骨髓间充质干细胞移植对颅脑损伤大鼠神经功能的影响_万兴

BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准

BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准： 0分： 无可见后肢运动 1分： 一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节 2分： 一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动3分：两个关节广泛活动 4分： 后肢全部三个关节可轻微活动 5分： 两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动 6分： 两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动 7分： 后肢全部三个关节可广泛活动 8分： 非承重情况下可以爪掌面着地 9分： 间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作

11分： 可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作 12分： 可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作 13分： 常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作 14分： 有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动 15分： 持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行 16分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。 17分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。 18分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。 19分：

步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。 20分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。 21分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。 关于BBB评分，的确有很大的主观性，我目前把BBB评分分三大块，0-7主要看关节动否？有几个关节动？ 8-14看脚掌能否着地？着地后能否运动？运动协调不？ 15-18看脚尖能否抓地？脚尖与前进方向是否一致？前后肢运动是否协调19-21看运动时躯干稳不稳定？尾巴翘不翘？

大鼠的骨髓间充质干细胞提取

大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml

骨髓间充质干细胞研究进展(一)

骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一

大鼠脊髓损伤BBB评分中文版

Western blot 试验操作步骤 一、蛋白样品制备 1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中 2 用4℃预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中 3 1000rpm，离心10min 4 倒掉上清，沉淀用1ml PBS 重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细 胞转入EP管中 5 4℃，4000rpm，离心5min 6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净） 7 配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入100ul裂解液(10mg组织/100ul) 若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/L Tris·HCl（pH8.0）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ; 蒸馏水至50ml; 混匀后4℃保存】 8 4℃裂解30-45min，每5min振荡一次 9 4℃ 14000g 离心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。 10 蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明） 每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀释成1×） 11 将蛋白样100℃，变性5min，，-80℃（or -20℃）保存。 二、SDS-PAGE的配制： 1 试剂及配制： （1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤，避光，4℃贮存。 （2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （4）10%SDS：1g SDS加入10ml去离子水，室温贮存。 （5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵加入1ml水，4℃保存，现用现配。 （6）TEMED（可购买成品）

小鼠间充质干细胞分离培养与纯化

小鼠间充质干细胞 一、细胞复苏和接种 1. 37℃预热小鼠间充质干细胞培养液和基础培养液。 2. 从液氮中取出细胞产品管，快速将其置入37℃水浴中解冻，直到管中只剩下最后一片结晶（注意：不要让水没过产品管）。 3. 在生物安全柜中，用75%的酒精擦拭产品管外壁。 4. 将产品管中的细胞移至15ml无菌离心管中，慢慢逐滴加入预温的37℃基础培养液4－5 ml混匀，边滴加边摇匀。 5. 用1ml基础培养液冲洗产品管，并将其转移到15 ml离心管中，边滴加边摇匀。 6. 轻轻混匀细胞后，取10 μl细胞悬液和10 μl台盼蓝混匀，从中取10 μl计数。 7. 细胞悬液在1 000 rpm，室温条件下，离心5分钟，去除上清。 8. 加完全培养液4－5 ml，调整细胞量，轻轻混匀细胞，备用。 9. 按10 000-15 000个细胞/cm2接种细胞。 10. 每个T25培养瓶中加完全培养液3-5 ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 二、细胞换液和培养 注意：复苏或传代后的细胞，请于24小时后，第一次更换培养液。 1. 复苏后的细胞经37℃、5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已完全贴壁，更换培养液后，请继续在37℃，5％CO2培养箱内培养。 2. 之后，每2-3天更换培养液1次，至细胞长到培养瓶表面的80% 可进行传代或冻存。 3. 换液前，请将培养液从4℃中取出，使其恢复到室温。 三、消化细胞 1．消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分别配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液，

用前按1：1混合。 将PBS或D-Hank's液, 消化液，含10% FBS的基础培养液恢复到室温。 2．具体操作如下： （1）吸去培养液，加入3 ml PBS或D-Hank's液，使PBS或D-Hank's液均匀的分布在培养瓶细胞表面。1分钟之后，吸去PBS或D-Hank's液。 （2）每个T25培养瓶加入消化液2 ml，使消化液均匀的分布在培养瓶细胞面。 （3）25℃消化2分钟，在显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部分细胞脱落。（4）向每个培养瓶中加3-5 ml 含10% FBS的基础培养液中和胰酶的消化作用。 （5）用移液管轻轻吹打培养瓶表面使细胞完全脱落后，吸至15 ml无菌离心管内。 （6）20℃，1 500 rpm 离心5分钟，弃上清。 （7）加入一定量的完全培养液，调整细胞数量后，抽样加入胎盘蓝计数，得到细胞数和活性后，按细胞数传代或冻存。 四、细胞传代 1．消化细胞（详见第三步）。 2．按10000-15000个细胞/cm2接种细胞于T25的培养瓶中。 3．每个培养瓶中加完全培养液3-5ml，后置于37℃、5%CO2培养箱内培养。 五、小鼠骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15％FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1X106个/ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%-90% 时，用1:1 的0.25% 胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜

