血红蛋白载氧溶液的研究进展
血红蛋白载氧溶液的研究进展
张晖王爱忠江伟
上海交通大学附属第六人民医院麻醉科
由于血源的紧张、致命性血液传播疾病的增加以及急救的需要，激发了人们对人工载氧溶液的极大兴趣。目前研究的人工载氧溶液有两大类，即过氟碳化合物（Perfluorocarbons）和基于血红蛋白的载氧溶液（Hemoglobin-based Oxygen Carrier，HBOC）。过氟碳化合物是通过物理溶解携氧，因而在非纯氧供应时载氧能力有限。而HBOC具有和人红细胞相似的载氧能力、无需配型、无致病源和室温条件下存放时间长等优点，一直是研究的热点之一[1]。
目前制备HBOC的血红蛋白来自牛血、过期的库存人血和重组DNA技术。过期的库存人血来源有限，且人血红蛋白从红细胞释放出来，它们和氧的解离就不再受2,3-甘油酸的调节,其氧解离曲线就显著向左侧偏移,引起P50降低至12-16mmHg(人红细胞内血红蛋白的P50 26.6mmHg) ,而组织氧分压一般不低于20 mmHg,这就意味人游离血红蛋白结合的氧在组织中不易释放出来供组织利用。牛血的载氧特性和人血相似（P50为27mmHg，Hill系数为2.8），但氧解离曲线正常情况下不受2,3-甘油酸的调节，而受到氯离子浓度的调节。血清或溶液中有丰富的氯离子，因而牛血红蛋白从红细胞中释放后其氧解离曲线偏移不明显，并且牛血红蛋白比人血红蛋白有更明显的Bohr效应，提示在缺氧酸中毒的情况下，牛血红蛋白更易释放氧供组织利用。另外牛血来源巨大，一个500kg的牛可产生大约35L浓度为120g/l的血红蛋白溶液，因而目前牛血是制备HBOC的主要血红蛋白来源[2]。虽然最近通过重组DNA技术用大肠杆菌和Sarcomyces Cerevisiae 制备出了经过修改的人血红蛋白，但其缺点为生产量小且可能混有细菌成分。
自然游离的血红蛋白是最早用于动物实验和试用于抢救出血病人的人工载氧溶液。虽然出血动物或患者的血液载氧能力得到了改善，但可引起肾衰、高血压等严重并发症，甚至死亡。即使使用无基质血红蛋白（严格滤过去除红细胞碎片的血红蛋白，stroma-free hemoglobin），这种情况也不能避免。红细胞内的血红蛋白为四联体结构，包括两个α链和两个β链。当红细胞破裂，自然游离的血红蛋白就进入血浆，其四联体结构（分子量为64kd）就分解为二联体（分子量32kd）和单联体（分子量16kd）结构，很快可从肾脏滤出（肾脏的滤过阈值64kd）
并堵塞肾小管引起肾衰。输入自然游离的血红蛋白引起高血压的原因在发现血管舒张因子一氧化氮后才给予明确，认为游离的血红蛋白可快速灭活一氧化氮，导致血管收缩，血压升高。这些表现类似临床上输血时的溶血反应。
早期的HBOC研究主要是对自然游离的血红蛋白进行化学修饰和改变以加固血红蛋白四个链之间的连接或通过聚合的方式增大血红蛋白体积，减少血红蛋白从肾脏的滤过，延长它们在血管内的存留时间。这类HBOC有分子内交联血红蛋白、聚合血红蛋白、偶合的血红蛋白[3]。分别通过血红蛋白分子内修饰、分子间的聚合以及把其它大分子物质结合到血红蛋白分子上等方式，增大了分子的大小，减少其滤过。最近在南美上市的牛聚合血红蛋白溶液（Hempure）就是其中一种。这些HBOC虽具类似自然红细胞的载氧能力，明显减少肾衰的发生，但输入人体后，仍可灭活血管活性物质一氧化氮和一氧化碳，引起循环功能障碍，从而减弱或抵消了用HBOC增加组织氧供的作用[4]。另外游离的血红蛋白可发生自身氧化，形成高铁血红蛋白，并引发自由基连锁反应，损害组织细胞[4]，这种作用在机体已产生大量氧自由基的情况下（如创伤、缺血再灌注）可能是致命的，而这些病人正是欲用HBOC抢救的主要对象。这也是百特公司最近不得不放弃研究了二十多年的双阿斯匹林交联的血红蛋白的主要原因[5]。
为了避免裸露的血红蛋白引起的副作用，人们尝试用脂质体来包裹血红蛋白（liposome encapsulated hemoglobin，LEH）制备类似自然红细胞的HBOC。LEH 避免血红蛋白和血管壁的直接接触，减少了心血管反应，进一步明显延长了血管内存留时间，并且表面LEH无抗原，不会引起抗原抗体反应。以往大都用二肉豆蔻酰-卵磷脂（Dimyristoyl-phosphatidylcholine）、二肉豆蔻酰-甘油磷脂（Dimyristoyl-phosphatidylcholine）和胆固醇等物质形成类似生物细胞膜的磷脂双层结构来包裹血红蛋白。但目前有两大原因限制了它从动物实验进入临床实验。一是大量脂质体包囊进入机体，可增加机体脂质负荷，并且它们能迅速被网状内皮系统（RES）摄取，降低机体的抗感染能力。有研究显示LEH输入后，大鼠可出现致命性感染[6]；二是脂质体包囊在血流的冲击下易破碎或变形[7]。
为减少脂质体包囊对机体的影响，近年有人试用可生物降解的聚乳酸（PLA）作膜材包裹血红蛋白来制备血红蛋白微囊（HbV）[8]。聚乳酸是由丙交酯开环聚合置备的生物降解材料，其降解后可生成二氧化碳和水，具有可靠的安全性，因
