生物膜研究进展

细胞生物膜的研究进展

在自然界、某些工业生产环境（如发酵工业和废水处理）以及人和动物的体内外，绝大多数细菌是附着在有生命或无生命物体的表面，
以生物膜（biofilm,BF）方式生长，而不是以浮游（planktonic）方式生长。BF是细菌在机体表面形成的高度组织化的多细胞结构，
同一菌株的BF细菌和浮游生长细菌具有不同的特性。虽然人类第一次借助显微镜观察的是人牙菌斑BF细菌，但多年来经典细菌学主要是
研究浮游生长的细菌，但多年来经典细菌学主要是研究浮游生长的细菌，而忽视了对BF细菌的研究。
随着对细菌致病机制的深入了解，发现BF细菌对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强，从而导致严重的临床问题，尤其是慢性和
难治的感染性疾病，因此，开始重视对BF的研究。20世纪30年代中期，Gibbons和van Houte等对牙菌斑BF细菌和龋病的关系做了大量研究，
为深入了解BF细菌在健康和疾病中的作用奠定了基础。现在已知，细菌可在人体组织如牙齿、牙龈、皮肤、肺、尿道及其他器官的表面形成BF，
引起诸如牙周病、龋齿、慢性支气管炎、败血病、血栓性静脉炎、难治性肺部感染和心内膜炎等疾病。在血液、组织液和淋巴液等体液中一
般不形成BF。但由于这些体液含有适合细菌生长的有机营养成分，因此，当体液中含有细菌时，这些细菌可在人体内人工医疗装置
（如隐型眼镜、人工关节和心脏人工瓣膜）等无生命物体的表面形成BF。此外，BF细菌还可污染与人类生活相关的设施，如空调系统、
供水系统和食品加工设备等，由此造成传染病的流行。据估计，大约65%人类细菌性感染是由BF细菌引起的。
BF研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学和数学等多学科，其真正作为一个独立学科发展起来始于20世纪70年末。90年代
后，随着相关学科的发展及对BF细菌在医学上重要性的认识，BF研究得到迅速发展。1990年，蒙大拿州立大学建立了世界上第一个生物膜工程
中心。近几年，美国国立卫生研究所（NIH）也为此投入大量研究资金。目前，国内外越来越多的学者从事BF研究，以期了解BF形成的分子机
制、生理生化特点及其调控机理等，其目的为控制BF的相关感染。
一、细菌生物膜的特点
细菌生物膜（BF）,国内也有学者译为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。BF中
水份含量可高达97%。除了水和细菌外，BF还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。因此，BF中存
在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、

RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质。
BF多细胞结构的形成是一个动态过程，包括细菌起始粘附、BF发展和成熟等阶段，BF细菌在各阶段具有不同的生理生化特性。
（一）细菌粘附：细菌对宿主表面的粘附是细菌在宿主体内形成BF的第一步。这种粘附作用主要是细菌表面特定的粘附素蛋白（adhesin）
识别宿主表面受体（receptor）的结果，因此具有选择性和特异性。宿主组织表面的蛋白、糖蛋白和糖脂常可作为受体，而选择性地吸附特定
种类的细菌。细菌粘附于表面可免于被流体带到不利于其生长的环境，例如，生长在尿道中的大肠杆菌具有高度进化的表面结构，牢固地附着
在尿道内，免于被尿液冲出体外。细菌可很快发生粘附，便如，内氏放线菌（Actinomyces naeslundii）对附着在羟基磷灰石小球上的酸性富
含脯氨酸的蛋白粘附，约1小时吸附即趋于饱和。在细菌粘附阶段，由于缺乏成熟的BF结构保护，细菌的抗性不强，因此，抗菌药物的疗效相
对较好。
（二）BF的发展：细菌粘附到表面后，即调整其基因表达，在生长繁殖的同时分泌大量胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）。EPS可粘
结单个细菌而形成细菌团块，即微菌落（microcolony）。大量微菌落使BF加厚，因此，EPS分子的产生对BF结构的发展十分重要。在此阶段，
除观察到EPS合成的增加外，也经常观察到细菌对抗生素抗性的提高。另外，还伴有诸如增加对紫外线的抗性、遗传交换效率、降解大分子物
质的能力以及增加二级代谢产物的产率等特性的改变。变化是细菌为适应自然环境而采取的生存策略，但正是BF细菌的这些特性导致了严重的
临床问题。
（三）BF的成熟：成熟的BF形成高度有组织的结构，利用激光共聚焦显微镜（confocal scanning laser microscope, CSLM）观察到成熟
BF结构是不均匀的，即具有不均质性（heterogeneity），它是由类似蘑菇形状的微菌落组成的，在这些微菌落之间围绕着输水通道，可以运
送养料、酶、代谢产物和排出废物等。因此，有人将成熟的BF内部结构比喻为原始的循环系统。当细菌在增殖时可因菌种、营养、附着的表面
和环境条件不同，形成疏松或致密以及厚薄不等的BF结构。
在BF成熟过程中，除了与上述EPS的产生有关外，细菌的密度感应系统（quorum sesing system）起重要作用。例如，铜绿假单胞菌
（Pseudomonas aeruginosa）的密度系统突变株，与野生菌相比，其形成的BF较薄，缺少复杂的结构，且抗性较差。细菌密度感应系统是
细菌通过监测其群体的细胞密度来调节其特定的基因表达，以保证BF中营养物质的运输和废物的排出，避免细菌过度生长而造成空间

