CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT-1720, EX527一定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。

实验日期：2015/08/22-2015/08/27

实验项目：CCK8法检测细胞增殖

实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心

实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰

实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响

主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒

主要仪器：酶标仪

实验步骤：

一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。

2、设置4个细胞浓度梯度：0，2000，4000，8000，每组4个复孔。

3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。）

图一、标准曲线

二、细胞增殖检测

1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37℃，5% CO2的条件下）。

2、向培养板加入10μL SRT-1720（终浓度3um）,EX527（终浓度100um）。

3、将培养板在培养箱孵育约24h

4、每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育2小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。

图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。

分析：

SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影响。

小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞（293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

细胞增殖教学设计

《细胞的增殖》教学设计 巨鹿二中王耀华 一．教材分析： 细胞的增殖是必修一《分子与细胞》第六章第1节的内容。是学生在学习了细胞生命系统的物质组成、结构之后，来认识细胞这个系统的产生、发展和消亡的过程。细胞分裂的三种方式中，有丝分裂是最主要、同时也是最重要的方式。多细胞生物的生长发育过程中，体细胞的增多就是通过有丝分裂实现的。无论是单细胞真核生物还是多细胞生物他们各种形式的无性生殖也是通过有丝分裂完成的。有丝分裂还是学习减数分裂的基础，而减数分裂知识又是学习遗传变异规律的基础。由此可见有丝分裂是非常重要的基础知识。因此在教学过程中一定要讲透，要让学生真正掌握有关知识。 二、学情生分析： 高一的学生由于在初中基本上不学习生物学，对生物学中的一些基本概念不甚了解，而且缺乏一定的空间感，故对本节内容的学习比较困难。因此要借助多媒体或模型来帮助理解。三．教学方法： 本节课教学内容理论性强、抽象复杂，所以课前我指导学生做好预习，课堂上充分利用多媒体辅助教学，增强教学的直观性和形象性性通过上一节课的模拟探究使学生了解了细胞增殖的必要性，明白了生物体的生长还要靠细胞增殖增加细胞数量。可以通过不同方式，从不同的角度进行分析，要充分调动学生参与整个学习过程。通过学习使学生了解到认识和分析一个生命现象可以有多种不同的方法——除了一般的文字描述外，还可以用图形描述特点；用图解和表格突出重点；用曲线描述量的变化规律和趋势；通过实验观察、验证生物学知识等……。使学生在掌握知识的同时了解一些常用的生命科学研究的基本方法。在讲有丝分裂各时期的主要特点时，我采用了FLASH动画逐步演示有丝分裂各时期，很好地让学生感受细胞分裂过程的动态性和连续性。黑板粘贴模型克服了多媒体手段转瞬即逝的弊端，较好地化难为易，化抽象为形象。 四．教目学标： （一）知识目标： 1、了解真核细胞增殖的方式及意义。 2、理解细胞周期的概念。 3、准确描述细胞有丝分裂各阶段的重要特征。了解动、植物细胞有丝分裂过程的异同。 4、掌握有丝分裂的过程、特征和意义。尤其是DNA和染色体的规律性变化。 （二）能力目标： 1、学习用曲线图描述DNA和染色体数量的变化规律 2、通过学习有丝分裂过程培养学生分析图像、解读图像的能力。 3、通过实验培养学生制作临时装片的技能，培养学生的观察、分析能力以及识图和绘图能力。 （三）情感态度与价值观： 1、通过对细胞周期以及有丝分裂过程中DNA和染色体的规律性变化的学习，培养学生树立唯物主义的世界观。使学生对生命的运动性、对事物发展变化过程中由量变到质变的转化等哲学问题有正确的认识。 2、通过对实验思路的分析和对实验现象的观察培养学生实事求是的科学态度和严谨的科学工作作风。 五．教学重难点： 教学重点：1、细胞周期的概念。

