应用表达谱基因芯片筛选子宫内膜异位症

?论著?应用表达谱基因芯片筛选子宫内膜异位症

相关差异基因Ξ

周红辉,李亚里,李　洁,关　铮,宗利丽

(中国人民解放军总医院妇产科,北京　100853)

【摘要】　目的:研究子宫内膜异位症患者(E Ms)与非子宫内膜异位症(非E Ms)患者

在位子宫内膜基因表达的差异,从分子水平探讨子宫内膜异位症的发病机制。方法:选用

含有14112位点的人类表达谱cDNA基因芯片,筛选E Ms患者与非E Ms患者不同月经周

期在位子宫内膜的差异表达基因。结果:筛选出增生期差异基因193个,其中上调58个,

下调135个;分泌期差异基因93个,其中上调6个,下调87个;增生期和分泌期共同差异

基因20个,其中上调1个,下调19个。结论:用表达谱基因芯片可有效地研究E Ms患者

与非E Ms患者不同月经周期在位子宫内膜基因表达的差异,通过进一步分析有望筛选出

与E Ms相关的新基因靶点。

【关键词】　基因表达微序列分析;子宫内膜异位症;基因表达

中图分类号:R711.71　文献标识码:A　文章编号:1004-7379(2004)06-0406-04

The differential gene expression profile in endometriosis screened out by cDNA microarrays.

Zhou Honghui,Li Yali,Li Jie,et al.Department o f Obstetrics and Gynecology,G eneral Hospital o f

P LA,Beijing100853

【Abstract】　Objective:T o com pare the differential expression genes between eutopic en2

dometria of patients with endometriosis and eutopic endometria of normal2menstruating w omen with2

out endometriosis and discuss the pathogenesis of endometriosis.Method:The human gene expres2

sion of endometria with endometriosis and without endometriosis in different period of menstrual cycle

with14112human genes of cDNA microarrays was analyzed.R esults:193differential genes ex2

pressed in endometria were screened out in the period of proliferation.Am ong them,58were up2

regulated,135were down2regulated.93genes differential expressed in endometria were screened out

in the period of secretion.Am ong them,6were up2regulated,87were down2regulated.20genes

were screened out both in the period of proliferation and secretion.Am ong them,only1gene was

up2regulated,19genes were down2regulated.Conclusion:cDNA microarray technique is effective in

screening out the differentially expressed genes between normal endometria and endometia of patients

with endometriosis.Further analysis of those obtained genes will be hopeful to find the new diagnos2

tic target about endometriosis.

【K ey w ords】　Microarray analysis of gene expression;Endometriosis;G ene expression

子宫内膜异位症(endometriosis,E Ms)的发病机理尚不明确。近年研究表明,E Ms具有家族倾向性及遗传性,是多基因多因素共同作用的结果。我们利用基因表达谱芯片快速、高效、多参量同步研究大量基因的优势,从分子水平上检测E Ms患者与非患者在位子宫内膜的差异表达基因,广谱分析患者在位内膜正常基因的缺失或突变,异常基因的表达或扩增,为寻找E Ms新的诊治靶点提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　组织材料　取2003年7月至10月在解放军总医院行妇科手术诊断证实为E Ms患者的在位内膜组织和非E Ms(因子宫肌瘤或卵巢单纯囊肿在我院行腹腔镜手术)患者在位内膜

604现代妇产科进展2004年11月第13卷第6期　Prog Obstet G ynecol,N ov.2004,V ol.13,N o.6

Ξ国家自然科学基金重点项目资助课题(3983035);军队“十五”重点项目资助课题(01Z032)

组织各10例(每组增生期5例、分泌期5例),平均年龄35±6岁。患者月经规律,术前3个月内未接受过激素治疗。严格无菌操作下收集新鲜内膜组织,标本一经离体即在20min之内保存到液氮中。标本及其分期经术后病理诊断证实。1.2　芯片类型和其他主要仪器　芯片类型为BiostarH2140s (上海博星基因芯片有限公司),扫描仪型号为Scan Array 4000,图像处理软件为G ene Pix Pro3.0。

