检验员应对本规程负责，相关项目经理负责监督该操作规程的正确执行。 4仪器组成及原理 4.1仪器组成本仪器由Waters 2695 高效液相色谱仪、检测器(2996型二极管阵列检测器、2487紫外检测器、2489紫外检测器、474型荧光检测器)、Empower色谱作站组成。2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机，可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面等组成。 4.2高效液相色谱法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，经色谱柱进行分离，检测器检测分离后的不同组分，数据处理装置记录色谱图或进行数据处理。 5.仪器的操作 5.1仪器的准备 5.1.1 检查流动相（使用前应首先脱气）、在线清洗溶液（10%甲醇-水溶液seal wash）、进样针清洗溶液（90%甲醇-水溶液injector wash）是否足够。 5.1.2 检查色谱柱的使用是否正确（方向是泵出来进检测器的方向，正常的话是色谱柱上所标示的箭头向上；一般情况下不能将色谱柱反过来用，除非柱子确实无法使用可考虑反方向使用）、连接是否有误，有无漏液，废液瓶的容量是否足够。 5.2开机、自检与仪器预备 5.2.1依次开启不间断稳压电源、开启2695 分离单元电源和计算机电源；仪器开始自检（约5～6min），待仪器操作面板上出现“Idle”字样表示自检成功，仪器进入待命状态。 5.2.2按动仪器面板右下方“Menu/Status”键进入操作状态，按动“Direct Function” 功能键，若仪器是首次使用或溶剂的管路充满空气时，先选择Dry Prime，按动OK，对管路进行排空；此时开启仪器下方purge阀，用专用注射器手工抽出管路内部的空气。（此操作一般情况下不会使用） 5.2.3若非5.2.2 状态时，直接以▼键切换到wet Prime，按动OK，对事先设置好流动相溶剂比例的管路进行相应的流动相灌注。 5.2.4 按动“Direct Function” 功能键，以▼键将仪器切换到purge injector状态，按动OK，对针头进行purge。（此操作是为了避免进样针中有气泡导致进样不平行） 5.2.5 在面板上设置流动相流速（flow），各通道溶剂流动比例以及柱温（col Htr）等参数，然后按动Enter。

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.

高效液相色谱的日常使用和维护

高效液相色谱的日常使用和维护 高新科技与现代产业的迅猛发展，促进了以高效液相色谱（HPLC）为代表的复杂样品的分离分析和分离纯化仪器的飞速发展。HPLC以它定量分析结果准确、分析周期短、分析范围广、分析检测限低等优势，在食品添加剂、药物成分分析等多领域得到了广泛的应用。高效液相色谱仪是一种高端检测仪器，它精密快速，有效准确检测的同时就要求我们一定要严格正确使用仪器，定期科学有效地维护仪器，只有这样仪器才能长久持续有效使用。但是从目前实际使用情况看，与高效液相色谱仪的应用及产品技术升级的发展速度相比，其使用和维护则相对比较滞后，从而造成对仪器的滥用和对耗材不必要的浪费。主要原因是由于对于仪器使用操作者的培训侧重于仪器的初步使用，忽略了仪器的后续培训及维护操作学习；其实很多高效液相色谱都是国外进口仪器，英文版本软件对于大多数理工科毕业的仪器操作者也是一个障碍。笔者根据自己的工作经验，以岛津LC-20AT液相色谱仪为例，阐述液相色谱仪在使用时应注意的几个问题及日常使用后的仪器维护基本事项，并对仪器使用过程中容易遇到的问题进行分析，提出解决方法。 1、高效液相色谱仪的组成 高效液相色谱仪主要是由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和色谱软件数据处理系统组成。 1.1输液系统 输液系统主要包括溶液贮器、在线脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置。 溶液贮器用于存放符合HPLC要求的流动相。在线脱气装置主要功能是流动相在进入柱子前排除气泡。高效液相色谱柱的填料颗粒较小，通过2～5mm的色谱柱受到的流动阻力很大，因此需要通过高压输液泵抽取流动相输送至色谱柱。 高压泵按输液性能可分为恒压泵和恒流泵两种。按机械结构又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵四种，前两种为恒压泵，后两种为恒流泵。恒压泵可以输出稳定不变的压力。在一般的分析仪器中，由于系统阻力不变，恒压亦可达到恒流的效果。但是当系统阻力发生变化时，输入压力即使不变，流量却可随阻力而变化。恒流泵则无论系统阻力如何变化都可保证其流量基本不变。在色谱实际操作中，系统阻力可能随着运行时间的增加产生微小的改变，因此恒流泵比恒压泵更优越。然而在泵和柱系统所允许的最大压力下操作时，恒压泵较为安全方便。

高效液相色谱法操作规程

标准操作规程 目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1.定义及概述： 1.1.高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2.高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3.高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2.高效液相色谱仪的使用要求：

2.1.按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705－90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2，仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3.具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3.操作前的准备： 3.1.流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45μm。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2.供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3.检查上次使用记录和仪器状态：检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4.操作： 4.1.泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速（9ml／min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP）冲洗，关闭排放阀。 ，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2.紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 待稳定后，测试参比和样品光路的信号应符合要求，设置吸收度方式和检测响应时间（一般不大于1秒），设置满刻度吸收值（适用于记录仪）。