Brdu细胞增殖检测实验

Brdu检测细胞增殖实验 实验操作: 孵箱中培养72h（细胞密1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO 2 度至50-60%左右）。 2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu 以铺满整个dish底面为准。) 3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。4．变性：将固定好的细胞爬片用PBS洗3次，每次5min，2mol/L的HCl在37℃条件下变性5min，可放置于37℃恒温孵箱，应用封口膜把培养皿封好。（120r/m）5．中和：0.1mol/L的硼酸钠（PH8.3）中和10min，PBS洗3次，每次5min。（50r/m）6．加入1ml的0.2%TritonX-100，10min。 7．吸出TritonX-100，用PBS洗3次，每次5min。 8．加入1ml 3%的BSA封闭，室温1h，可在摇床上晃动。 9．吸出BSA，用PBS洗3次，每次5min。 10．加一抗（尿嘧啶脱氧核苷Brdu（鼠单抗）1:200），用1%BSA稀释，4度过夜。11．将孵好一抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 12．加二抗（羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 594 1: 100），用1%BSA稀释，避光室温孵育1h。（60 r/min） 13．将孵好二抗的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 14．加DAPI染细胞核，储存浓度为1mg/ml，应将DAPI完全混匀，可用手弹几下，一般稀释比例为1:1000（用PBS稀释），避光室温反应10min。 15．将DAPI染好的细胞爬片用PBS洗3次，每次10min。 16．中性树胶封片，荧光显微镜观察，200×镜下取5个视野，计数Brdu阳性细

CCK8法检测细胞增殖预实验

SRT-1720, EX527 —定要应用在白血病细胞株起作用的浓度方可比较对 293T细胞和白血病细胞株的不同影响，请重复实验。 实验日期：2015/08/22-2015/08/27 实验项目：CCK8法检测细胞增殖 实验地点：广西医科大学药基楼14楼生物靶向中心 实验人员：高宗燕、宁海萍、李登峰 实验目的：检测SRT-1720/EX527刺激293T细胞后对细胞增殖的影响 主要试剂：SRT-1720,EX527,CCK8试剂盒 主要仪器：酶标仪 实验步骤： 一、制作标准曲线（测定细胞具体数量时） 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞至96孔板。 2、设置4个细胞浓度梯度：0, 2000，4000，8000,每组4个复孔。 3、接种后培养24小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养4小时后测定OD值，制作出一条以细胞数量为 横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（试用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。） 图一、标准曲线 二、细胞增殖检测 1、在96孔板中配置100卩泊勺细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时（在37C, 5% CO2的条件下）。 2、向培养板加入10 ^L SRT-1720（终浓度3um）, EX527 （终浓度100um）。 3、将培养板在培养箱孵育约24h 4、每孔加入10卩L CCK溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育2小时。

6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 图二、3um SRT1720刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线呈S形，符合细胞正常生长情况。 图三、100um EX527刺激293T细胞后的细胞增殖曲线。该曲线前部分呈S形，符合细胞正常生长情况，但 在进入对数期之后曲线有下滑，之后进入平台期。 分析： SRT1720为SIRT1特异性活化剂，在前期实验中对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，此次实验中SRT1720对正常细胞（293T）的生长无明显抑制作用。暗示SIRT1的活化对正常细胞的生长可能无明显影 响。 小剂量EX527为SIRT1特异性抑制剂，在前期实验中大剂量EX527对白血病细胞株的生长表现出抑制作用，而小剂量EX527无此效应，此次实验中大剂量EX527对正常细胞（293T）的生长可能有轻度抑制作用。但不能以一次实验结果做出肯定的结论，该实验还需重复。

CFSE细胞增殖实验

准备： 1.20ml预冷5%FBS(HI)-PBS 2.50ml 预冷MACS buffer 3.70um滤网 4.2.5ml RBC lysis 5.LS column 6.50ml 37度预热PBS 7.50ml 37度预热complete culture medium(RPMI 1640 +10% Heat Inactivated FBS+10 mM HEPES+1 mMpenicilline streptomycin+ 50 mM 2-mercaptoethanol) （一）CD3抗体包被 取96孔板每孔加入100ul 10ug/ml anti-CD3抗体（PBS）密封4度过夜。 （二）淋巴细胞获取 1.小鼠的脾脏结摘取于10ml 冷5%FBS-PBS中。 2.于70um滤网研磨滤过，500g 4度5min离心后弃上清。 3.2.5ml RBC lysis裂红5 min，10ml 冷5% PBS终止。

4.500g 4度5min 离心后弃上清，10ml MACS buffer重悬，计数。留取105 个细胞进行FACS。 （三）磁珠分选na?ve CD8a+ T细胞 1.Centrifuge cell suspension at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 2.Resuspend cell pellet in 400 μL of MACS buffer per 108 total cells. 3.Add 100 μL of Naive CD8a+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail per 108 total cells. 4.Mix well and incubate for 5 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 5.Add 200 μL of MACS buffer per 108 total cells. 6.Add 200 μL of Anti-Biotin MicroBeads per 108total cells. Add 100 μL of CD44 MicroBeads per 108 total cells. 7.Mix well and incubate for an additional 10 minutes in the refrigerator (2?8 °C). 8.Wash cells by adding 10ml of MACS bufferper 108 cells and centrifuge at 300×g for 10 minutes. Aspirate supernatant completely. 9.Resuspend up to 108cells in 500 μL of MACS bu ffer. 10.Place LS column in the magnetic field of a suitable MACS Separator.