1.3　实验方法

1.3.1　探针的制备和芯片杂交

1.3.1.1　总RNA提取　低温下用陶瓷碾体(R Nase2free)将组织碾碎,用T rizol试剂匀浆,离心后上清经氯仿抽提,取上层用异丙醇沉淀,乙醇洗涤,用Milli2Q(RNase2free)水完全溶解RNA沉淀,取样检测RNA OD260/OD280比值并进行总RNA电泳,-80℃保存备用。

1.3.1.2　探针标记与杂交

(1)预杂交:将变性预杂交液加到玻片点样区,盖玻片覆盖,于杂交箱内42℃预杂交5～6h。

(2)标记探针:E Ms患者增生期内膜RNA每份各取6μg混合做为实验组,非E Ms患者增生期内膜RNA每份各取6μg混合做为对照组,分别逆转录后用Cy52dCTP标记实验组,Cy32 dCTP标记对照组,制备探针。分泌期组实验方法同增生期组,所有试剂均为RNase2free,实验均在冰浴中进行。

(3)杂交:探针和预杂交芯片95℃变性后,探针置于芯片上,盖玻片覆盖,在杂交舱内用Parafilm密封,42℃过夜(16～18h)。

(4)洗片:用浓度分别为0.5%、2%、5%的洗涤液冲洗玻片并晾干。

(5)荧光扫描和结果分析　用Scan Array4000扫描仪扫描芯片,观察杂交结果。用G ene Pix Pro3.0图像处理软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度,计算Cy5/Cy3比值。按以下原则处理实验数据并筛选有效差异基因:(1)该基因点的Cy5、Cy3信号值皆大于200,或者其中之一大于800;(2)取Cy5/Cy3比值在0.1～10之间的基因点进行均一化处理,本次实验均一化系数在0.871～1.088之间;(3)Ratio(Cy5/ Cy3)值大于2或小于0.5的基因点认为差异有显著性;(4)实验重复一遍,筛选出两次实验结果上下调趋势一致的共同差异基因,计算平均Ratio值。

2　结　果

2.1　总RNA抽提结果　E Ms患者在位内膜组织和非E Ms患者在位内膜组织抽提的总RNA OD260/ OD280值为1.737～2.047,经电泳证实,获得了高纯度总RNA。

2.2　芯片扫描结果　芯片结果分析,增殖期组获得共同显著差异基因193个,其中上调58个,下调135个;分泌期组获得共同显著差异基因93个,其中上调6个,下调87个。增生期和分泌期共同差异基因20个,其中上调1个,下调19个。部分差异基因相关信息见表1～3。荧光标记散点图见图1。(本文图1见封三)

表1　增生期组部分表达差异基因

G eneBank Ratio1Ratio2Ratio3Definition

NM-0003620.0680.0680.068tissue inhibitor of metalloproteinase3(TI MP3)

NM-0147950.2290.1730.201zinc finger homeobox1b(ZFHX1B)

NM-0020840.2930.1930.243glutathione peroxidase3(plasma)(G PX3)

NM-0013000.2160.2760.246core prom oter element binding protein(C OPE B)

NM-0805460.3970.3510.374C Dw92antigen(C DW92)

NM-0062060.4260.3630.395platelet2derived growth factor receptor(PDG FRA)

NM-016359 2.366 2.692 2.529nucleolar protein ANK T(ANK T)

NM-003064 2.832 2.567 2.700Secretory leukocyte protease inhibitor(S LPI)

NM-000577 2.547 3.211 2.879interleukin1receptor antag onist(I L1RN)

NM-00227423.98714.37819.183keratin13(K RT13)

G eneBank表示NC BI网上数据库录入号,Ratio1、Ratio2分别为两次实验的Cy5/Cy3比值,3Ratio为两次比值的平均值, Definition为基因简要描述(下同)

表2　分泌期组部分表达差异基因

G eneBank Ratio1Ratio2Ratio3Definition

NM-0323640.0550.0620.059cytokine induced protein29kDa(CIP29)

NM-1452950.1090.1700.139similar to zinc finger protein136(LOC199692)

NM-0005180.1610.1770.169hem oglobin,beta(H BB)

NM-0009300.2770.2490.263plasminogen activator,tissue(P LAT)

NM-0186880.3270.3180.322bridging integrator3(BI N3)

NM-0062060.4880.4210.455platelet2derived growth factor receptor(PDG FRA)

