微生物生物膜研究的新进展
收稿日期：2012-08-24；修回日期：2012-09-05
作者简介：贾文祥，医学微生物学教授，博导，西藏大学特聘教授。主要研究方向为病原微生物的致病机制及其药物筛选。
E-mail：jiawenxiang@sina．com ·专家论坛·
微生物生物膜研究的新进展
贾文祥
（四川大学华西医学中心，成都610041）
摘要：微生物在生长过程中为适应生存环境而形成了生物膜，Dr．Costerton JW在生物膜方面的研究为我们开拓了微生物学的新领域。微生物生物膜是由微生物群体及其包被的细胞外多聚物和基质网组成，它们彼此黏附或者黏附到组织或物体的表面。微生物生物膜与微生物的耐药性形成、基因的转移以及引起机体的持续性感染等都密切相关。目前对生物膜的研究重点已经深入到微生物相互间的信号传递、致病基因的转移以及如何干预微生物生物膜的形成等方面。此外，在治理污水和环境保护工程、生物材料工程和食品工业等方面，微生物生物膜技术已经得到了应用。
关键词：微生物生物膜；研究进展
中图分类号：Q73文献标志码：A文章编号：1005-5673（2012）05-0001-09
Progress in microbial biofilm research
JIA Wen-xiang
（Huaxi Medical Center of Sichuan University．Chengdu610041，China）
Abstract：Objective Dr．Costerton’s initial discovery on biofilm illuminated an entirely new aspect of microbiological re-search．Biofilms are generally defined as aggregates of microorganisms that are embedded within a matrix of extracellular polymeric substances（EPS）and adhered to each other and/or to surfaces．In industrial environments，biofilms can devel-op on the interiors of pipes and lead to clogs and corrosion．In medicine，biofilms spreading along implanted tubes or wires can lead to chronic persistent infections in patients．As a matter of course，bacteria in a biofilm have significantly different physiological characteristics，the most well known of which is increased resistance to antibiotics．Further research will focus on their signal transduction system，pathogenic gene transfer and controlling biofilm formation．In addition，biofilm technol-ogy has been applied in treating contaminated water，environmental protection，biomaterials and food industry．
Key words：Microbial biofilm；Research progress