小鼠骨髓间充质干细胞培养

小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。

神经干细胞综述

神经干细胞综述 长期以来 ,人们一直认为 ,成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力 ,一旦受损乃至死亡 ,不能再生 ,这种观点使人们对帕金森病、多发性硬化及脑脊髓损伤的治疗受到了很大的限制。虽然传统的药物及手术取得了一定的进展 ,但是仍不能达到满意的效果。近年来 ,生物医学技术迅猛发展 ,神经生物学的重要进展之一是发现神经干细胞的存在 ,特别是成体脑内神经干细胞的分离和鉴定具有划时代意义。本文对神经干细胞的特点、分布、分化机制及应用等研究进展做一综述。 1 神经干细胞的特点 神经干细胞的特点如下:①神经干细胞可以分化。②通过分裂产生相同的神经干细胞来维持自身的存在 , 同时 ,也能产生子细胞并进一步分化成各种成熟细胞。干细胞可连续分裂几代 ,也可在较长时间内处于静止状态。③神经干细胞通过两种方式生长 ,一种是对称分裂 ,形成两个相同的神经干细胞 ;另一种是非对称分裂 , 由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配 ,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化 细胞 ,另一个子细胞则保持亲代的特征 ,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。 2 神经干细胞与其它类型干细胞的关系 按分化潜能的大小 ,干细胞基本上可分为 3种类型 :第一类是全能干细胞 ,它具有形成完整个体的分化潜能 ,具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力 ,可以无限增殖并分化成全身 2 0 0多种细胞组织的潜能 ,进一步形成机体的所有组织、器官进而形成个体 ;第二类是多能干细胞 ,这种干细胞也具有分化多种细胞组织的潜能 ,但却失去了发育成完整个体的能力 ,发育潜能受到一定的限制 ;第三类是单能干细胞 ,如神经 干细胞等 ,这种细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。然而横向分化的发现 ,使这个观点受到了挑战 ,神经干细胞可以分化成造血细胞。总之 ,生命体通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程及组织工程等各种生物技术的快速发展 ,按照一定的目的 ,在体外人工分离、培养干细胞 ,利用干细胞构建各种细胞、组织及器官作为移植来源 ,将成为干细胞应用的主要方向。 3 神经干细胞的分布 神经管形成以前 ,在整个神经板检测到神经干细胞的选择性标记物神经巢蛋白 (nestin),是细胞的骨架蛋白。构成小鼠神经板的细胞 ,具有高效形成神经球的能力。但目前尚不能肯定神经板与神经干细胞是否具有相同的诱导机制。神经管形成后 ,神经干细胞位于神经管的脑室壁周边。关于成脑神经干细胞的分布 ,研究显示成年嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、纹状体、海马的齿状回颗粒细胞下层等脑组织中分布着神经干细胞。研究发现脊髓、隔区也分离出神经干细胞 ,这些研究表明 ,神经干细胞广泛存在于神经系统。在中央管周围的神经干细胞培养后亦可形成神经球并产生神经元。脊髓损伤时 ,来自于神经干细胞的神经元新生受到抑制 ,而神经胶质细胞明显增多 ,其机制可能与生成神经元的微环境有关。