和营养
物质缺乏。革兰阴性细菌的密度感应系统大多是利用N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones, AHL）作为信号分子，AHL浓度随
细菌密度的增加而上升，当AHL达到一个阈值时，可与一种转录激活子结合而激活，AHL和转录激活子复合物进一步诱导靶基因的表达。成熟
的BF 内在的调节机制或在外部冲刷力等作用下可部分脱落，脱落的细菌又转变成浮游生长状态，可再粘附到合适的表面形成新的BF。
由于BF的形成是一个动态过程，且结构上存在不均质性，因此，BF中的细菌是在不同时间和空间发展的，其基因表达和生理活性也具有
不均质性。BF垂直方向不同层面的细菌RNA含量、呼吸活性和蛋白质合成均不同。同时由于细菌所处微环境的PH和氧化还原电位等不同，可
使遗传学上一致的细菌个体表现不同的特性，如产生毒素不同可使BF中一些细菌个体对宿主无危害，而另一些细菌则可能对宿主有致命威胁。
因此，不均质性是细菌BF的另一个重要特性，也与细菌的抗性有关。
从理论上讲，BF是细菌在表面生活时采取的生长方式，这是细菌的一种本能，任何细菌均可形成BF。但是，当细菌的一种本能，任何
细菌均可形成BF。但是，当细菌发生遗传改变时，可影响其形成BF的能力，并有可能影响其致病性。有些细菌的毒力因子（如菌毛等）与
形成BF能力有关，则其毒力强弱可影响其BF的形成。具体到某一菌株能否形成BF，是与环境信号有关的。环境信号包括营养成分、温度、
渗透压、pH、铁离子浓度和氧化还原电位等，其中营养成分对BF的形成起重要作用。例如，铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌几乎可在任何右
以生长的条件下形成BF，大肠杆菌（Escherichia coli）K-12和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的一些菌株在基础培养基条件下不能形成BF，
但是，大肠杆菌0517：H7只在低营养培养基条件下形成BF。如菌株是由表面分离的，一般该菌株具有形成BF的能力。不是由表面分离的菌株，
可用微量反应板方法测定其形成BF的能力，其基本步骤是在微量反应板的孔中培养细菌，形成的BF将吸附于孔壁，洗掉浮游细菌后，用
结晶紫染色法观察是否形成BF。
BF可由纯菌种形成，也可由多菌种组成。在多菌种BF中，不同菌种在不同的时间和空间发展，存在着菌种的交替演变。牙菌斑是典型
菌种BF，革兰阳性链球菌（Streptococcus）和放线菌是牙菌斑BF中早期定植菌种，它们的粘附表面受体，例如，梭杆菌（Fuso-bacterium）
可通过共凝集作用（coaggregation）粘附到链球菌和放线菌上面。另外，链球菌和放线菌的代谢造成局部微环境改变（氧化还原电位和pH等）
也为