而其作为第一批能包裹药物的可生物降解材料被美国FDA批准用于临床。另外用聚乳酸包裹的HbV，对亲水性小分子有通透性，这样可使还原剂扩散到囊内，把其中的高铁血红蛋白还原为具有携氧功能的二价铁血红蛋白[9]。
为减少RES对包裹药物的微囊的摄取，药剂学近年发展了一项新技术，即隐形纳米粒技术[10]。隐形是指包裹药物的纳米粒进入血循环后可以避开肝脏等RES的摄取，在循环中长时间存在。隐形的关键在于如何使巨噬细胞将纳米粒误认为是自体物质。目前常用的隐形方法是把聚乙二醇（PEG）等亲水性聚合物共价结合或吸附到纳米粒或微囊的表面。PEG吸水后可在纳米粒或微囊的表面形成较厚的水化膜，这样就使网状内皮系统和吞噬细胞把纳米粒或微囊误认为是水分而避免被吞噬。PEG也具有良好的柔韧性，即高分子链可以自由摆动，在纳米粒或微囊的表面形成类似电子云的“保护云”，阻止调理素对纳米粒或微囊的调理作用（吞噬过程的第一步）。另外水化膜的形成增加脂质体或微囊的亲水性，使它们在极性溶剂中更稳定，有利于延长存放半衰期[11]。
肌动蛋白是生物细胞骨架微丝的组成部分,分子量为420kd,有球状肌动蛋白(G-actin)和丝状肌动蛋白两种存在形式,可互相转化。包裹肌动蛋白的脂质体作为真核细胞的模型已被用于研究细胞的发育、移行等复杂的过程。Li等[12]最近把肌动蛋白导入LEH（以磷脂双层为膜材）水性核心，不但增强了LEH的结构支持，增加了其机械稳定性，而且首次使LEH被塑为盘状。
参考文献：
1 Cohn SM. Oxygen therapeutics in trauma and surgery. J trauma,2003;54:s193-s198.
2. Dietz NM，Joyner MJ，Warner MA. Blood substitutes: fluids,drugs,or miracle solutions? Anesth Analg, 1996;82:390-405.
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4 Buehler PW, Alayash AI. Toxicities of hemoglobin solutions: in search of in-vitro and in-vivo model systems.Transfusion ,2004;44:1516-1530.
5.Proctor KG..Blood substitutes and experimental models of trauma. J trauma,2003;54:s106-s109.
6 Rudolph AS. Encapsulated hemoblobin: current issues and future goals.Artif Cell Blood Subsit Immmobil Biotechnol, 1994;22:347-
7. Chung TW,Hwang GH,Chen WK,Lee CJ. The effects of plasma and shear force on the stability of liposome encapsulated haemoglobin in vito testing. J Chin Inst Chem Eng 1997;28:407-13360
8. Cedrati N, Maincent P, Thomas F, Labrude P, Vigneron C.Preparation and
characterisation of poly(lactic acid) hemoglobin microspheres.Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 1994;22(3):867-73.
9 Yu WP，Chang TMS.Submicron polymer membrane hemoglobin nanocapsules as potential blood substitutes:preparation and characterization. Artif Cells Blood substit Immobile Biotechnol, 1996:24:169-184
10 汪杨，吴伟。隐形纳米粒的体内靶向性。中国药学杂志，2004；39（1）：7-11。11丁劲松，杨敏，陈琼聚乙二醇衍生化磷脂与脂质体立体稳定性，中国医药工业杂志，2004；35（1）：55-58
12、Li.SHL,Nickels J,Palmer AF.Liposome-encapsulated actin-hemoglobin artificial blood substitutes.Biomaterial,2005; 26:3759-3769