Allen,S脊髓损伤大鼠模型评价

Allen,S脊髓损伤大鼠模型评价 发表时间：2012-08-01T15:54:02.470Z 来源：《中外健康文摘》2012年第15期供稿作者：郑文添1 黄汉兴1 王玮2 [导读] 脊髓不完全损伤后功能的恢复较早就引起人们的注意，其机制十分复杂。 郑文添1 黄汉兴1 王玮2 （1福建省莆田市第一医院 351100;2福建医科大学基础医学院 350004） 【中图分类号】R681.5【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）15-0088-03 【摘要】目的观察Allen，S法脊髓损伤（SCI）后大鼠后肢功能恢复情况，以及损伤后18d脊髓内部结构的变化及意义。方法：取雌性SD 大鼠16只随机分为2组（n=8）：空白对照组、伤后18d组。Allen，s法致伤脊髓。用大鼠综合行为评分法（CBS）对各级神经功能评分。用免疫荧光化学和图像分析的方法观察GFAP表达变化。结果 1：在行为观察中，发现大鼠脊髓损伤后有自行恢复倾向，损伤后18天后肢功能恢复68%。2：脊髓损伤后18d GFAP反应明显增强。结论 1、急性脊髓损伤后脊髓有自我修复的倾向。2、胶质细胞对脊髓损伤后的功能恢复起到重要作用。 【关键词】脊髓损伤 GFAP 行为学 The Evaluation of Allen,s Weight-dropping Model Experiment Spinal Cord Injury 【Abstract】 Objectives:To observe the recovery of hindlimb function and the changes of structures of the spinal cord 18d after spinal cord injury （SCI）and its significance.Methods:16 female SD rats were randomity divided into the two groups:the groups of spinal cord injury (n=8) and control group (n=8). Spinal cord was injuried with Allen,s weight-dropping model. Immunohistochemical technique and imagine analysis technique were used to detect the express of GFAP in spinal cord tissue, and the neurological function of spinal cord was graded according to Gale combined behavioral score(CBS) . Results:1. In behavior examination , there was about 68% self-recovery of hindlimb function of the injuried rats. 2. The expression of GFAP showed increased 18 day after spinal cord injury. Conclusion:1.There was a tendency of self-repairing after spinal cord injury.2.The data indicted that GFAP may play an important role in self-repairing and regeneration after spinal cord injury. 【Key words】Spinal cord injury GFAP Behavioral analysis 脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种严重影响人类生命质量和生活质量的疾病。研究脊髓损伤最基本的条件是建立标准，理想的脊髓损伤型。理想的模型应符合以下要求：1.临床相似性;2.可调控性;3.可重复性;4.可操作性。传统观念认为,哺乳动物的脊髓损伤后不能再生,导致其后期功能恢复的预后较差，近年来实验研究证实,中枢神经损伤后具有一定的再生能力。本实验用Allen，s法建立脊髓损伤模型，观察脊髓损伤后功能自行恢复情况，并行免疫荧光染色观察脊髓损伤后胶质细胞反应情况,试图对Allen，s模型进行客观的评价。 材料与方法 一、实验动物 成年雌性Sprague-Dawley大鼠16只，体重230-270g，由福建医科大学动物实验中心提供。将大鼠随机分为2组（n=8）：空白对照组、脊髓损伤组。 二、方法 1、模型制备[1]： 所有动物用2%的戊巴比妥纳（40mg/kg）腹腔麻醉后，后路显露T10脊髓。用Allen法制成脊髓背侧损伤动物模型，打击力度为（12.5g×10cm）125势能克厘米力（gram-cm force ,gcf），然后冲洗伤口，用1-0号线依次缝合椎旁肌肉和皮肤。对照组同法暴露，但不损伤脊髓。术后皮下注射青霉素（100U/d）。术后给予人工挤压膀胱帮助排尿，每天两次，直到能自行排尿为止。 2、动物行为评分[2]： 分别于术后每隔24小时进行行为观察。观察者为非本组实验人员。应用Gale联合行为评分（CBS）综合评定大鼠脊髓损伤后功能，包括运动、感觉、反射以及肢体动作协调等方面，最小值为0分，表示神经功能完全丧失，最大值为100分，表示功能完全正常。 3、取材 4、Cajal氏镀银染色。 5、GFAP免疫荧光染色。 7、各数据用SPSS10.0 for windows 分析软件进行统计学分析。数据用均数±标准差表示，各组间数据用方差齐性和两样本的t检验；相关分析用皮尔森相关分析。 结果 1、行为学评分结果 用CBS联合评分,对T10脊髓损伤后大鼠的后肢功能进行评分，发现后肢功能有进行性恢复的现象，损伤后18天功能恢复至68分（CBS 综合评分）。脊髓损伤组与对照组相比，差别均有显著性意义。（P<0.05）。（图1）