1674年荷兰人Antonie van Leeuwenhoek采用自制的显微镜从牙菌斑中观察到了微生物的存在，引起了人们对微生物的兴趣。此后，法国Louis Pasteur 和德国Robert Koch教授相继对细菌的生理学和形态学等开展了深入的研究，为微生物学学科的建立奠定了基础。细菌学家们对分离纯化的单一细菌进行了全面的研究，所研究的对象是浮游细菌（Plank-tonic cell），因此人们对细菌的认知多限于对单个细菌生命活动的特点。换句话说，多年来经典细菌学主要是研究的浮游生长细菌。但实际上在自然界所分布的细菌，98%以上都是以群体的方式而存在的。20世纪30年代，Gibbons和Van Houte等对牙菌斑细菌和龋病的关系做了大量研究，为深入了解牙菌斑细菌在龋病中的作用奠定了基础。Bayston和Penny（1972年）通过扫描电镜观察到大量表皮葡萄球菌在导管表面定植，发现有多层细菌分布在多糖-蛋白复合物中形成膜状复合物。1978年美国Costerton JW［1-2］基于对呼吸机导管污染的细菌群体所引发相关性肺炎的研究结果，提出了Biofilm（细菌生物膜或微生物生物膜，国内有的也译为生物被膜）这一专用名词，得到了国际学术界的认同。从此推动了细菌生物膜作为一个独立学科的研究热点。细菌生物膜的基本概念是指细菌在生长过程中附着于非生物或生物表面、由自身产生的胞外聚合物（主要为胞外多糖，蛋白和胞外DNA）及其基质网
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微生物学免疫学进展2012年第40卷第5期Prog in Microbiol Immunol Oct．2012，Vol．40，No．5 DOI:10.13309/https://www.docsj.com/doc/1715173688.html,ki.pmi.2012.05.001
包裹的有三维结构的菌细胞群体。这是细菌在生长过程中为适应生存环境而形成的一种特殊的生存方
式，也是与浮游（单个）细胞相对应的存在形式。因此，
也有学者［3］
形容细菌生物膜的结构类似于我们人类的社区，胞外聚合物类似于房屋，细菌类似于居住在房屋中的居民，这就形成了相对稳定的生物膜结构（见图1），细菌以微菌落的形式分布在生物膜中。胞外多糖通过影响生物膜中细菌密度、水通道、离子分布等因素，进而影响生物膜整体结构以及细菌在其中的生存状态
。
图1
生物膜结构
细菌生物膜的研究涉及到微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学、环境科学和数学等多学科交叉。20世纪90年代后，随着上述相关学科的发展
以及对细菌生物膜在医学上重要性的认识，细菌生物膜的研究也得到了迅速发展，在世界各地相继成
立了细菌生物膜研究中心或研究室。众多学者对细菌生物膜的形成、
生物学特性以及与人类的感染和疾病的关系进行了深入的研究。
现在已知，细菌可在人体组织如牙齿、皮肤、肺、尿道及其他器官的表面形成生物膜，引起诸如龋齿、牙周病、慢性支气管炎、血栓性静脉炎、难治性肺部感染和心内膜炎等疾病。生物膜内的细菌具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统作用的能力，感染部位的细菌一旦形成生物膜或污染生物材料的细菌形成了生物膜，即便使用正常剂量成百倍的抗生素药物也不易治愈，成为了临床上难治性感染疾病重要原因之一，引起了人们的极大关注。
2011年4月，由口腔疾病研究国家重点实验室、四川大学华西口腔医学院和美国加州大学洛杉矶分校联合在成都举办了国际微生物生物膜会议，所收集的会议论文及大会报告等表明，国内在生物膜领域的研究内容广泛，研究队伍众多。其中有代
表性的如闻玉梅、
周学东、马旅雁、余加林、陈一强和王睿等课题组。国外以丹麦Neils Hiby 领衔的课题
组（包括宋志军、吴红等华人学者）在临床微生物学
中密切结合了细菌生物膜的研究，研究成果显赫，从
基础研究到临床研究独树一帜。2011年7月，由欧洲临床微生物学会在丹麦哥本哈根大学举办了第六
届国际微生物生物膜大会，
Costerton JW 作为领军人物在这两次大会上都作了引人深思的精彩报告。在
此基础上，人民卫生出版社迅速出版了国内第一本“微生物生物膜与感染”专著，首次系统地介绍了国内外微生物生物膜的基础研究和临床应用的成果。在2011年，新加坡政府投入巨资建立了微生物生物
膜研究基金，
以吸引全球相关领域的人才去新加坡开展研究。为此，本文作者把当今微生物生物膜领
域的主要研究进展及热点做一简要概述。不幸的是Costerton J W 教授在今年4月因患胰腺癌而去世，这篇综述文章也算是作为对这位细菌生物膜研究先驱者的缅怀吧。