细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法

细胞增殖实验（MTT法）的步骤及方法 一、技术简介 细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。 MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 二、实验流程（以贴壁细胞为例） 1. 收集对数期细胞，调整浓度。 2. 将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后（约4-12 h）加药。 3. 5% CO2，37 o C孵育一定时间。 4. 每孔中加入200 μL MTT溶液（配制成5 mg/ml），培养4 h。 5. 吸去孔内的培养液，加入150 μL DMSO，可继续孵育4 h，使结晶物充分溶 解。 6. 取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在570 nm下 测量吸光值。 7. 结果统计分析。

MTT分解比色法测定细胞生存和增殖

MTT reduction - a tetrazolium-based colorimetric assay for cell survival and proliferation Contributed by Joan M. Chapdelaine Pharmakon Research International, Inc.Waverly, PA, 18471 INTRODUCTION In 1983, a quantitative colorimetric assay for mammalian cell survival and cell prolifera-tion was proposed by Mosmann.1 The assay is dependent on the reduction of the tetrazo-lium salt MTT (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) by the mitochondrial dehydrogenase of viable cells to form a blue formazan product. The assay measures cell respiration and the amount of formazan produced is proportional to the number of living cells present in culture. The assay has been shown to be a simple, rapid alternative to counting cells by dye inclusion/exclusion, monitoring the release of 51Cr from lysed cells, or the incorporation of [3H]-thymidine into cellular DNA. The MTT assay has been used with a growing number of cell types including primary cultured cells as well as established cell lines. This colorimetric microplate assay is cost effective because of the number of tests which can be performed at one time without the problem of radio-isotope and contaminated materials disposal. Applications of the MTT assay The use of the colorimetric assay for cell growth and cell survival offers major advantages in speed, simplicity, cost, and safety over conventional cell counting assays. Figure 1 shows in a block diagram form how the MTT assay can be substituted for the thymidine uptake assay. The MTT assay has fewer steps, uses fewer materials, and does not carry the added burden of radioactive waste disposal. Application Note 5

细胞增殖MTT检测经验总结

细胞增殖检测：MTT实验经验总结 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。 MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色 培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。 MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！ 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：

细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解

如有侵权请联系网站删除 细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 精品资料

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

细胞增殖细胞周期的测定方法

苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 1 “细胞增殖”相关知识的建构（2 课时）一、减数分裂与基因的分离、自由 组合定律请画出能体现基因自由组合现象的细胞分裂图像 例1、（08 江苏）某种昆虫长翅（A）对残翅（a）为显性，直翅（B）对弯翅（b）为显性，有刺刚毛（D）对无刺刚毛（d）为显性，控制这3 对性状的基因均位于常染色体上。现有这种昆虫一个体基因型如下图所示，请回答下列问题。（1）长翅与残翅、直翅与弯翅两对相对性状的遗传是否遵 循基因自由组合定律，并说明理由。。（2）该昆虫一个初级精母细胞产生的精细胞的基因型为____________。（3）该昆虫细胞有丝分裂后期，移向细胞同一极的基因有。（4）该昆虫细胞分裂中复制形成的两个D 基因发生分离的时期 有______ 。（5）为验证基因自由组合定律，可用来与该昆虫进行交配的异性个体的基因型分别是 _______________________________________________ ____________________________ 。二、细胞分裂与可遗传变异请画出可遗传变异种类的概念图苑中2011 届高三生物二轮专题复习学案 2 1、基因重组（非同源染色体的自由组合、交叉互换）例2、（07 广东）在减数分裂中每对同源染色体配对形成四分体，四分体中的非姐妹染色单体 之间经常发生交换。实验表明，交换也可以发生在某些生物体的有丝分裂中，这种现

象称为有丝分裂交换。图39—1 是某高等动物一个表皮细胞发生有丝分裂交换的示意图，其中D 和d，E 和e，F 和 f 表示某对同源染色体上的三对等位基因。图39—1 交换 过程示意图（左：交换前的染色体；右：交换后的染色体）（1）请问该细胞在发生有丝分裂交换后，产生几种基因型 的子代表皮细胞？并分别写出基因型 _______________________________________________ __________________。（2）如果不考虑该生物产生配子时发生的交换，那么该生物产生的配子有几种基因型？并 写出基因型 _______________________________________________ _____________。（3）如果图39—1 是该生物的精原细胞在产生精细胞时发生减数分裂交换后的结果，请问由它产 生的配子类型有几种？并写出基因型 ______________________________。（4）如果细胞在减数分裂和有丝分裂中都发生交换，你认为哪一种分裂方式对于遗传多样性的贡献更大？为什么？ _______________________________________________。 2、染色体变异（染色体结构变异、染色体数目变异）例 3、（10 苏州高二期末）右下图表示某生物体的细胞进行减数 分裂过程中，其中联会的两对染色体之间出现异常的