_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用

第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。

神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临床观察

神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临 床观察 作者：高凤兰冀雅杰李英芝 【关键词】神经干细胞移植；中枢神经系统疾病；临床观察 我科于200610～200812为13例不同原因造成的脑损害患者做了神经干细胞脑内移植术，取得初步成效，现将研究及观察结果报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料本组共１3例，年龄4～57岁。病种：脑瘫1例，脑出血后遗症8例，脑梗死1例，颅脑损伤后遗症3例。病程：小儿脑瘫患者4年，脑出血及颅脑外伤后遗症4～13个月。 1.2 临床表现见表1。 表1 13例患者临床表现（略） 1.3 治疗方法全部病例均采用手术方法将神经干细胞移植到侧脑室内或直接移植到病灶周围，让神经干细胞不须长途迁移，直

接在神经受损的部位进行神经的修复与重建，移植方法简便,移植物利用效率高。

1.4 移植后观察随访记录见表2。 表2 13例患者移植后观察随访记录（略） 1.5 疗效评定指标语言、肌力、智力。评定时间:1周、半个月、1个月、2个月…… 1.6 影响因素移植成功与否取决于病人的年龄、病程的长短、内环境与个体差异、移植的方法。 2 结果 语言功能改善8例，瘫痪肢体肌力不同程度提高10例，智力改善2例，病情无明显变化者２例。实践证明神经干细胞脑内移植治疗神经系统疾病有效，尤其以语言的改善最为明显，多数患者肌力、智力均有不同程度改善，病人年龄越小治疗效果越明显。 3 讨论 神经干细胞是一种具有自我更新能力，能够分化出神经元、髓鞘细胞等多种类型神经细胞的特殊细胞，被医学界誉为

“源泉细胞”,能够对中枢神经系统的损伤进行营养和修复。中枢神经系统主要是由以下两种细胞组成，即神经元和胶质细胞。神经干细胞是这两种细胞的祖先。理论上，在一定条件下，一个干细胞能够大量增殖并分化成整个大脑和脊髓的全部细胞。干细胞被国际上公认为治疗中枢神经系统损伤的非常理想的种子。 正常情况下,当神经损伤后病灶局部可产生大量的趋化因子,它能使这些神经干细胞做远程迁移,进入到神经损伤区对损伤的神经组织起替代和修复作用,而随着时间的推移这些趋化因子会逐渐减少,因此过晚做神经干细胞移植会降低治疗效果。但过早移植可能会因为神经损伤后早期会出现局部组织的变性坏死水肿不利于移植物的定植生存。因此建议脑出血、脑外伤、在伤后或术后2个月、病情基本稳定后再接受神经干细胞移植。 移植后神经干细胞的功能：（1）补充受损的神经细胞。(2)延缓或抑制进行中的神经系统损伤。（3）通过细胞替代作用更换已死亡或受损的神经细胞，修复受损的神经网络。(4)中枢神经系统损伤后，损伤周边大量的神经细胞，虽然健存，但受到损伤的影响，转入休眠状态，其功能受到抑制，移植的干细胞可分泌大量的神经营养因子，激活这些细胞，从而改善机体的神经功能。