1
目前取得的主要进展
1．1
微生物生物膜在持续性感染中起着重要的作
用
1999年Costerton 等在美国“科学”杂志上发表的综述［4］
中，明确提出了细菌生物膜是引起细菌持续性感染的常见致病机制，大约60%的临床感染病例，都与细菌生物膜的形成有关。该文发表后被引用的次数即达3000次以上，
促进了细菌生物膜的基础研究和临床研究。根据世界卫生组织（WHO ）颁布的《院内感染防治实用手册》中的有关数据，全世界每天有超过1400万人正在遭受院内感染的痛苦，其中60%的细菌感染与使用的医疗器械有关。人体内如呼吸道、牙菌斑、体内短期或长时间留置的人工装置（如导尿管、人工关节、人工瓣膜、支架等）上均有细菌生物膜的广泛存在，且具有极强的耐药性。据美国国家卫生研究院（NIH ）的初步统计，80%的细菌性疾病与细菌生物膜有关，由此衍生出了生物膜病（Bacterial biofilm diseases ）的概念。
随着现代医学高科技的发展，新型生物材料的应用日益增多，各式各样的导管，如气管导管、动静脉导管、胃管、腹膜透析管、导尿管等已广泛应用于临床治疗的各个领域，有机物质如白蛋白、纤维蛋白原、血小板及无机物质如微量元素等在导管表面沉积后，改变了导管的亲水性和极性，有利于细菌黏附并形成生物膜。气管导管（Endotracheal tube ，ETT ）广泛应用于临床气管插管或气管切开，伴随着ETT 的广泛应用，其并发症如气道黏膜损伤、气道阻塞、感染等也日益增多，其中尤以感染问题最为突出。
有调查资料显示，气管插管相关肺部感染的发生率每天增加1% 3%，保留导尿管3d的患者并发尿路感染的概率在90%以上，动静脉插管相关感染的发生率为2% 3%。
根据流行病学调查，医用生物材料相关感染的发生率逐年上升。导尿管相关泌尿系统感染发生率为92% 93%，约占院内感染的40%；心脏外科生物材料植入术合并感染发生率为33%；99%的机械通气患者气管插管处有细菌定植并反复发生感染；大静脉导管，伤口引流管，人工关节置入等相关感染的发生率也很高。伴随而来的是高并发症或严重的后遗症。危重者还必须将导管或人工植入物移除，加重了患者的痛苦和医疗资源的巨大浪费。
近年来，随着抗菌药物不断问世，感染性疾病的防治有了很大的改善，然而一些难治性感染，即便使用经药敏试验确定为有效的抗生素，也只能短暂缓解临床症状。Neils Hiby［5］和Donlan等［6］在临床微生物学的工作中，发现生物医学材料与生物膜相关感染的细菌主要涉及到革兰阳性的肠球菌、葡萄球菌、链球菌和革兰阴性的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、变异链球菌和铜绿假单胞菌等。人类的许多慢性和难治感染性疾病如慢性呼吸道感染、慢性泌尿系统感染、慢性骨髓炎、感染性心内膜炎、肺结核、中耳炎、前列腺炎、牙周炎等都与细菌生物膜的形成相关。
1．2微生物生物膜与细菌的耐药性密切相关以前的传统观点认为细菌耐药性主要与细菌的下列因素有关：药物通透性障碍、主动外排机制、药物作用靶位的改变以及细菌产生的药物灭活酶、钝化酶。但后来人们发现在体外药敏试验中，对感染菌敏感的药物用于临床治疗仍然难以奏效。近年来，经过对某些反复发作的慢性感染患者的病因研究后，部分学者提出了细菌生物膜病的观点，认为细菌对抗生素的耐药性不仅与耐药菌株的出现有关，亦与致病菌在一定条件下的特殊生存状态有关，如形成了细菌生物膜。生物膜内的细菌对抗生素和宿主免疫系统的抗性很强，一旦在医源性生物材料表面或机体内形成，往往引起久治不愈和反复发作的感染。
根据细菌在生物膜内所处位置的不同可分为：表层菌和深层菌。表层菌容易获得营养和氧气，代谢产物也容易排出，因此表层菌的生理代谢比较活跃，细菌分裂较快；深层菌处于生物膜深处，缺乏营养和氧气，因此代谢缓慢，常常处于休眠或静止状态，细菌分裂也很慢。当应用抗生素后，因药物难以渗入到深层菌，不仅难以有效清除生物膜，而且还可诱导深层细菌产生耐药性。
目前有关细菌生物膜与细菌的耐药性形成相关的学说较多，主要有文献［7］所述如下：
