去除选择标记基因的Cre_lox重组系统在植物中的应用

生物工程学报 C hin J Biotech 2009, October 25; 25(10): 1459-1463 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, ? 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM , All rights reserved

Received : July 18, 2009; Accepted: August 26, 2009

Supported by : National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100503), the Special Program for Research of Transgenic Plants (No. 2008ZX08010-002)

Corresponding author : Xiaokun Li. Tel: +86-431-84533348; E-mail: xiaokunli@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html,

国家高技术研究发展计划(863计划) (No. 2007AA100503), 国家转基因生物新品种培育重大专项(No. 2008ZX08010-002)资助。

去除选择标记基因的Cre/lox 重组系统在植物中的应用

刘秀明1, 孟欣欣1, 李海燕1,2, 杨晶1, 付宏歧1, 李校堃1,3

1 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心, 长春 130118

2 吉林农业大学生命科学学院, 长春 130118

3 温州医学院, 温州 325035

摘 要: 获得无选择标记基因的转基因植物越来越受到研究者的重视。目前, 应用得较广泛的去除选择标记基因的方法有共转化法和位点特异性重组法, 其中位点特异性重组系统中Cre/lox 重组系统研究最多。以下介绍了Cre/lox 位点特异性重组系统的原理、特点及其近几年在植物中的应用, 针对本实验室在这一领域的研究情况, 重点阐述了Cre/lox 系统的应用前景。随着植物反应器研究领域的不断壮大, 去除筛选标记基因是植物反应器研究的必然趋势。 关键词: 无选择标记基因, Cre/lox 重组系统, 转基因植物

Application of the self excision Cre/lox system in plants

Xiuming Liu 1, Xinxin Meng 1, Haiyan Li 1,2, Jing Yang 1, Hongqi Fu 1, and Xiaokun Li 1,3

1 Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development , Jilin Agricultural University , Changchun 130118, China

2 College of Life Sciences , Jilin Agricultural University , Changchun 130118, China

3 School of Pharmaceutical Sciences , Wenzhou Medical College , Wenzhou 325035, China

Abstract: Marker-free plants have been public concern. Co-transformation and site-specific recombination system are more important methods in self-gene excision. We reviewed the Cre/lox site-specific system and its applications in plants, also, we discussed perspectives of the system in according with our experience.

Keywords : marker-free gene, Cre/lox site-specific recombination system, transgenic plant

近年来, 随着植物反应器的研究领域的壮大, 利用基因工程手段在植物中导入目的基因加工和生产蛋白的研究越来越多, 这就引起了转基因植物的安全生产问题。在利用植物反应器生产药用蛋白及疫苗的研究中, 常用的植物表达载体均含有选择标记基因和目的基因, 借助选择标记基因来筛选和检

测转化后的植株。而当目的基因被转入植株中后, 选择标记基因的存在对蛋白的提取、纯化及生产却带来了隐患, 人们担心利用植物作为生物反应器生产蛋白会带来非目的产品的基因工程产物, 同时它也引起了消费者和环境学家对生态环境和食品安全性问题的关注和担忧[1]。因此, 构建无选择标记基因

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的植物表达载体或消除转化后植物中的标记基因就显得至关重要。

所谓获得无选择标记基因的植物是指直接构建不含有选择标记基因的表达载体, 或者构建含有标记基因的载体, 然后经过后代的基因重组与分离剔除标记基因。目前, 已经在番茄[1]、马铃薯[2]、烟 草[3]、油菜[4]、玉米[5]、大豆[6]、小麦[7]等多种植物中获得了无选择标记基因的植株。

1 无选择标记基因的应用概述

在植物作为生物反应器的研究过程中, 主要用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因作为标记基因来筛选含有目的基因的植物。但是, 一旦目的基因被验证已转入到植物中去, 筛选标记基因的存在就显得没有意义了, 甚至会产生副作用。因此, 无论是含有抗性基因的转基因植物品种改良还是应用在植物反应器中所引入的抗性基因都引起了人们对食品和生物的安全性的怀疑, 特别是在利用植物生产药用蛋白的研究中, 引入的抗性基因可能会影响到目标蛋白的结构和功能, 对投入到田间释放和临床生产中的植物及蛋白更会产生威胁。因此, 去除植物中的选择标记基因是今后植物反应器研究领域的必然趋势。