芥子气致大鼠气管损伤的形态学研究

四论著四 D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2014.08.002作者单位:261042潍坊医学院研究生部(孟晓二徐睿),病理教研室(郭文君),电镜室(张圣明);261021潍坊,解放军第89医院呼吸科( 祝筱姬二赵超二连承进二季鹏),病理科(王涛二鞠玲燕二王美红)通信作者:祝筱姬,E m a i l :x i a o j i z h u @163.c o m 芥子气致大鼠气管损伤的形态学研究 孟晓 祝筱姬 徐睿 赵超 连承进 季鹏 王涛 鞠玲燕 王美红 郭文君 张圣明 ?摘要? 目的 建立芥子气致大鼠呼吸道损伤的动物模型, 观察芥子气损伤大鼠气管的组织和细胞形态学变化三方法 雄性大鼠72只,随机分为芥子气组(n =32)二丙二醇对照组(n =32)和正常对照组(n =8)三芥子气组气管内注入稀释的芥子气(0.1m l ,2m g /k g ),光镜和电镜下观察气管组织和细胞形态学改变三结果 芥子气组(6h 二24h 二48h 二72h )光镜所见:气管黏膜上皮细胞部分脱落,灶性溃疡形成,纤毛紊乱,黏膜固有层腺体增多,黏膜下层大量炎细胞浸润三芥子气组(72h )电镜所见:杯状细胞细胞膜缺失,线粒体嵴模糊二髓样变;纤毛细胞二基底细胞二成纤维细胞细胞核膜不清,核固缩,染色质边集三 丙二醇对照组气管组织和细胞结构与正常对照组相同三结论 芥子气(2m g /k g )可致大鼠气管组织和细胞急性损伤,组织损伤以黏膜上皮细胞脱落二灶性溃疡形成二黏膜下炎细胞浸润为特征,损伤程度随时 间延长而加重三细胞损伤表现为杯状细胞细胞膜和细胞器损伤,纤毛细胞二基底细胞二成纤维细胞细胞核染色质损伤三 ?关键词? 芥子气; 大鼠;气管损伤;组织形态学;细胞形态学M o r p h o l o g i c a l a s s e s s m e n t o f s u l f u rm u s t a r d -i n d u c e d t r a c h e a l i n j u r y i nr a t s M e n g X i a o *,Z h uX i a o j i ,X u R u i ,Z h a o C h a o ,L i a nC h e n g j i n ,J iP e n g ,W a n g T a o ,J uL i n g y a n ,W a n g M e i h o n g ,G u oW e n j u n ,Z h a n g S h e n g m i n g .*D e p a r t m e n t o f G r a d u a t e ,W e i f a n g M e d i c a lU n i v e r s i t y ,W e i f a n g 261042,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :Z h uX i a o j i ,E m a i l :x i a o j i z h u @163.c o m ?A b s t r a c t ? O b j e c t i v e T oe s t a b l i s ha na n i m a lm o d e l f o r r a t r e s p i r a t o r y t r a c t i n j u r y d u et os u l f u r m u s t a r d (S M ),a n do b s e r v e t h em o r p h o l o g i c c h a n g e s o f t r a c h e a l t i s s u e s a n d e p i t h e l i a l c e l l s i nS M -i n d u c e d i n j u r y .M e t h o d s M a l eS Dr a t s (n =72)w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s (S M g r o u p ,p r o p y l e n e g l y c o l g r o u p ,a n dn o r m a l g r o u p ).T h e r a t s i n t h eS M (2m g /k g )g r o u p w e r e i n j e c t e d i n t r a t r a c h e a l l y w i t h d i l u t e dS M (0.1m l ).H i s t o m o r p h o l o g i c a n d c y t o m o r p h o g i c c h a n g e s o f t h e s p e c i m e nw e r e o b s e r v e du n d e r l i g h t a n d e l e c t r o nm i c r o s c o p y .R e s u l t s I n t h e S M g r o u p ,h i s t o m o r p h o l o g i c c h a n g e s i n c l u d e d s h e d t r a c h e a l e p i t h e l i a l c e l l s , f o c a lu l c e r f o r m a t i o n ,d e r a n g e dc i l i a ,i n c r e a s e d g l a n d s i nt h e l a m i a p r o p r i a m u c o s a e ,a n d i n f l a mm a t o r y c e l l s i n v a d i n g t h es u b m u c o s a .T h ec y t o m o r p h o l o g i cc h a n g e s w e r ea s f o l l o w s :t h ec e l l u l a r m e m b r a n e s l a c k i n g ,m e d u l l a r y c h a n g e s i n t h em i t o c h o n d r i aw i t hd i f f i c u l t t od i s c e r n m i t o c h o n d r i a l c r i s t a e a p p e a r e d i n g o b l e t c e l l s ,a n dd i f f i c u l t t od i s c e r nk a r y o t h e c a ,k a r y o p y k n o s i s ,a n dm a r g i n a t i o no f t h en u c l e a r c h r o m a t i n i nc i l i a ,b a s a lc e l l s ,f i b r o b l a s t s .T h es t r u c t u r eo ft r a c h e a lt i s s u ea n de p i t h e l i a lc e l l so ft h e p r o p y l e n e g l y c o l g r o u p w a s t h e s a m ea s t h e c o n t r o l g r o u p .C o n c l u s i o n s S M (2m g /k g )c a nc a u s ea c u t e i n j u r y o f t i s s u e s a n dm u l t i - e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e r a t t r a c h e a .T h e d e g r e e o f i n j u r y i s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e d t o t h e d u r a t i o no f t i m e .S M m a i n l y a f f e c t s t h ec e l l u l a rm e m b r a n e sa n do r g a n e l l e so f g o b l e t c e l l s ,a sw e l l a s n u c l e a r c h r o m a t i no f c i l i a ,b a s a l c e l l s ,a n d f i b r o b l a s t s .?K e y w o r d s ? S u l f u rm u s t a r d ;R a t ;T r a c h e a l i n j u r y ;H i s t o m o r p h o l o g y ;C y t o m o r p h o l o g y 四 765四国际呼吸杂志2014年4月第34卷第8期 I n t JR e s p i r ,A p r i l 2014,V o l .34,N o .8