NM-0005980.4400.4850.462insulin2like growth factor binding protein3(IG F BP3)

AB0587710.4700.4590.464mRNA for KI AA1868protein,partial cds

AI492875 3.445 2.267 2.856th78b07.x1H om o sapiens cDNA,3′end

NM-000681 2.512 3.235 2.874H om o sapiens adrenergic,alpha22A2,receptor(ADRA2A),mRNA

704现代妇产科进展2004年11月第13卷第6期　Prog Obstet G ynecol,N ov.2004,V ol.13,N o.6

表3　增生期组和分泌期组共同表达差异基因

G eneI D G eneBank Ratio1Ratio2Definition

3895e05 2.184 2.285

0083g10NM-0149090.2730.094KI AA1036protein(KI AA1036)

0091a08AK0547570.1250.046cDNA F LJ30195fis,clone BRACE2001374

0029e010.1830.099

0285c09BG6811420.3420.140602628972F1H om o sapiens cDNA,5′end

0328b04NM-0251550.2090.121hypothetical protein F LJ11848(F LJ11848)

0343c120.1450.028

0344b08BI8273790.0740.017hypothetical protein F LJ11848(F LJ11848)

0348e05NM-0246240.2870.085hypothetical protein F LJ22116(F LJ22116)

0912a05NM-0021920.3870.178inhibin,beta A(activin A,activin AB alpha polypeptide)(I NH BA) 282e12NM-0005820.2920.381secreted phosphoprotein1(early T2lymphocyte activation1)(SPP1)

1900c100.2070.173

2024d12NM-0201300.4270.370chrom os ome8open reading frame4(C8or f4)

2667b06BG7145200.2530.0916********F1H om o sapiens cDNA,5′end

3079f03NM-0062060.3950.455platelet2derived growth factor receptor,alpha polypeptide(PDG FRA)

3148f07NM-0065160.3020.276s olute carrier family2(facilitated glucose transporter),member1(S LC2A1) 3178f040.2370.383

Hs.25195 2.6150.051

u267270.1710.313

x056100.2720.392

G ene-I D:上海博星公司基因编号,G eneBank表示NC BI网上数据库录入号,Ratio1、Ratio2分别指增生期组和分泌期组Cy5/ Cy3比值,Definition为基因简要描述

3　讨　论

3.1　表达谱基因芯片在E Ms中的应用　基因表达谱芯片将大量基因特异的cDNA固定在一块玻璃或硅胶上,利用分子杂交原理,对不同来源的mRNA进行检测,能够研究不同组织、不同细胞、以及组织细胞不同发育阶段中基因的差异表达,从而大规模地对这些基因表达的特异性进行综合分析,是一项探索疾病发生发展的分子机制、提供基因诊断与治疗理论依据的前沿性生物技术。E Ms的发病机理尚不明确,近年研究表明,E Ms患者与非E Ms患者在位内膜存在的基因表达差异,决定其逆流的经血及碎片能否在“异地”粘附侵袭和生长,这种观点从源头定位和定性,可以解释为什么育龄妇女经血逆流发生率高达76%～90%,而E Ms发病率只有10%～15%1。我们利用基因芯片高通量、高灵敏性的优点,参考国外相关文献2,不同个体的E Ms患者样本等比混合,与不同个体非E Ms患者等比混合的样本相比较,消除个体遗传非特异性差异后,寻找与E Ms相关的特异性基因。此外,由于子宫内膜在性激素的调节下结构和功能具有周期性变化,且E Ms 患者不孕率高,可能与患者分泌期内膜改变有关,故我们将实验分为增生期和分泌期两组分别研究。

通过14112点表达谱基因芯片筛选,我们得到的差异基因按其功能主要可以分为以下几类:免疫相关基因;原癌基因和抑癌基因;细胞受体;离子通道和运输蛋白;细胞骨架和运动相关蛋白;细胞凋亡相关蛋白;DNA合成和修复、重组蛋白;DNA结合、转录和转录因子;细胞信号和传递蛋白以及一些未知功能基因。