去除植物中选择标记基因的方法主要有共转化法、转座子技术、位点特异性重组法及直接构建不含有选择标记基因和载体骨架的载体[8]。共转化法是指将目的基因和选择标记基因分别构建到不同载体或同一载体的不同区域, 将多种载体同时转化同一受体植物, 进而筛选出共转化植株的方法[9]。转座子技术是利用基因组中一段可移动的DNA 序列, 通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。位点特异性重组系统主要包括Cre/lox [10]、FLP/frt [11]、R/RS [12-13]。在这些方法中, 应用最多最广泛的是共转化法和Cre/lox 位点特异性重组系统。

2 Cre/lox 位点特异性重组系统

2.1 原理

Cre/lox 重组系统主要通过Cre 重组酶对lox 序

列进行切割和重新连接, 介导lox 序列发生特异性重组。Cre 重组酶通过一定的途径被激活后, 即可通过诱导型启动子诱导, 专一性地识别34 bp 的lox 位点, 进而同向lox 位点之间的全部DNA 序列会由于发生重组而被剔除。通常情况下, 在构建表达载体时, 将目的基因以外的其他基因(筛选标记基因和报

告基因)定位在同向的2个lox 位点之间, 通过Cre 重组酶的引入剔除lox 位点之间的基因。利用位点特异性重组系统培育无选择标记基因植株的一般步骤是先获得含有目的基因的抗性植株, 二次转化导入重组酶基因实现筛选标记基因的删除和重组酶的分离。

2.2 特点

Cre/lox 重组系统的特点: 1)在不同物种中的重组功能稳定; 2)不需要任何辅助因子, 仅需要Cre 和lox 的识别位点; 3)lox 位点是Cre 酶的专一识别位点, 导入Cre 重组酶后会使lox 位点间的全部序列剔除掉。基于以上特性, Cre/lox 重组系统已被成功应用于烟草、番茄、大豆、马铃薯、水稻等多种植物的无筛选标记基因的研究中。

3 Cre/lox 重组系统在植物中的应用

多数研究表明, Cre 重组酶需要通过不同的诱导启动子启动而发挥作用, 常用的诱导方法有热激诱导、组织特异性启动子及化学方法等, 不同的研究方法已经被应用到不同植物中。对于报告基因的启动表达, 应用最多的是CaMV 35S 启动子, 一般放于lox 位点前[14-16]。

将Cre/lox 重组系统应用在烟草上的技术已经成熟, 无论是质体转化还是核转化均有报道。Lutz KA 等[17]利用Cre/loxP 位点特异性重组系统获得了无标记基因的转化烟草。用基因枪法转化烟草的叶片, 通过将来自核基因的Cre 蛋白定向到质体中, 达到选择标记基因的自动消除。Chakraborti D 等[18]也在烟草中进一步证实了利用Cre/lox 位点特异重组系统在转化植株后代中去除标记基因的有效性和可行性。作者分别用含有lox 位点和Cre 基因的双元载体转化烟草, 通过T0代植株的杂交, 在T1代植株中获得了19.2%的选择标记基因的消除效率。宋

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洪元等[19]利用Cre/lox 位点特异性重组系统转化烟草, 导入Cre 重组酶基因后剔除了筛选标记基因, 通过植株开花后自交又使重组酶发生分离而获得无选择标记基因的植株。

3.1 Cre 重组酶的热激诱导

热激诱导是一种诱导Cre 基因产生重组酶的常用方法, 利用热诱导可以消除lox 位点间的选择标记基因, 再通过后代的PCR 筛选产生无选择标记基因的植物。Cuellar W 等

[20]

将Cre/lox 重组系统应用

到马铃薯上, 构建了新型植物转化载体pCIP54/55, 即是通过热诱导技术最终消除了Cre 及2个lox 位点之间的npt Ⅱ基因, 消除效率达到了4.7%。段小瑜 等

[21]