生物膜的渗透限制作用：由于细菌产生的胞外多糖等胞外基质，形成了相对致密的网状结构，把细菌包被在其中，因此在细菌外部形成了分子屏障和电荷屏障，可阻止或延缓某些抗生素的渗入。
生物膜的营养限制学说：生物膜内的细菌由于营养供应不足，长期处于饥饿状态，同时还有大量代谢废物堆积，故细菌生长速度缓慢，代谢水平低，分裂也不活跃，处于静止状态。由于细菌的代谢率降低，抗生素通过作用于代谢环节去影响细菌活性的概率也降低，也就容易引起细菌耐药。营养限制机制与渗透限制机制二者密切相关，
基因表型学说：认为生物膜内细菌基因的表达与浮游菌不同。与浮游菌相比，生物膜菌还启动了一些特殊基因的表达，虽然仅占整个基因组小部分，但有可能对生物膜耐药至关重要。如铜绿假单胞菌形成生物膜时大约有1%基因不同于其浮游状态，而大肠埃希菌在生物膜状态下约有10%的基因表达明显不同于浮游细菌，其中1．9%基因表达活性上调或下调2倍以上，表明这些基因大多与生物膜内细菌处于相对缓慢的代谢以及形成的耐药状态有关。
密度信号感应系统（Quorum sensing，QS）：QS 对细菌耐药性的调控作用目前发现主要表现在两方面：一是通过调控生物膜的形成，提高菌群耐药性；二是直接参与多重耐药外排泵的调控，提高细菌耐药性。QS对生物膜形成基因进行调节的同时也对细菌耐药相关基因进行着调节。目前QS对细菌外排泵的调控作用已得到证实。QS对多重耐药外排泵表达的调控作用，表现为既可调节多重耐药泵表达，同时QS自身也受到多重耐药泵表达水平的影响。一方面，QS可调节外排泵基因的表达。例如，脆弱拟杆菌中QS自诱导分子受体LuxR可对外源性的高丝氨酸内酯作出反应，上调bmeB外排泵的表达，而形成对抗生素的耐药。另一方面，QS自身也受到外排泵表达水平的影响。大肠埃希菌固有耐药和获得性耐药主要是受几个外排泵调控的，而部分外排泵（如RND）将药物排出胞外形成耐药的同时也可将QS自诱导分子排出胞外，提高其胞外自诱导分子的浓度，加重了机体的细菌感染，所以外排
泵的高表达促使QS可能进一步激活，促进了QS对毒素、感染因子合成与外排泵表达的调控作用，增强细菌的感染性与侵袭力。在抗生素存在的情况下，耐药基因在生物膜中高表达的现象也十分普遍，如亚胺培南存在的情况下，耐药基因ampC可在生物膜中高表达，这种生物膜菌高表达而游离菌不表达或低表达的情况，说明QS在调节生物膜形成的同时也对这些耐药相关基因的表达进行了调节。1．3微生物生物膜内细菌基因的转移
根据DNA片段的来源及其交换的方式不同，在细菌间自然发生的基因水平转移有转化、接合、转导、溶原性转换等方式。基因水平转移可以发生在同种细菌之间，也可以发生在不同种细菌之间。基因水平转移能使细菌在短时间内产生新的基因型个体，改变物种特征，以适应环境的变化。细菌间的基因水平转移非常活跃，在细菌的进化和物种的形成中具有重要意义。
在细菌生物膜中，DNA通过接合和转化的转移效率高于浮游菌。细菌通过遗传物质的频繁交换来抵抗环境中的有害物质的攻击（如噬菌体、毒素及抗生素等），同时基因的转移过程对生物膜的形成和稳定也起到促进作用。生物膜中高效的基因水平转移，不仅是细菌短期内一种可诱导的适应性能力的体现，也影响其物种的发展和进化。QS也参与了质粒与整合酶的调控，生物膜菌体间质粒传递率较浮游菌显著提高，而在多重耐药菌中广泛存在的与耐药基因整合转移有关的Ⅰ类整合酶也在生物膜内表达明显增高。质粒和整合酶与耐药基因的传递和转移密切相关，因而QS或许也在耐药基因的传递和转移中发挥了重要的调控作用［8-11］。
1．4新的实验和检测技术
丹麦Neils Hiby教授的实验室采用铜绿假单胞菌作为模式菌，开展了一系列细菌生物膜相关的深入研究，取得了显著的成就。与此同时，他们也建立了许多成熟的研究方法［12］。
目前相对成熟的生物膜实验技术可分为两大类，即体外模型和体内模型。体外模型包括细胞培养系统、细胞标记方法、定量或定性检测方法和数据分析等。是在体外环境来研究微生物形成生物膜的能力、生物膜的结构特征、生物膜形成的分子机制，外界环境因素如何对生物膜的形成造成影响等。体内模型主要是研究生物膜与感染宿主之间的相互作用，包括生物膜附着在宿主内部或表面，如牙齿、器官组织、人工植入导管等表面的生长情况、生物膜在感染宿主体内被免疫系统及抗生素治疗后的清除情况、生物膜感染对感染宿主的影响等，是研究开发生物膜感染治疗方法的重要环节。