新菌种的演变创造了条件，例如，一些兼性厌氧菌的生长消耗氧气，从而创造了厌氧微环境，使绝对厌氧梭杆菌有可能在口腔这一开
放环境中得以定植生存。因此，多菌种BF扩大了细菌的生存环境。
二、生物膜细菌致病的机制
(一) 抗生素抗性：与浮游细菌相比，BF细菌对抗生素的抗性可提高10-1000倍。BF细菌抗药性主要取决于其多细胞结构：（1）BF中的
EPS起屏障作用，限制抗生素分子向细菌细胞运输。多糖蛋白复合物还可与一些药物反应，具有中和药物的活性；（2）BF中微环境的不同可
影响抗生素的活性，如局部酸性代谢产物的积累对许多抗生素的活性有拮抗作用。厌氧微环境可严重影响氨基糖苷类抗生素的活性等。此外，
营养的消耗或抑制性代谢产物的积累可使一些细菌生长缓慢或停止分裂，这类细菌一般对抗生素敏感性差。在此，BF结构的不均质和BF细菌
生理上的不均质性渗入的药物只能杀死一部分细菌，而另一部分细菌则存活下来；（3）表面生长可诱导细菌表达与浮游细菌不同的基因，
诱导产生BF特异性表型。例如BF中的一部分细菌可进入一种类似牙孢菌的分化状态，其对抗生素有高度抗性；（4）多菌种BF中各菌种的协
同作用。例如，产生β-内酰胺酶的菌种可保不产生此酶的菌种免受青霉素的作用。
（二）对抗机体免疫防御：BF细菌可利用多种方式对抗机体免疫防御机制：（1）减少细胞因子（cytokine）的产生或酶解细胞因子。例如，
表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）浮游细胞刺激人血淋巴细胞产生的γ干扰素量是BF细胞的8-16倍；（2）抵抗单核巨噬细胞的
趋化作用；（4）BF细菌可刺激机体产生抗体，但这些抗体不仅难以灭杀BF内部的细菌，而且可在BF表面形成免疫复合物，损伤周围的机体
组织；（5）BF诱导的补体转化和中性粒细胞呼吸明显下降。
值得指出的是，一种BF抗药或抗体机体免疫防御的机制不是单一的，往往有多个机制共同起作用。另外，不同菌种的抗性机制也不尽相同。
三、生物膜相关感染的控制
常用抗生素疗法对细菌BF引起的感染疗效欠佳。随着细菌耐药因子的传播，传统抗生素的疗效更为有限。在这种情况下，细菌BF的研究
为抗细菌性感染特别是难治慢性感染提供了崭新的途径。
（一）从细菌BF中鉴定新的抗生素物质，发展新型抗生素类药物。新药的设计目标是破坏BF的形成，因此，凡是与BF的动态变化和结构
形成有关的分子转化、代谢活性和信号传导过程，均可作为新药研制的目标。1999年Schneewind研究组在革兰阳性菌金黄色葡萄球菌
（S.aureus）中发现了一种转肽酶（sort

ase）,它与表面蛋白的分泌定位有关。该酶缺陷株不能表达表面蛋白，从而大大减弱对宿主的
粘附性和致病性。转肽酶基因几乎存在于所有革兰阳性细菌中，因此，它是一种很有价值的新药目标，能抑制转肽酶形成的药物预计能
有效预防革兰阳性细菌引起的感染。EPS和细菌密度感应系统等均可作为筛选新药的目标，新药可干扰EPS和AHL信号的合成，或降解已形成
的EPS和AHL。其特点是不杀死细菌，而只是破坏细菌在宿主体内的粘附、定植和形成保护性的BF，这样细菌发展抗药性的环境压力较弱，
因此不易产生抗药性。
（二）研究人体健康微生物BF的组成及其与宿主和睦相处的分子机制，发展新型抗感染微生态制剂。值得指出的是，并非所有BF都是有
害的，人体带有大量正常微生物，与人类健康息息相关。新型抗感染微生态制剂将着眼于增进有益的正常微生物BF活性，通过竞争营养、
空间和产生微生物拮抗物质，特异性抑制病原菌的粘附、定植和在生物膜中的代谢，克服由于传统抗生素的使用所引起的下常菌群失调、
真菌二次感染和抗生素抗性等问题。目前，国内外开发的微生态制剂主要有三类：即益生菌（probiotics）,如双歧杆菌和乳酸杆菌等；
益生元（prebiotics），即益生菌和益生元同时并用的生态制剂。
（三）发展抗细菌粘附的生物材料，预防BF污染各种临床应用的导管、插管和医用合成材料。表层镀银的合成材料可预防BF污染心脏人
工瓣膜和导尿管等ge面镀钛的人工声带可防止假丝酵母（Candida）污染。
（四）对现已应用的抗生素，研究其尚未被发现的抗BF特性和新药的治疗方案。据报道，联合使用抗生素效果良好。Yamasaki等发现
罗红霉素和亚胺硫霉素合用能有效杀灭金黄色葡萄球菌BF，其机制与增强多形核白细胞和巨噬细胞对BF的渗透有关。罗红霉素和氟罗沙星
对铜绿假单胞菌BF有明显抑制作用，两者合用可治疗由铜绿假单胞菌BF引起的难治性感染，其中罗红霉素通过抑制细菌多糖蛋白复合物合
成来增强氟罗沙星对BF的渗透，对氟罗沙星杀灭BF中细菌起增效作用。目前应用的抗生素主要是通过测定其杀菌或抑菌活性筛选获得的，
但有必要应用新的筛选标准，如抗细菌粘附等，重新判定已知抗生素的抗BF活性。
总之，BF的研究使微生物学的发展迈出了重要一步，即认识到微生物可以以多细胞的生命形式存在，具有比以往所理解的更为复杂的
生命活动。同时，这一领域的研究将大大丰富人类控制细菌性感染的手段。当前，各种先进的生物技术被用于BF的研究，例如，利用激光
共聚显微镜和原子力显微镜研究BF的

结构和动态变化；利用报告基因和荧光探针了解BF中的基因表达；利用基因芯片和双向电泳技术比较
BF细菌和浮游细菌基因表达和蛋白组成的区别等。可以预见，随着BF研究的深入，人类将能更好地控制细菌性感染。

摘自：《中华微生物学和免疫学杂志》2002年5月第22卷第3期