利用来自大豆基因组 DNA 中的热激蛋白启动

子gmhsp17.5 c, 目的是通过热诱导来启动Cre 基因的表达, 构建了一套组成型植物无标记转化的诱导表达Cre/lox 重组系统。

3.2 应用组织特异性启动子启动Cre 基因表达

在Cre/loxP 位点特异性重组系统中发展较快的

是在构建表达载体时加入组织特异性启动子, 这在转基因后代中可以特异地删除标记基因。Li 等[22]从拟南芥中克隆了胚特异性启动子app1, 并将此启动子与选择标记基因一起被克隆到loxP 位点之间, 以GUS 作为报告基因, 用于启动Cre 重组酶基因的表达, 在大豆转化植株的后代分离中发现有30%的无标记基因的植株。Verweire D 等

[23]

在构建Cre/lox 重组

系统的载体中引入了种特异性启动子, 主要是依据不同种系间功能上的差异来启动Cre 基因的表达, 最终获得了不含有选择标记基因的纯和株系。Bai 等

[24]

首先从水稻中克隆了花的特异性启动子

OsMADS45, 然后将其构建到Cre/loxP 重组系统中, 利用OsMADS45启动子诱导Cre 重组酶表达, 将构建好的表达载体利用农杆菌介导法转化水稻, 在T1代中就检测到了无标记基因的植株。Moravcíková J 等[25]尝试了用拟南芥的种子特异性启动子构建Cre/lox 系统的表达载体用于转化烟草, 正常情况下应该在种子中才能消除标记基因, 但在研究中发现T0代植株中就检测到了嵌合体。

3.3 化学诱导法

通过化学方法诱导Cre 基因的表达也有报道。

Zhang 等[26]就用雌二醇诱导的位点特异性DNA 消除选择标记基因的Cre/lox 系统, 成功地获得了具有抗逆性的无筛选标记的烟草植株。Sreekala C 等[27]利用化学方法调节Cre/loxP 位点特异性重组系统, 在转基因后代中获得了11.7%的无选择标记基因的水稻植株。

4 小结与展望

随着Cre/lox 系统研究的不断深入, 这项技术已经在植物反应器研究的各个领域日渐成熟。Cre/lox 位点特异性重组技术使转基因植株中筛选标记基因的去除成为可能, 此系统已被广泛的采纳和使用, 应用的难点在于如何启动Cre 重组酶的表达进而消除lox 位点间的序列, 尽管组织特异性启动子的应用已被成功报道, 但其诱导机制还有待进一步的研究, 不过这并没有限制Cre/lox 在植物中的应用, 特别是在今后的植物反应器的研究领域中, Cre/lox 位点特异性重组系统将会发展成为去除筛选标记基因的首要手段。

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2010年部分生物、农林类学术期刊联合征订表

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大豆科学 14-95 双月刊 60

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biotech@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 生物技术通讯 82-196 双月刊 150 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, swtx@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html,

生物信息学 14-14 季刊 48 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html,

cjbioinformatics@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 微生物学报 2-504 月刊 660 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html,/actamicrocn actamicro@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 微生物学通报 2-817 月刊 576 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html,/wswxtbcn tongbao@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 武汉植物学研究 38-103 双月刊 180 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, editor@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 畜牧兽医学报 82-453 月刊 240 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, xmsyxb@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 遗传 2-810 月刊 600 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, yczz@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 遗传学报 2-819 月刊 600 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, jgg@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 营养学报 6-22 双月刊 108 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, yyxx@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 云南植物研究 64-11 双月刊 150 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, bianji@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 植物遗传资源学报 82-643 双月刊 120 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, Zwyczyxb2003@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, Zwyczyxb2003@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 中国农业科学（中文） 2-138 半月刊 1188 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, zgnykx@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 中国农业科学（英文） 2-851 月刊 432 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, zgnykx@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 中国实验动物学报 2-748 双月刊 120 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, A67761337@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 中国生态农业学报 82-973 双月刊 210 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, editor@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 中国生物工程杂志 82-673 月刊 960 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, biotech@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 中国水产科学 18-250 双月刊 180 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, zgsckx@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html, 中国水稻科学 32-94 双月刊 90 https://www.docsj.com/doc/a28401543.html,

cjrs@https://www.docsj.com/doc/a28401543.html,

作物学报

82-336

月刊

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