1．4．1体外法①静态生物膜培养系统（Static culture system）采用分批式培养（Batch culture）的方法，常用来观测细菌在1 2d内的生物膜形成情况。在这种系统下形成的生物膜结构需要用共聚焦激光扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）观测；②流式生物膜培养系统（Flow cell sys-tem）是研究生物膜最常用的模型之一，它采用了恒化器（Chemostat）的培养方式，通过匀速转动的动力泵以固定的流速向生物膜提供液体营养，流入的液体培养基首先经过排气装置（Bubble trap）后到达流动池（Flow cell），细胞在流动池中的3个流动管道（Flow channel）中生长，最后的废液以相同的流速排出；③高通量生物膜培养方法为了同时检测不同菌株形成生物膜的能力，高通量生物膜培养方法也应运而生。O’Tool等最早使用96孔板培养细菌生物膜，然后用结晶紫染色以进行定量分析，这种方法简单快速而且重复性好，因此被广泛应用；④生物膜的观测和标记方法最初采用电子显微镜来观察生物膜的结构，图像也有立体感。但电子显微镜要在真空条件下操作，样品需要脱水，制备过程繁琐，更重要的是脱水对生物膜样品的形态改变较大，而且生物膜无法继续培养，不能对其进行动态观察。与之相比，共聚焦激光扫描显微镜是研究生物膜的强有力工具，可以观察生物膜的三维结构，跟踪特定基因在生物膜中的表达情况，测定生物膜内细胞的代谢活性如图2所示。在细菌生物膜的研究中，荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）常被用来直接观察生物样品中细菌生物膜的形态，并且可以同时检测多种属细菌。例如，为了研究囊性纤维肺病病人呼吸道内细菌生物膜的生长情况，宋志军等用FISH方法对病人的痰液样品做了检测。他们使用了两种探针，一种是可以标记所有细菌的EUB探针，与绿色荧光团FITC偶联，另一种是特异性标记铜绿假单胞菌的PSEUDAER探针，与红色荧光团Cy3偶联；⑤焦磷酸测序（Pyrosequenc-ing）技术对于多种属细菌的混合感染，目前有的实验室已采用基于454高通量焦磷酸测序的技术，快速检测。但该套仪器设备昂贵，技术条件要求高。
图2共聚焦激光扫描显微镜照片
注：铜绿假单胞菌PAO1生长4d 生物膜经羧苄青霉素处理1d 后拍摄的共聚焦激光扫描显微镜照片A 显示了X-Y 轴，X-Z 轴（下）和Y-Z 轴（右）截面的照片，B 为复原的三维立体照片。图片由杨亮提供。
1．4．2
常用体内生物膜感染模型
体内生物膜感
染模型可以按照感染部位的器官系统分类；也可以按照生物膜是依托在宿主皮肤黏膜组织的表面形
成，
还是借助于置入宿主的生物材料表面形成来划分。目前以生物膜感染的部位和器官的情况将体内研究模型划分为以下几大类：①口腔牙菌斑生物膜模型
牙菌斑是典型的微生物生物膜结构形式。
牙科医师首先认识到龋齿的发病原因与生物膜形成相关，在体外采用人或动物牙齿感染细菌后，研究了物理或化学等因素对牙菌斑形成的影响。此外，牙周炎、口腔黏膜病等也涉及到生物膜的问题。国内华西口腔医学院等单位在这方面的研究成果及著作颇多；②呼吸系统生物膜感染的动物模型呼吸系统生物膜感染一般分为与导管插入相关的感染及慢性肺部细菌感染两种。导管插入相关的感染模型尝试着模仿与人工呼吸机相关的植入性导管引起的细菌生物膜肺炎，大多采用绵羊或猪等较大型的动物来制备；③泌尿系统生物膜感染动物模型导管相关性尿路感染（CAUTIs ）占医院内尿路感染的大多
数，CAUTIs 的主要病原体是大肠埃希菌和肠球菌。
Guiton 等改进和优化了与生物材料尿路感染相关的动物模型，模拟临床病人的导尿管置留情况；④感染性心内膜炎生物膜感染的动物模型
心内膜炎通常是随着心脏瓣膜的受损而继发了感染，在其表面形成了由血小板、纤维蛋白、微生物等组成的赘生物。感染性心内膜炎发生前通常有瓣膜的先天性缺陷、心脏搭桥手术、冠状动脉支架置入术，或由风湿热引起的自身免疫性损伤等导致心脏瓣膜的损坏。
目前引起感染性心内膜炎常见的微生物有葡萄球菌，链球菌和粪肠球菌（Enterococcus faecalis ），与此相关的生物膜感染的动物模型也被用于实验研究。大鼠感染性心内膜炎是比较常用的模型之一；⑤骨关节系统生物膜感染的动物模型