细胞增殖实验(MTT assay)

MTT实验 一．实验原理 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制 将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。 三．实验步骤 1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清， 正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。 2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性 测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。） 3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基 稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含 0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结 晶的生成。 4.结晶的溶解及吸光值测定：结晶生成后，轻轻吸出原培养基，加150μLDMSO溶解， 室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。 5.根据实验设置的需要，每隔一定时间重复测定细胞的活性，收集数据；同时进行重复 实验，以保证结果的准确性。

脾细胞增殖实验

淋巴细胞转化试验（Lymphocyte Transformation Test， LTT） [ 来源：点击数： 278 更新时间： 2009年08月26日 ][ 收藏本文 ] T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如植物血凝素 Phytohemagglutimin，PHA）或特异性抗原刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加并能进行分裂，成为淋巴母细胞，即为淋巴细胞转化现象。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体细胞免疫水平。因此可作为测定机体免疫功能的指标之 一、形态学检测法 【原理】 淋巴细胞在有丝分裂原（PHA或ConA）或特异性抗原刺激下发生转化，产生一系列变化如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变成淋巴母细胞。通过母细胞转化率，了解机体的细胞免疫状态。 【材料】 Wright-Giemsa染液细胞培养液：多用RPMI1640。按说明书配制后抽滤除菌，临用前加入20%无菌NBS、PHA 50～200μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml）。 肝素（400单位/ml，用Hanks液配制），0.5 ml可抗凝血5 ml。 2.5%碘酒、75%酒精。 载玻片、无菌棉签、无菌注射器5 ml及7号针头、试管毛细滴管、培养瓶、高压灭菌器、CO2孵箱或恒温培养箱、水平离心机、无菌过滤器、各种吸管、超净台。 【方法】 1．灭菌器材将注射器及针头、吸管、培养瓶等高压灭菌，0.103 Mpa（15磅/吋2）20 min。2．分装培养液于各培养瓶中，每瓶2 ml。 孵箱培养72 h，期间3．抽取静脉血0.2 ml，无菌操作注入培养瓶内，立即摇匀，置37℃、5%CO 2 每天旋转摇匀1次，使细胞充分混匀。 4．培养后，摇匀细胞，倒入离心管内，1000 r/min离心10 min。 5．由于大的细胞离心后居上层者较多，只吸上层细胞推片计数，结果易偏高。所以准确计数方法是在倒净上清后，残留与管壁的少量液体回流至管底后，用毛细滴管吹打将管内细胞打散，置1滴于玻片上，用毛细滴管前端刮片，均匀分布于全片，染色，按头、体、尾三段各1～2纵列（计数走向似城墙形）进行计数，以减少分布不均带来的误差，每片计数100～200个淋巴细胞。记录转化和未转化的淋巴细胞数，求出转化率。 【结果】 1．用形态学方法判断转化率，掌握淋巴细胞的形态学至关重要，应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染色性、核结构和核仁的有无等特征进行判别。 ⑴成熟的小淋巴细胞：与未培养的小淋巴细胞一样为6～8μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。 ⑵过度型淋巴细胞：比小淋巴细胞大，约10～20μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。 ⑶淋巴母细胞：细胞体积增大，约20～30μm，形态不整齐，常有小突起，核变大，核质染色疏散，有明显核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。 ⑷其它细胞：如中性粒细胞在培养72 h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 2．计算转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过度型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞，在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60～80%，如为50～60%则偏低，50%以下则为降低。 问题： 1．T，B淋巴细胞在何种情况下能发生转化现象？何谓转化现象？

细胞cck 检测实验

细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含10%FBS、80U/ml 青霉素及0.08mg/ml链霉素的培养基中，放入３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度的培养箱中培养，每２天换液１次。 2）倒去培养瓶内的培养液； 3）加入PBS2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 4）加入胰酶500ul/0.5ml2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 5）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 7）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm3分钟，倒去上清液； 8）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 9）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 10）在96孔板中，给每孔加100μL（约10000个细胞）的细胞悬液，每组设５个复孔，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；11）向培养板中加入100ul含药物培养基 12）将培养板在培养箱干预24、48、72ｈ后，每孔加入20ulCCK-8液，在培养箱继续培养0.5-２ｈ，酶标仪检测450nm处吸光值（A），计算抑制率 抑制率＝（阴性对照A值－二甲双胍各浓度A值）／阴性对照A值×100% 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 13）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定，吸光度不会发生变化。 CCK8对照组的设置及测定的注意事项