3.2　临床相关表达差异基因在E Ms发病中的可能作用　在筛选得到的差异基因中,组织金属蛋白酶抑制剂3(tissue inhibitor of metalloproteinase23,TI MP2 3)在增生期组明显下调,分泌期下调不如增生期显著。TI MP是金属蛋白酶(M MPs)的抑制剂,由子宫内膜细胞产生的M MPs在侵袭腹膜及其他结缔组织过程中发挥着重要作用,E Ms患者子宫内膜M MPs 上调以及TI MP下调与内异症的发生发展密切相关。TI MP23能够结合细胞外基底膜(EC M)蛋白,抑制M MP22,M MP29,胶原酶21及基质溶素酶等多种M MPs的活性。由于TI MP对M MPs的抑制减弱, E Ms患者在位内膜比正常内膜更具有侵袭力,导致内膜在腹腔种植进一步形成异位病灶。此外,TI MP2 3具有抗血管生成及诱导细胞凋亡3的作用,它在内膜上表达下调促进异位病灶血管生成及发展。于云英3、Chung4等用其他实验方法研究也证实, TI MP23mRNA在E Ms患者内膜上的表达下调。谷胱甘肽过氧化物酶3(glutathione peroxidase,G PX3)是一种细胞信号和传递蛋白,在正常子宫内膜增殖期和分泌期都有表达2,且其启动子区域有大量的雌、孕激素受体,G PX3减少氧自由基对组织的损害,在

804

现代妇产科进展2004年11月第13卷第6期　Prog Obstet G ynecol,N ov.2004,V ol.13,N o.6

子宫内膜种植期具有避免胎盘受损,创造良好生殖环境的作用,推测G PX3在E Ms患者内膜表达下调可能是导致其高不孕率的原因之一。本研究筛选出抑制素βA(inhibin beta A)在增生期和分泌期内膜上表达都下调,抑制素βA属于转化生长因子(TG Fβ)的超级家族,可以自身聚合或与inhibin B聚合形成二聚体促进FSH分泌,抑制素的表达异常可能通过影响FSH的分泌导致患者不孕。血小板源性生长因子受体(PDG FRA)在患者增生期和分泌期内膜上表达都下调,K ao等7也报道过E Ms患者在位内膜PDG F表达下调。但PDG F与血管生成相关,在患者内膜上表达下调不能解释E Ms具有类似肿瘤血管生成的特性,因此PDG F下调在E Ms发病中的意义有待进一步研究。

E Ms的发病机理非常复杂,是多因素多基因共同作用的结果,在我们筛选出的差异基因中虽然许多目前尚未报道直接与E Ms相关,但是它们通过相互调节,网络调控直接或间接地导致E Ms发生和发展。在粘附、侵袭和血管生成三步曲或“AAA模式”(attachment,aggression,angiogenesis)的理论指导下,对增生期组和分泌期组筛选出来的共同差异基因进行功能检查,对其在异位内膜的生根、生长和生病的作用进行深入研究,将有望发现E Ms新的诊治靶点。

参　考　文　献

1　李亚里,张惠兰.子宫内膜异位症J.中国实用妇科与产科杂志,2002,18:1312172

2　Jane M,Borthwick D,S tephen C,et al.Determination of the transcript profile of human endometriumJ.M olecular Human

Reproduction,2003,9:19233

3　Majid M A,Smith VA,Rasty D L,et al.Adenovirus mediated gene delivery of tissue inhibitor of metalloproteinases23in2 duces death in retinal pigment epithelial cells J.Br J Oph2 thalam ol,2002,86:972101

4　于云英,郭新华,钱金花,等.基质金属蛋白酶29及其组织抑制剂TI MP23在子宫内膜异位症的表达J.现代妇

产科进展,2003,12:25228

5　Chung HW,Wen Y,Chun SH,et al.Matrix metalopro2 teinase29and tissue inhibitor of metalloproteinase23mRNA

expression in ectopic and eutopic endometrium in w omen with

endometriosis:a rational for endometriotic invasiveness J.

Fertil S teril,2001,75:1522159

6　K ao LC,G ermeyer A,Tulac S,et al.Expression profiling of endomertium from w omen with endometriosis reveals candidate genes for disease2based implantation failure and in fertilityJ.

Endocrinology,2003,144:287022881

(收稿日期　2004205220)第一作者简介:周红辉(1978-),女,中国人民解放军总医院妇产科,硕士研究生。研究方向:子宫内膜异位症的发病机理。

?征订启事?