骨关节系统生物
膜感染包括化脓性关节炎及人工关节等生物材料引发的骨髓炎。骨髓感染的动物模型除了用一些大型的动物，如绵羊和山羊外，也用小型的啮齿类动物。
2
目前的研究热点
2．1
生物膜内微生物的相互作用及信号传递
微生物生物膜的形成和发展是一个动态易变的过程，不同微生物亚群在生物膜形成中，存在着复杂的相互作用和信号传递，以不断调整微生物自身的生理生化特性，从而决定了生物膜的特点及其稳定性。这些相互作用包括由微生物细胞表面结构（如菌毛、脂多糖等）、微生物分泌的大分子（如毒素，黏附蛋白等）、某些代谢产物或离子（如铁离子、钙离
子、
镁离子等）所介导的相互作用。也包括了生物膜细胞中的信号传递，如QS 、第二信使环鸟苷二磷
酸（Cylic diguanosine monophosphate ，
Cyclic-di-GMP ）等，这也是调控生物膜中微生物之间的相互作用以
及生物膜多样性的分子机制。目前，有关生物膜中的微生物相互作用及信号传递的研究还处于比较初级的阶段，结论大多来自于实验室的研究数据，如对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌等所形成生物膜的研究结果，还需要深入到复杂生物膜（如多种属细菌生物膜、环境微生物生物膜）的代谢组学研究
［13-17］
。
2．2生物膜中多菌种的相互作用
由多种属细菌混合形成的生物膜比由单一种属细菌形成的生物膜具有更为复杂的生理生化特性，遗传物质也能够在生物膜中的不同种属细菌之间转移，因此对生物膜菌的生理和功能都有重要的影响。为了更好地控制由生物膜引发的慢性感染，我们需要研究清楚在不同类型的慢性感染中细菌生物膜的一些特性，如细菌的组成，不同种属的细菌在生物膜中的空间分布、生长活性、代谢产物和生物膜中不同细菌之间的化学信号交流及相互作用等［18］。
不同种属细菌在生物膜中可以通过信号感应分子进行交流，诱导其他细菌表达特异性的基因。在囊性纤维化病人呼吸道中同时存在的铜绿假单胞菌和洋葱伯克菌就能通过密度信号感应分子交流，在体外流式生物膜系统中铜绿假单胞菌分泌的酰化高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserinelactone，AHL）能够激活洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）的密度信号感应系统相关基因的表达。
Egland等［19］报道了口腔细菌非典型韦荣菌（Veillonella atypica）和戈登链球菌（Streptococcus Gor-donii）在混合生物膜中培养时，能够通过一种细胞外信号分子来诱导后者淀粉酶编码基因amyB的表达。因此，如果干扰不同种属细菌在生物膜中的信号交流，就能够阻止某些细菌通过共生或互利的方式来形成致密的混合生物膜结构。
多种属细菌生物膜中的竞争效应会增加细菌之间的水平基因转移，在一定程度上会增加细菌从别的种属细菌获得耐药基因的概率。Roberts等［20］在口腔混合生物膜的研究模型中，证实了带有四环素抗性的Tn5397转座子能在共同培养24h后，从枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）转移到链球菌（Strepto-coccus）的基因组内。
2．3生物膜内细菌基因转移
生物膜内细菌的某些特定基因转移的规律及其影响因素目前还不清楚。在生物膜形成的早期，细菌释放的胞外DNA（eDNA）作为黏附素，可促进细胞与基质、细胞与细胞的连接，利于生物膜的形成；胞外DNA分子的存在对成熟生物膜起到稳定作用。在生物膜活跃生长期，细菌处于感受态时，胞外有大量DNA释放，有的是从死亡细菌释放出的DNA，都为DNA的转移提供了外在条件，使生物膜菌群基因的转化率提高．eDNA的其他作用还多，值得进一步研究。此外，通过噬菌体等进行细菌基因的转移，也有报道［21－23］。2．4干预微生物生物膜的形成
如果能在早期阻止人体器官内或医用生物材料表面形成生物膜，当然是最好的措施。