《细胞增殖》第1课时-细胞增殖实验

《细胞增殖》第1课时|细胞增殖实验 一、教材内容分析（一）教学内容的地位《细胞增殖》是高中生物必修教材第二章《生命活动的基本单位――细胞》中第二节内容，它是建立在已经学习第一节《细胞结构和功能》，掌握了细胞的基本结构及功能的基础之上来学习该节内容，同时，为学习第五章《生物的生殖、发育》中减数分裂和第六章《遗传和变异》中遗传的基本规律知识奠定基础，起到了承前启后的作用，并且是历年来高考的重要考点，在近五年的各地高考试卷中，总分达47分，具有十分重要的作用。（二）教学目标1、知识目标知道细胞增殖的方式、意义以及无丝分裂的过程和特点。识记有丝分裂细胞周期的概念；动植物细胞有丝分裂过程的异同点；有丝分裂的特征和意义。应用有丝分裂过程各时期的特点。2、能力目标1）凭借有丝分裂过程图、图文结合，培养学生的识图能力，形象思维能力。2）运用坐标曲线归纳出有丝分裂过程中染色体数目DNA含量变化，培养学生的分析能力。3）情感目标细胞分裂――运动是物质的根本属性，建立生命活动的唯物主义观点。（三）教学重点、难点1、教学重点真核细胞有丝分裂的细胞周期的概念和特点以及真核细胞有丝分裂的过程。2、教学难点真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体的变化特点。 二、教学对象分析首先，作为高二的学生，已经具备了一定的阅读能力、自学能力，对于一些基础知识可由其自学；其次，生物这门学科是高二初开的一门学科，学生对其学习的方法和技巧欠缺，有关生物的基础知识积累少；第三，激发学生对于生物这门学科的学习兴趣也很重要。三、教学时间安排由于学生实际情况，加之本节内容知识点多，学生理解较为困难，因而教学时间安排为3课时（讲授2课时，实验1课时），本次说课内容仅限于第1课时（内容：细胞增殖方式、意义；有丝分裂细胞周期的概念，植物细胞有丝分裂过程）。四、教法和学法学生是教学的主体，让学生积极参与到探求知识的过程中，主动去获取知识，这是现代教学理念的基本观点，因而，在本课教

EDU-细胞增殖检测

荧光显微镜检测方法(以96孔板，A549贴壁细胞为例) 细胞培养 取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理 (可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。 EdU标记 1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基； 注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(<2h)宜采用高浓度(10~50 μM)，长时间孵育(>24h)宜采用低浓度(1~10μM)； 2)如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例； 3)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。 表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参考 注：1)*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜； 2)悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。 1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基； 注：1)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2)，大多数细胞系均可采用2小时孵育时间； 2)EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给(表1)； 1.3 PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。 注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。 表2 EdU孵育时间设定参考

注：1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多； 2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变化。 表3细胞实验EdU孵育浓度及时间参考 注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。细胞固定化 2.1 每孔加入50μL 细胞固定液(即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；注：1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。 2)可采用其他方式进行细胞固定。 2.2 每孔加入50μL 2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

MTS细胞增殖检测方法

MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒 产品组成： 产品编号BB-4204-1 BB-4204-2 BB-4204-3 规格250 assays 500 assays 1000 assays MTS溶液 2.5ml 5ml 10ml 产品简介： BestBio贝博MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒是应用新型的水溶性甲臢化合物[3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），内盐；MTS]快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。 MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的甲臢化合物，新陈代谢活跃的活细胞内的脱氢酶类将MTS转化成液态可溶的甲臢化合物，这种甲臢化合物在490nm的吸收值可以直接在96孔板上测量，而不需要另外作处理。由490nm测量的吸收值所表示的甲臢产物的数量与培养物中活性细胞的数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。 活性测定使用方法： 1、收集细胞，加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100 l培养基）。 2、置37℃，5% CO2孵育过夜，倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。 4、每孔加入10 ul MTS溶液，37℃孵育1-4 小时。 5、测定490 nm各孔的吸光值。 5、同时设置空白孔（培养基和MTS溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和MTS溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。 结果分析 ： 细胞活力计算： 将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。 细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100 数量测定使用方法： 1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2、按比例(例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5 个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加MTS试剂培养一定时间后测定O.D值， 制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，O.D值为纵坐标(Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入MTS后的培养时间)。