欢迎订阅2005年《现代妇产科进展》杂志

《现代妇产科进展》杂志,是由中华人民共和国教育部主管,山东大学主办的国家级学术期刊。由全国著名妇产科专家江森教授任主编。创刊10余年来一贯执行“理论联系实际,普及与提高相结合的办刊原则”,始终奉行“慎审校,不骄傲,广求教”的编辑方针,不断完善自我,提高办刊水平。2003年《中国学术期刊综合引证报告》本刊影响因子0.634。分别被列入中国科技核心期刊(中国科学技术信息研究所),中国医学核心期刊(中国医学科学院医学情报信息研究所),中文核心期刊?妇产科学类(《中文核心期刊要目总览》2004版)。2004年我们成功地推出了临床热点问题讨论,每期就1～2个临床医生关注的问题,邀请国内著名专家组织研讨,并在此基础上6月25日～7月1日在青岛举办了全国妇产科学临床热点问题研讨会,到会代表700余人,大会邀请了30余位全国著名专家就30个临床热点问题进行了深入研讨,大获成功,受到学术界的广泛关注。2005年,我们将继续做好这个栏目,并将不断调整办刊思路,为更好地为广大作者、读者服务,新的一年,我们将开设继续教育园地。每位读者在订阅本刊后,可获得相应的继续教育学分,请读者、作者关注2005年第一期启事。2005年报刊征订已经结束,衷心希望读者、作者及时把意见和建议反馈给我们,让我们共同为妇产科学的发展奋斗。

欢迎订阅《现代妇产科进展》!

邮发代号:24-104,全年订价:39元,每期订价6.5元,邮局全年订阅。

电话:0531-*******　如邮局订阅不方便或错过邮订时机可以直接汇款至编辑部邮订。

本刊编辑部

904现代妇产科进展2004年11月第13卷第6期　Prog Obstet G ynecol,N ov.2004,V ol.13,N o.6

应用表达谱基因芯片筛选子宫内膜异位症相关差异基因

(正文见406页)

图1　杂交信号强度散点图

X 轴、Y 轴分别代表Cy3、Cy5的荧光强度值,红色数据点代表Y 值与X 值的比值在0.5至2.0之间,黄色数据点代表Y 值与X 值的比值在0.5至2.0之外。

GE7导入系统介导I 型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因联合52FU 治疗卵巢癌的研究

(正文见413页

)

现代妇产科进展

(双月刊)

第13卷　第6期　2004年11月30日出版

1989年10月30日创刊

主 管中华人民共和国教育部主 办山东大学编辑出版山东大学

现代妇产科进展编辑委员会编辑部地址　山东省济南市文化西路107号

山东大学齐鲁医院内邮 编　250012电 话(0531)2169201传 真(0531)2169200E -m ail xd fckjz @https://www.docsj.com/doc/a05356078.html, 主 编江　森编辑部主任孙竹平印 刷山东大学医学印刷厂国内订阅全国各地邮局国内发行济南市邮政局

国外订阅中国国际图书贸易公司 (北京市399信箱)

Progress in Obstetrics and G ynecology

(Bim onthly )

V ol.13N o.6Publication d ate N ov.30,2004S tarted Publication on Oct.30,1989Competent Authorities Ministry of Education of the People ’s Republic of China Sponsor Shandong University Editor and Publisher Shandong University Editorial Board of Prog J Obstet G ynecol

Address Wen Hua X i Lu 107Jinan ,Shandong 250012Shandong University Qilu H ospital T elephone (0531)2169201F ax (0531)2169200

E -m ail xd fckjz @https://www.docsj.com/doc/a05356078.html, Editor in Chief Jiang Sen Managing Director Sun Zhuping Printing Medical Printing H ouse of Shandong University Subscriptions D omestic Local and Nationwide P ost O ffice Domestic Publishing P ost O ffice of Jinan Subscriptions

F oreign China International Book T rading C orporation (P.O.Box 399,Beijing P.R.China )

广告经营许可证号:3700004000173 广告代理:广州市超意文化传播有限公司 ISS N 1004-7379 邮发代号　24-104

C N 37-1211/R 国内订价　全年39元　每期615元