以细菌生物膜为靶点，关注与生物膜感染相关的医疗技术、护理操作、药物选择等环节，均是减少细菌生物膜感染的重要切入点。目前主要是通过抑制生物膜的形成和破坏已形成的生物膜两种方式来控制生物膜感染。
以干预铜绿假单胞菌的感染为例：铜绿假单胞菌生物膜对常用抗生素如氨基糖苷类，喹诺酮类，大环内酯类以及β-内酰胺类等药物治疗效果差。大环内酯类药物不具有杀菌作用，但能够通过抑制藻酸盐合成、QS系统自身诱导分子的合成以及Ⅲ型分泌系统等来达到抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成或破坏生物膜的结构［24-26］。虽然单独使用大环内酯类药物不能起到清除生物膜的作用，但是将它与环丙沙星联合应用，则能显著提高环丙沙星的清除生物膜能力。除抗生素外，在动物实验中证实，采用临床化痰药氨溴索，可以破坏生物膜中的藻酸盐，从而抑制铜绿假单胞菌形成生物膜的能力，或破坏已形成的生物膜。目前在改进植入性医疗装置的材料方面也有较多的研究，多集中在纳米材料方面，也有的对生物材料的表面进行金属离子处理。还有学者在探讨低频超声和高强度聚焦超声（（High-Intensity Focused Ultrasound，HIFU）干预生物膜的效果。研究认为，低频超声联合抗生素应用，可加强抗生素的杀菌作用。但也有研究认为低频超声可促进细菌生长。在体外模型中采用HIFU可杀灭生物膜中的细菌，而且能破坏生物膜的空间结构［27-31］。
抗菌药物的使用仍是控制生物膜感染最常用的手段，但随着细菌耐药性的增加，在研发有效的新型抗菌药物的同时，应用抗感染微生态制剂、海洋生物提取物、植物提取物、免疫制剂等生物活性物质控制细菌生物膜感染的研究也在广泛开展；氨溴索、金属螯合剂等传统化学药物逐渐受到临床医生的关注。以抗感染医用材料、超声、弱电流等为代表的物理手段在防治生物膜感染中取得了一定进展。此外，基因调控、酶、干扰细菌间的信号传递等生命科学前沿技术也开始运用在细菌生物膜研究领域。总之，关于细菌生物膜的干预多处于研究阶段，国内外有关生物膜相关感染的多中心大样本随机双盲对照临床干预研究报道均较少。
天然药物在防治细菌生物膜感染方面具有独特的优势。在体外试验中，赵今等［32］和Xu等［33］已证
明五倍子，蜂胶，茶多酚等对引起龋病的变异链球菌有拮抗作用。Song等［34-35］采用人参提取物或大蒜素来抑制生物膜的形成，也取得了较好的结果。国内学者可以在天然药物方面深入研究其作用机制，开发相关的抗微生物生物膜制剂。
2．5加强对真菌生物膜的研究
近年来伴随着癌症放疗，化疗和器官移植患者的增加，艾滋病人并发肺部真菌感染，免疫抑制剂应用，广谱抗生素的大量使用以及医用生物材料应用的增多等，真菌感染性疾病增加。如白色念珠菌病的发病率增加了近40倍，其中相当一部分与白色念珠菌生物膜的形成密切相关。在感染部位或植入体内的生物材料表面一旦形成了真菌生物膜，难以被抗真菌药物等彻底杀灭，且容易产生滞留菌（持留菌，Persister）［38］，故白色念珠菌生物膜引起的感染性疾病大都是慢性和难治性的。因此白色念珠菌生物膜逐渐成为许多学者关注的热点，
由于实验条件的限制，真菌生物膜的研究还处于起步阶段。已发表的研究显示，Pmt4蛋白对于真菌分泌蛋白和部分膜蛋白的修饰极其重要，缺乏pmt酶活性可导致菌株生长率下降、细胞壁不稳定甚至死亡。PMT基因对白念珠菌生物膜或新生隐球菌生物膜的形成及其生物膜菌的耐药性相关。由于这一基因编码的蛋白仅存在于真菌内，它与哺乳动物细胞内的类似酶在性质和催化作用上有着很大的区别，因此该基因有可能是药物作用靶点之一。由Julia Breger等［36-37］所建立的线虫体内研究模型和相关技术，可以借鉴。
3从医学扩展到其他学科领域的研究
对微生物生物膜的研究过去多局限在医学领域，其实在我们的日常生活中，在排水管、水罐、饮水器以及空调机冷却塔的管道中常常会形成不容易清除的微生物生物膜，也构成了多种病原菌生存的理想环境。需要我们从多个角度来思考微生物生物膜的问题。
目前在环境保护、畜牧业、食品工业等领域，有关微生物生物膜的基本理论和技术，也得到了极大的重视和应用。利用微生物生物膜原理和工程技术，对地表水或污水进行无害化处理，为人类造福，也是当今的研究热点之一。2011年10月，国际水协会2011年生物膜技术大会（IWA Biofilm2011 Conference：Processes in Biofilm）在我国同济大学举行，会议主要议题包括了生物膜的研究方法、生物膜微生物群落结构与功能、胞外聚合物组成分析及环境因素影响、生物污染控制以及生物膜技术在环境工程中的应用，反映了当今该领域的发展趋势。
已有的资料表明：在污水管道的内表面存在着大量微生物。在有氧条件下，污水中的微生物能够黏附到所接触的管道表面，这些微生物往往被包埋在细胞外化合物基质中，称之为下水道生物膜。Lemmer等［39］和Boeije等［40］发现下水道生物膜所显示的种群密度和生物活性都是高活性的生物群落，与浮游微生物相比，在生物膜内的微生物能够更好地处理如重金属之类的毒性物质。由于城市污水管道的管径大，管道长，污水在其中有相当长的滞留时间，而下水道中污染物质降解主要是通过管壁上附着的下水道生物膜来完成。如果能够采用适当的技术措施增加管道内的微生物量和溶解氧的浓度，促进下水道管壁微生物生物膜的形成及其功能，那么借助下水道管壁空间来处理污水也是一种好方法。
此外，应用生物膜技术，在地表水的净化修复中也显示了良好的前景。采用天然材料（如砾石、卵石等）或人工合成材料（如人工生物材料、合成纤维等）作为载体，使大量微生物黏附在载体表面，通过与污水接触，生物膜内的微生物可摄取污水中的有机物作为营养，从而使污水得到净化。由于载体的表面积大，可黏附着大量微生物，因此对污染物的降解能力很强。人工生物膜技术是生物-生态联合修复的主要技术之一。在日本、韩国等少数地区已经得到了成功应用，这为我们开展地表污染水体的修复及污水治理提供了借鉴。随着我国国民环境保护意识的加强以及环境污染治理技术的提升，微生物生物膜技术等生态修复技术将被广泛应用。
在食品加工行业，相关的食品加工设备的表面、排水管道内部以及食品的保存等，也涉及到对微生物生物膜的干预和清除的问题，需要人们去解决。
4结语
微生物生物膜广泛分布在自然界，与人类的健康和日常生活密切相关。虽然我们已经开始了对微生物生物膜的关注，也发表了较多的检测细菌生物膜的文章，但还有很多深层次的问题仍需继续去探索和解决。在建立规范的检测方法和技术的基础上，应继续加强基础研究和探讨临床实际工作中防治生物膜病的手段。此外，由于微生物生物膜的研究和应用涉及到多学科交叉，诸如医药卫生、生物工
程材料、环境保护、食品工业和污水处理等领域，我们如果能够通过跨学科的学术交流和资源的综合利用，就有可能发现新的研究课题或新学科生长点，促进我们开展更多的创新性研究。
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（本文编辑：王棣）
专家简介：
贾文祥，四川大学华西医学中心教授，博士生导师。四川省学术和技术带头人。西藏大学特聘教授。
四川省微生物学会副理事长，兼任医学微生物学专委会主任；中华医学会医学病毒学分会常务委员。中华医学会医疗事故技术鉴定（临床医学检验）专家。
中华微生物学和免疫学杂志编委；中国抗生素杂志编委；微生物学与免疫学进展杂志编委；中华检验医学杂志编审专家。
著述：
担任全国高等医药院校八年制和七年制临床医学等专业规划教材《医学微生物学》的主编；先后主编了六本国家级医学专业教材。
主要研究方向：
病毒、细菌等病原生物的治病机制和耐药研究；
血液制品工艺中病毒灭活的研究；
抗病原微生物感染（细菌、病毒、真菌等）；
抗感染免疫；新型疫苗和药物的研究。
曾主持的科研课题：
可降解的高分子生物材料在医学中的应用，国家973项目子课题（2000．12－2005．12）；
绿脓杆菌生物被膜耐药机制的研究，CMB基金资助（2002．8－2005．8）；
绿脓杆菌耐药生物被膜形成的机制及其蛋白质组学研究，国家自然科学基金资助（2004．1－2006．12）；
西藏扎囊县菌痢的分子流行病学及其痢疾杆菌的耐药机制，西藏自治区科技厅基金资助（2003．7－2006．12）；
西藏藏药紫金标抗病毒的药效学研究，西藏自治区科技厅基金资助（2003．7－2006．12）。
获奖：
2004年被评为四川省卫生厅学术和技术带头人（卫生科学技术病原生物学）；
2005年被评为四川省学术和技术带头人；
2006获得全国宝钢教育基金优秀教师奖。